專利名稱：提高肌苷產量的促進劑及其添加方法
技術領域：
本發明涉及肌苷，特別涉及提高肌苷產量的促進劑及其添加方法。
背景技術：
肌苷，英文為Inosine，又稱之為次黃嘌呤核苷，是次黃嘌呤與核糖的縮合物，其化學名稱為9- β -D-呋喃核糖次黃嘌呤。其中，在次黃嘌呤堿基Ν-9的位置上，通過糖苷鍵的形式聯結了以呋喃形式存在的核糖的第I位碳原子。肌苷的分子式為CltlH12N4O5，相對分子質量為268. 23。常見的肌苷為白色針狀結晶或呈無水粉末狀固體，無臭略帶苦味，常溫常壓下熔點為218°C，易溶于水，20°C時在水中的溶解度約為2. 065，在飽和水溶液中約含肌苷15 g/L ;也易溶于稀鹽酸或氫氧化鈉，微溶于乙醇，不溶于氯仿。肌苷在食品和醫藥領域有著非常廣泛的應用價值。在食品領域中，肌苷是食品中美味的呈味物，其含量常常作為衡量食品新鮮度的特征指標之一。肌苷是各種調味食品，例如味精、醬油等的營養助鮮劑，同時也是食品工業中有效增鮮劑5’ -肌苷酸、呈味核苷酸二鈉的主要原料之一。在醫藥領域中，肌苷可以直接透過細胞膜，是一種細胞復活劑，具有刺激細胞、增強細胞代謝等功能。醫學上通常用于預防和治療心臟和肝臟等器官的細胞損傷，有助于肝功能恢復正常，并能預防及解除由血防藥物引起的對心臟或肝臟的副作用，是治療冠心病、肝炎、白血球減少癥等的良效藥物。由于其毒副作用小而且安全性較好，同時也是抗生素生產的原料。此外，異丙肌苷是一種正在開發的肌苷衍生物，除具有抗病毒、增強記憶作用外，還具有延緩衰老的功能。肌苷的生產方法基本上可以分為3大類化學分解法、酶解法以及微生物發酵法。化學合成法生產肌苷設備條件要求較高，合成肌苷工藝比較復雜，而且由于大量使用有機溶劑，造成嚴重的環境污染，因而被限制投入生產。酶解法由于生產成本較高且造成一定程度的資源浪費，影響其在肌苷工業的大規模生產。微生物發酵法生產肌苷的成本較低，對環境無污染且效益較高，因此，微生物發酵法是目前生產肌苷的主要采用方法。近年來，隨著韓國、日本等國家肌苷產業的不斷發展，對我國肌苷市場形成了巨大的沖擊，國內肌苷發酵產業所面臨的挑戰日益嚴峻。因此，優化肌苷發酵方法，提高肌苷得率，降低生產成本，進而提升我國肌苷的市場競爭力，成為肌苷發酵行業亟待解決的問題。目前嘗試了很多提高肌苷產量的方法，主要包括菌種選育、基因工程改造、發酵條件的優化等等。此外，由添加促進劑引起的代謝流遷移也可以為肌苷產量的提高提供了一條新思路。工業生產上通常采用枯草芽孢桿菌發酵法生產肌苷，添加促進劑來改進肌苷發酵的方法成為了熱門課題。至今已被研究的促進劑不多，如檸檬酸鈉，葡萄糖酸鈣等，但關于促進劑的組合添加方面仍沒有報道。

發明內容
本發明目的在于提供提高肌苷產量的促進劑及其添加方法。所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物中至少一種次黃嘌呤，NaF, CaCl2,葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物中至少二種次黃嘌呤，NaF, CaCl2,葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物中至少三種次黃嘌呤，NaF, CaCl2,葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物中至少四種次黃嘌呤，NaF, CaCl2,葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物次黃嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。所述提高肌苷產量的促進劑在培養基中的濃度為次黃嘌呤為O. 15%，NaF 2 mg/L, CaCl2 10 mg/L，葡萄糖酸I丐15 g/L，朽1檬酸鈉3 g/L。 所述提高肌苷產量的促進劑的添加方法包括將提高肌苷產量的促進劑加入培養基中，用含有該促進劑的培養基發酵培養枯草芽孢桿菌，從而生產肌苷。所述培養基為適宜枯草芽孢桿菌生長的常規培養基。本發明采用在培養基中添加不同的促進劑(檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈣、氟化鈉、次黃嘌呤及氯化鈣)來提高枯草芽孢桿菌發酵生產的肌苷產量。