專利名稱：一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶及其結晶方法
技術領域：
本發明涉及DNA重組技術和蛋白質技術領域，特別是涉及一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶及其結晶方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,簡稱S0D)作為一種廣泛存在于生物體細胞內，具有防御氧化損傷作用的金屬酶，與機體衰老、腫瘤發生、自身免疫性疾病和輻射防護等有關，且在醫藥、保健品、食品添加劑和化妝品等領域均具有重要的應用價值。SOD廣泛存在于生物界，最初生產的SOD的原料也是動物血，但是此來源提純的工藝繁瑣，操作困難，且得到的產品活性低，純度也低。利用基因工程技術，許多熱穩定性較好
的SOD成功地在常溫宿主內進行了大量表達，從而大幅度降低了生產成本，擴展了生產應用。蛋白質在體外較難保持其生物學活性的完整性，然而以晶體結構存在的蛋白質一般活性都是比較穩定的。收集和分析X射線衍射蛋白質晶體的數據，就能解析出該蛋白質的高級結構。本發明所述的方法是該種耐高溫鐵超氧化物歧化酶的首次結晶，國內外均無報道。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶及其結晶方法。為達到上述目的，本發明提供一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶，其氨基酸序列如SEQID NO 2 所示。為達到上述目的，本發明提供一種上述耐高溫鐵超氧化物歧化酶的結晶方法，所述方法通過構建重組載體pET-28a-FeS0D并導入大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導表達獲得重組目的蛋白，再利用親和層析和離子交換層析的方法純化該重組目的蛋白，然后通過結晶試劑盒篩選重組目的蛋白的結晶條件，即可得到耐高溫鐵超氧化物歧化酶的蛋白晶體。上述方法包括以下步驟
(a)通過設計引物，以嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus)基因組DNA為模板，由PCR擴增方法獲取耐高溫FeSOD基因，其堿基序列如SEQ ID NO : I所示；
(b)將步驟(a)所得耐高溫FeSOD基因連接到pET28a載體上，構建重組表達載體pET-28a-FeS0D，并導入大腸桿菌BL21 (DE3)中，誘導表達獲得大量重組目的蛋白；
(c)將步驟(b)得到的重組目的蛋白上清通過O.45 μ m纖維素膜過濾，然后利用Ni柱親和層析法和離子交換層析法純化重組目的蛋白，得到純度達到95%以上的重組目的蛋白(具有極高的耐熱性，耐熱溫度可達90°C );
(d)將將步驟(c)純化后的重組目的蛋白進行濃縮，用BCA法蛋白定量試劑盒來測定重組目的蛋白濃度，當濃度達到5-8mg/ml時,用蛋白質結晶試劑盒來篩選結晶條件,得到蛋白晶體；(e)將將步驟(d)形成的蛋白晶體，利用顯微鏡以及X射線晶體衍射儀進行鑒定。優選地，其中所述步驟(b)的具體操作為將步驟(a)所得耐高溫FeSOD基因經Nde I和EcoR I雙酶切后，連接到經同樣處理的pET28a載體上，構建重組表達載體pET-28a-FeS0D,將重組載體pET-28a_FeS0D導入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得基因重組工程菌E. Co I i/pET-28a-FeS0D，將重組基因工程菌于37 °C、220rpm下培養至0D600為O. 6時，力口入誘導劑IPTG至終濃度為ImM，繼續培養3-5個小時，收集菌液，獲得大量重組目的蛋白。優選地,其中所述步驟(d)的蛋白質結晶試劑盒購自Hampton Research公司，結晶條件為 Index HR2-14461、Index HR2-144 63、Index HR2-144 87、Index HR2-14488、Index HR2-14494、PEG/lon2 Screen HR2-0985、PEG/lon2 Screen HR2-0987、PEG/lon2 Screen HR2-09813、PEG/lon2 Screen HR2-09819、CrystalScreen2 HR2-11248。本發明具有以下有益效果本發明所提供的結晶方法流程簡單，且獲得的晶體分 辨率高，為研究該種蛋白質的三維結構和功能提供重要的條件。


圖I是耐高溫鐵超氧化物歧化酶的誘導表達圖；M :低分子質量蛋白質標準；1 :只含pET28a載體的重組菌誘導；2 :未誘導重組菌；3 ;誘導后重組菌；
圖2是耐高鐵超氧化物歧化酶純化后的電泳分析圖；M :低分子質量蛋白質標準；1 :誘導表達后的大腸桿囷超聲破碎后上清溶液；2 :純化后的目的蛋白；
圖3 A是耐高溫鐵超氧化物歧化酶的一級鑒定質譜 圖3 B是耐高溫鐵超氧化物歧化酶的二級鑒定質譜 圖4是可見光下耐高溫鐵超氧化物歧化酶的晶體 圖5是紫外光照射下耐高溫鐵超氧化物歧化酶的晶體 圖6是耐高溫鐵超氧化物歧化酶晶體的X射線衍射圖。
