專利名稱：用于提取植物胚的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用流體用于從植物中提取組織的方法和裝置。該流體包括但不限于液體或氣體。更確切地說，該方法和裝置是涉及從種核或種子中分離胚。更具體地說，該方法和裝置對于從單子葉植物種子例如作物種子(像小麥、大麥、燕麥、玉米、稻、草，等)中生產分離的胚或部分完整的胚是有用的。然而更具體地說，該方法和裝置對于生產分離的胚是有用的，這些胚形成植物、它們的子代，和種子。甚至更具體地說，該方法和裝置對于生產分離的胚是有用的，這些胚發育成轉化的植物、它們的子代，和種子。該方法和裝置對于從玉米種子中提取未成熟胚是特別有用的。
背景技術：
在研發玉米和其他單子葉植物中，手工提取胚仍然是最經常使用的。用于切除玉米不成熟胚的標準慣例涉及手工提取，一次一個胚。更確切地說，切開并且去除核冠從而露出胚乳組織。使用一種小型儀器例如一種金屬手術刀將胚乳組織移到一邊并且因此使玉米胚可見并且易于從該種核中取出。這是很慢的過程要求相當的手-眼協調性以及靈巧性從而完全切除有活力的胚。通過使用一種抽吸裝置已經有了向這種胚的提取過程機械化的一些改變，該抽吸裝置用于從每個種子單個地吸取胚。該過程的機械化受到玉米胚的易碎性所妨礙。自動化該胚切除過程的一次嘗試描述于孟山都專利美國專利號7，150,993中，該專利披露了使用真空的方法用一臺真空吸氣器從每一個單獨的種核切除未成熟的玉米胚。盡管這個系統適合于比用手工進行的手術刀的速度稍微增加胚切除的速度，它仍然是非常慢并且乏味的切除過程。對于以對胚完全不產生傷害的方式來切除胚的更快并且更有效的方法仍然存在著一種需要。發明概述
本發明涉及用于取出(removing)或分離(displacing)目標植物組織的多種方法和裝置。本發明的這些方法和裝置可以用于任何感興趣的單子葉植物。優選的單子葉植物包括，但不限于禾本科的成員，包括草類例如草坪草以及谷物作物，例如玉米(玉蜀黍)、小麥、和稻。特別地優選的單子葉植物包括玉蜀黍種，包括玉米(corn)(玉蜀黍),玉米具有通常在玉米穗上成排放置的多個種核(種子)。在一個實施方案中，該目標植物組織是胚。該胚可能是成熟的，未成熟的，完整的，部分完整的胚或完整的和部分完整的胚的一種混合物。在另一個實施方案中，該方法和裝置對于從玉米的穗中取出未成熟的玉米胚是有用的。在另一個實施方案中，該取出的胚可以用于植物組織培養或遺傳轉化。本發明還涉及多種方法和裝置，這些方法和裝置可以用于大量分離單子葉植物胚，例如玉米胚。這些大量分離出的胚可以用于遺傳轉化或組織培養。在此披露的這些方法和裝置對于高通量處理(例如大量地分離大量的目標組織和/或處理大量的種子)是有用的。在另一個實施方案中，本發明涉及用于從種子中分離胚的一種裝置，包括用于種子的夾持器，用于生成流體流的裝置，以及用于將該流體流導向玉米種子的噴嘴，其中該噴嘴連接到該生成流體的裝置上。該流體包括但不限于液體、氣體、或液體和氣體的組合。可以通過任何數目的手段生成該流體流，這些裝置包括但不限于泵，壓縮機，氣壓系統和液壓系統。在另一個實施方案中，該裝置可以包含在外殼內。這可以有助于希望的物質的收集并且在種子物質接觸該流體流之后，減少種子物質的飛濺。在又一個實施方案中，感興趣的種子可以包含在外殼內。該流可以具有一種流體包括但不限于一種氣體或空氣。在另一個實施方案中，該種子可以位于植物上，在植物中或從該植物取出。例如，如果該種子是玉米種子，該種子可以位于玉米穗上，或它可以從該玉米穗上取出。玉米穗上的種子可以在該裝置中的夾持器上支撐從而使單個的種子更穩定并且使之可接觸該流體流。在又一個實施方案中，本發明的裝置可以適配為從大量的種子中分離目標植物組織。該裝置對于玉米穗是有用的，因為該裝置的噴嘴將流體流同時導向許多玉米種子。本發明的這些方法和裝置提供了去除目標植物組織(包括但不限于胚)的一種有效率的、快速的并且有效的機理。在又一個實施方案中，該夾持器和噴嘴以及該裝置的噴嘴彼此相對移動以便將流體流導向在不同位置的多個種子。