本發明發現組合添加不同的促進劑時，肌苷產量會比單一添加促進劑時的肌苷產量高。由于不同的促進劑對肌苷合成的作用機理不同，不同的促進劑間存在著優勢互補和相互促進作用，組合添加時會呈現出疊加效應。本發明提出添加促進劑來改善肌苷產量的方法，組合添加比單一添加促進劑時更易引發枯草芽孢桿菌內代謝流的遷移，尤其當同時添加O. 15%的次黃嘌呤、2 mg/L的氟化鈉、10 mg/L的氯化鈣及15 g/L的葡萄糖酸鈣時，肌苷產量達到了 14.01 g/L，是對照組肌苷產量的4. 39倍。本發的提高了枯草芽孢桿菌生產肌苷的產率，降低肌苷單位生產成本，增強肌苷在市場上的競爭力。


圖I為檸檬酸鈉對肌苷積累的影響。在圖I中，橫坐標檸檬酸鈉濃度，單位為g/L，左縱坐標為肌苷產量，單位為g/L，右縱坐標為生物量，以發酵液在600 nm處的吸光度(OD600)表示，曲線▲為肌苷產量，曲線 為生物量。圖2為葡萄糖酸鈣對肌苷積累的影響。在圖2中，橫坐標葡萄糖酸鈣濃度，單位為g/L，左縱坐標為肌苷產量，單位為g/L，右縱坐標為生物量，以發酵液在600 nm處的吸光度(OD600)表示，曲線▲為肌苷產量，曲線 為生物量。圖3為NaF添加對肌苷發酵的影響。在圖3中，橫坐標NaF濃度，單位為mg/L，左縱坐標為肌苷產量，單位為g/L，右縱坐標為生物量，以發酵液在600 nm處的吸光度(0D_)表示，曲線▲為肌苷產量，曲線 為生物量。圖4為次黃嘌呤的添加對肌苷發酵的影響。在圖4中，橫坐標次黃嘌呤濃度(％)，左縱坐標為肌苷產量，單位為g/L，右縱坐標為生物量，以發酵液在600 nm處的吸光度(0D_)表示，曲線▲為肌苷產量，曲線 為生物量。圖5為CaCl2的添加對肌苷發酵的影響。在圖5中，橫坐標CaCl2濃度，單位為mg/L，左縱坐標為肌苷產量，單位為g/L，右縱坐標為生物量，以發酵液在600 nm處的吸光度(OD600)表示，曲線▲為肌苷產量，曲線 為生物量。圖6為不同種類的促進劑對肌苷發酵的影響圖。在圖6中，橫坐標為促進劑的不同組合，其含義分別為A.空白，B. 2 mg/L NaF,C. O. 15%次黃嘌呤，D. 2 mg/L NaF +0. 15%次黃嘌呤，E. O. 15%次黃嘌呤+2 mg/L NaF+15 g/L葡萄糖酸鈣；F. O. 15%次黃嘌呤+2 mg/L NaF+10 mg/L CaCl2+15 g/L 葡萄糖酸鈣；G. O. 15% 次黃嘌呤+2 mg/L NaF+3 g/L 檸檬酸鈉+15 g/L葡萄糖酸|丐+10 mg/L CaCl2 ;左縱坐標為相對肌苷產量(％),右縱坐標為相對蛋白和核酸產量，a為相對肌苷產量，b為相對蛋白含量，c為相對核酸含量。
具體實施例方式為使本領域的技術人員能進一步了解本發明，下面列舉本發明實施例，并配合說明書附圖，詳細說明本發明的技術方案。需強調的這些較佳實施例并非本發明技術方案所有可能實施方式的窮舉，故不用于限制本發明的保護范圍。I.材料
1.1菌種
枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is)，所述枯草芽抱桿菌(Jiac i I Ius購自
中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)，編號為 CICC20201、CICC20943、CICC20944、CICC20947、CICC20958 中的一種或幾種。本實施例優選CICC20958 ;
1.2培養基
(1)斜面培養基
蛋白胨 1.0 g，牛肉膏 O. 3 g, NaCl 0.5 g，瓊脂 2 g，水 100 mL，pH 7.2 ；
(2)種子培養基(g/L)
葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉15，玉米漿12，NaCl 2. 5，尿素2，pH 7.2;
(3)搖瓶發酵初始培養基(g/L)
葡萄糖 140，玉米漿 16，酵母粉 15，尿素 13，(NH4)2SO4 22，MgSO4 ·7Η20 2，K2HPO4 5，CaCO320 (分消),pH 7. O ；
(4)搖瓶發酵培養基(g/L)