具體實施例方式應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的發明。除非另有說明，本文使用的所有科學和技術術語具有與本發明所屬技術領域人員通常理解的相同含義，本說明書中未注明具體條件的實驗方法是按常規實驗方法；本說明書中所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品，各種試劑和培養基的成分和配制方法可參見常規實驗手冊中的操作。下面結合實施例詳細闡述本發明的具體內容。實施例I :耐高溫FeSOD基因的獲得
為了去除基因中的內含子，根據NCBI上P. vivax Sail的序列(基因登錄號HM992934. I)設計兩對引物。上游引物5’ -TTACATATGCGTGGGGCAAGCACGGA-3 ’
下游引物5’ -GCGAATTCTTAAAACGGCTGCCAACG-3’
以嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus)基因組DNA(中國農業科學院贈送)為模板，進行PCR擴增，具體程序和反應體系如下
權利要求
1.一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.—種權利要求I所述耐高溫鐵超氧化物歧化酶的結晶方法，其特征在于，所述方法通過基因重組技術構建重組載體pET-28a-FeS0D并導入大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導表達獲得重組目的蛋白，再利用親和層析和離子交換層析的方法純化該重組目的蛋白，然后通過結晶試劑盒篩選重組目的蛋白的結晶條件，即可得到耐高溫鐵超氧化物歧化酶的蛋白晶體。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (a)通過設計引物，以嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus)基因組DNA為模板，由PCR擴增方法獲取耐高溫FeSOD基因，其堿基序列如SEQ ID NO : I所示； (b)將步驟(a)所得耐高溫FeSOD基因連接到pET28a載體上，構建重組表達載體pET-28a-FeS0D，并導入大腸桿菌BL21 (DE3)中，誘導表達獲得大量重組目的蛋白； (c)將步驟(b)得到的重組目的蛋白上清通過O.45 μ m纖維素膜過濾，然后利用Ni柱親和層析法和離子交換層析法純化重組目的蛋白，得到純度達到95%以上的重組目的蛋白； (d)將將步驟(c)純化后的重組目的蛋白進行濃縮，用BCA法蛋白定量試劑盒來測定重組目的蛋白濃度，當濃度達到5-8mg/ml時,用蛋白質結晶試劑盒來篩選結晶條件,得到蛋白晶體； (e)將將步驟(d)形成的蛋白晶體，利用顯微鏡以及X射線晶體衍射儀進行鑒定。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)的具體操作為將步驟(a)所得耐高溫FeSOD基因經Nde I和EcoR I雙酶切后，連接到經同樣處理的pET28a載體上，構建重組表達載體pET-28a-FeS0D，將重組載體pET-28a_FeS0D導入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得基因重組工程菌E. coli/pET-28a-FeS0D，將重組基因工程菌于37°C、220rpm下培養至0D600為O. 6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為ImM，繼續培養3_5個小時，收集菌液，獲得大量重組目的蛋白。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)的蛋白質結晶試劑盒購自Hampton Research 公司，結晶條件為 Index HR2-14461、Index HR2-144 63、Index HR2-144 87、Index HR2-14488、Index HR2_14494、PEG/lon2 Screen HR2_0985、PEG/lon2 Screen HR2_0987、PEG/lon2 Screen HR2_09813、PEG/lon2 Screen HR2-09819、Crystal Screen2 HR2-11248。
全文摘要
本發明涉及一種耐高溫鐵超氧化物歧化酶及其結晶方法。本發明利用基因重組技術將耐高溫FeSOD基因構建到載體pET28a上，通過將重組載體pET-28a-FeSOD導入大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達，利用親和層析和離子交換層析的方法純化重組目的蛋白，得到純度達到95%以上的目的蛋白，再通過結晶試劑盒篩選目的蛋白的結晶條件，得到蛋白晶體。本發明所提供的結晶方法流程簡單，且獲得的晶體分辨率高。
文檔編號C12N9/02GK102816747SQ20121028497
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月6日 優先權日2012年8月6日
發明者張耀洲, 吳少峰, 張麗, 陳劍清, 舒特俊 申請人:天津耀宇生物技術有限公司