葡萄糖 140，玉米漿 15，酵母膏 17，尿素 15，(NH4)2SO4 20，MgSO4 ·7Η20 I，K2HPO4 5，CaCO320 (分消),pH 7. O ；
2. 方法
2. I.菌種活化
將保存的菌種接種于斜面培養基上，37 1恒溫培養18 h ；
2.2液體種子培養
從活化18 h的斜面上取一環菌種轉接到裝有25 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，220 r/min, 34 °C培養 18 h ；
2.3液體發酵培養
取培養18 h的新鮮種子液，以5%接種量接入裝有35 mL培養基的250 mL三角瓶中，220 r/min，34°C 培養 96 h ；
2.4測定方法2. 4. I生物量的測定；
取O. 2 mL的發酵液用蒸餾水稀釋30倍，蒸餾水作空白，用分光光度計在660 nm波長處測定其吸光度值；
2. 4. 2肌苷產量的測定
利用高效液相色譜法(HPLC法)進行測定；
2.4.3殘糖濃度的測定
取發酵液樣品3500 r/min離心5 min,將上清液逐級稀釋后取ImL,加入3 mL的DNS (3，5-二硝基水楊酸)試劑，沸水浴煮沸15 min顯色，取出立即冷卻，再用蒸餾水稀釋至
25mL，于520 nm波長處測其吸光度值。樣品糖濃度可從葡萄糖標準曲線計算可得；
2. 4. 4氨基氮濃度的測定
采用甲醛滴定法取一定體積的發酵液，離心后取上清，用O. 05 mol/L的NaOH標準溶液滴定PH值為8. 2，然后加入適當的甲醛溶液，混勻后繼續用O. 05 mol/L的NaOH標準溶液滴定PH值為9. 2，記錄所用NaOH溶液體積；
2.4.5蛋白質濃度的測定
采用考馬斯亮蘭法取一定體積的發酵液，先經過離心得到菌體，然后洗滌菌體，破壁后得到一定體積的裂解液，適當稀釋后加入考馬斯亮藍，利用分光光度計在595 nm下測其吸光度值；
2. 4. 6核酸濃度的測定
采用三氯乙酸抽提法取一定體積的發酵液，離心后棄去上清，在沉淀中加入三氯乙酸充分攪拌，再離心除去上清；重復操作，沉淀加入三氯乙酸充分攪拌，并在80 1水浴中攪拌抽提，冷卻后再經過離心棄去沉淀，上清液用5%三氯乙酸(TCA)適當稀釋，利用核酸蛋白快速測定儀測定其核酸濃度；
2.. 5數據分析方法
所有數據采用統計學軟件SPSS 17. O進行差異顯著性分析(顯著水平a=0. 05)；
3結果與分析
3.I單一促進劑的選擇及對肌苷發酵的影響；
采用枯草芽孢桿菌；在發酵培養基中添加不同的促進劑；搖瓶培養條件為34°C，25mL/250 mL三角瓶，220 r/min, 96 h。實驗結果及對比情況見下圖I-圖3 ;
從圖I可知，添加適量的檸檬酸鈉對枯草芽孢桿菌生物量、肌苷產量均有一定的提高作用，其中當添加量為3 g/L時，肌苷的發酵產量比對照組增加13.9%。從圖2可以看出，添加適量的葡萄糖酸鈣對枯草芽孢桿菌生物量、肌苷產量也有明顯的提高作用，其中當添加量為15 g/L時，肌苷發酵產量比對照組增加27.8%。添加檸檬酸鈉和葡萄糖酸鈣能提高枯草芽孢桿菌生產肌苷的機理，是由于抑制了 EMP途徑而增大HMP途徑引發代謝流遷移造成的結果；
根據類似的調節機理，除了以上兩種促進劑以外，NaF、次黃嘌呤和CaCl2的添加對肌苷的積累也有顯著的影響(見圖3-圖5);
從圖3可知，適量的添加NaF對肌苷產量具有顯著的提高作用，當添加2 mg/L時，肌苷 產量比對照組提高了 23. 9% ;但過量的NaF會對枯草芽孢桿菌的生物量有較強的抑制作用。這可能是由于NaF是EMP途徑的強烈抑制劑，EMP途徑的抑制將導致代謝流在EMP，HMP途徑和TCA循環之間的重新分配，故由此引發的代謝流遷移導致了肌苷合成途徑代謝通量的增大，從而提高了肌苷產量；
由圖4可知，添加適量的次黃嘌呤對枯草芽孢桿菌的生長沒有明顯的促進作用，但對肌苷產量的積累卻又顯著地提高作用，尤其當添加O. 15%次黃嘌呤時，肌苷產量比對照組提高了 89. 9%，這與次黃嘌呤是肌苷合成途徑的前體物質有關。加入的次黃嘌呤為枯草芽孢桿菌提供了完整的嘌呤環，從而使得枯草芽孢桿菌便于通過補救途徑大量合成肌苷；
此外，添加不同濃度的CaClj^肌苷的積累也有一定的影響(見圖5。從圖5可知，適量添加氯化鈣對枯草芽孢桿菌的生長以及肌苷的積累均有一定的促進作用。其中，當添加5mg/L的CaCl2時，生物量可以達到最大值；而當加入10 mg/L的CaCl2時，肌苷產量達到最大值，比對照組的肌苷產量高出了 23. 1%。這主要是因為CaCl2的添加可以提高5'-核苷酸酶的活力，而5'-核苷酸酶是肌苷合成途徑中的關鍵酶，5'-核苷酸酶活力的增加有助于肌苷的積累，因此CaCl2的適量添加可以提高肌苷的產量；
3.2兩種有效促進劑的復合添加對肌苷發酵的影響
根據上述實驗，申請人選擇了檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈣、NaF、次黃嘌呤、CaCl2這五種對肌苷積累有顯著促進作用的有效促進劑。但由于不同的促進劑對肌苷積累的促進作用不同，復合添加不同組合的促進劑時也許存在著疊加效應，所以復合添加不同組合的促進劑時也許比添加單一的促進劑對肌苷產量的積累會有更明顯的促進作用。兩種不同組合的促進劑對肌苷積累的影響見表I ;
表I兩種不同組合的有效促進劑的添加對肌苷積累的影響
權利要求
1.提高肌苷產量的促進劑，其特征在于，所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物中至少一種次黃嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。
2.如權利要求I所述提高肌苷產量的促進劑，其特征在于，所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物中至少二種次黃嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。
3.如權利要求I所述提高肌苷產量的促進劑，其特征在于，所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物中至少三種次黃嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。
4.如權利要求I所述提高肌苷產量的促進劑，其特征在于，所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物中至少四種次黃嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。
5.如權利要求I所述提高肌苷產量的促進劑，其特征在于，所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物次黃嘌呤，NaF, CaCl2，葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。
6.如權利要求I至5任一項所述的提高肌苷產量的促進劑，其特征在于，所述提高肌苷產量的促進劑在培養基中的濃度為次黃嘌呤為0. 15%，NaF 2 mg/L, CaCl2 10 mg/L，葡萄糖酸鈣15 g/L，檸檬酸鈉3 g/L。
7.提高肌苷產量的促進劑的添加方法，其特征在于包括將提高肌苷產量的促進劑加入培養基中，用含有該促進劑的培養基發酵培養枯草芽孢桿菌，生產肌苷。
全文摘要
提高肌苷產量的促進劑及其添加方法，涉及肌苷，提供提高肌苷產量的促進劑及其添加方法。所述提高肌苷產量的促進劑包括如下化合物中至少一種次黃嘌呤，NaF，CaCl2，葡萄糖酸鈣，檸檬酸鈉。所述提高肌苷產量的促進劑在培養基中的濃度為次黃嘌呤為0.15%，NaF2mg/L，CaCl210mg/L，葡萄糖酸鈣15g/L，檸檬酸鈉3g/L。本發明采用在培養基中添加不同的促進劑來提高枯草芽孢桿菌發酵生產的肌苷產量。本發明提高了枯草芽孢桿菌生產肌苷的產率，降低肌苷單位生產成本，增強肌苷在市場上的競爭力。
文檔編號C12R1/125GK102796788SQ20121028334
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月10日 優先權日2012年8月10日
發明者肖安風, 蔡慧農, 倪輝, 楊尚彤, 李利君, 楊遠帆, 黃高凌, 杜希萍 申請人:集美大學