在又一個實施方案中，該夾持器可以固定到位并且該噴嘴可以相對于該夾持器移動。在又一個實施方案中，該噴嘴可以固定到位并且該夾持器相對于該噴嘴移動。在又一個實施方案中，該裝置包含用于收集分離的胚的收集裝置。該收集裝置可以是容器，該容器可以收集未成熟的、成熟的或半成熟的胚和/或其他種子內物質。這些胚可以是單倍體或雙單倍體的玉米胚。在本發明的另一個實施方案中，包含一種方法，該方法用于從由玉米種子中分離的胚培育植物的一種方法，包括大致同時地從玉米種子分離多個玉米胚，收集這些分離出的玉米胚，鑒別所希望的胚，并且，將這些胚再生從而形成植物。這種方法可以包括用標志物或通過DNA提取或通過選擇試劑測試所希望的胚的步驟。
該發明還涉及一種方法，該方法包括提供含有目標植物材料的單子葉植物種子(該種子在該種子的果皮或種皮上具有開口)，從種子中分離目標植物材料，并且收集分離出的目標植物材料。在又一個實施方案中，本發明涉及一種方法，該方法包括從一種種子中分離目標植物材料，并且收集分離的目標植物材料。該方法適合于快速分離大量的胚包括但不限于完整的胚和部分完整的胚。通過使胚早萌發從而發育成植物可以繁殖這些胚。在另一個實施方案中，該繁殖可以是用于從胚的盾片生產胚性愈傷組織，然后可以將該愈傷組織再生成植物，該植物可以是能生育的，并且用于生產下一代的植物和種子。在另一個實施方案中，該方法允許將分離的胚用于轉化胚物質例如它的細胞，盾片，或芽的頂端分生組織。在另一個實施方案中，該方法包含用一種有絲分裂停滯試劑處理一種分離的胚。在又一個實施方案中，該方法包含使胚萌發并且用一種有絲分裂停滯試劑處理該萌發的植物材料。在又另一個實施方案中，該方法包含用一種有絲分裂停滯試劑處 理從胚發育的胚性愈傷組織。在又一個實施方案中，該方法可以用于鑒別從玉米種子中分離的單倍體胚。該方法包含大致同時地從玉米種子分離多個玉米胚，收集所述分離出的玉米胚，并且通過R-nj或Rlscm2或兩者的盾片表型標志物鑒別單倍體胚。在又另一個實施方案中，該方法包含處理單倍體胚從而誘導雙單倍體。本發明涉及I.用于從種子中分離胚的裝置(apparatus)，包括(a)用于種子的夾持器(holder)；(b)產生流體流的裝置；(c)連接到該產生流體流的裝置上的噴嘴，該噴嘴用于將流體流導向該種子從而從該種子中分離(displace)該胚。2.根據項I所述的裝置，其中該流體選自液體、氣體、以及液體和氣體的組合。3.根據項I所述的裝置，其中該產生流體流的裝置選自泵、壓縮機、氣壓系統、和液壓系統。4.根據項I所述的裝置,進一步包括外殼(enclosure),其中至少包含所述種子。5.根據項4所述的裝置，其中所述外殼包含除空氣外的流體。6.根據項I所述的裝置，其中該種子是在玉米穗上的玉米種子、并且包含未成熟胚。7.根據項6所述的裝置，其中將該玉米的穗支撐在夾持器上。8.根據項7所述的裝置，其中在該玉米穗上有多個玉米種子。9.根據項8所述的裝置，其中該噴嘴將該流體流同時導向多個玉米種子。10.根據項8所述的裝置，其中該夾持器與該噴嘴彼此相對移動以便將該流體流導向在該玉米穗上不同位置的多個玉米種子。11.根據項10所述的裝置，其中將該夾持器固定到位并且該噴嘴相對于該夾持器移動。12.根據項10所述的裝置，其中將該噴嘴固定到位并且該夾持器相對于該噴嘴移動。13.用于從玉米穗的玉米種子中分離未成熟胚的裝置，包括
(a)用于該玉米穗的夾持器；(b)產生流體流的裝置；(C)連接到該產生流體流的裝置上的噴嘴，該噴嘴用于將流體流導向玉米種子從而從種子中分離胚；以及(d)用于收集所分離的胚的容器。14.用于從玉米種子中分離胚的裝置，包括(a)用于固定該玉米種子的裝置；以及(b)用于將流體流導向該玉米種子以便從該種子中分離胚的裝置。15.根據項14所述的裝置，其中該胚是未成熟的或半成熟的胚。 16.用于從玉米種子中分離胚的方法，包括從玉米種子中大致同時地分離多個玉米胚，并且收集所述分離出的玉米胚。17.用于從種子中分離胚的方法，包括a)將流體流施加在種子上，其中該流體或者是液體、氣體、或液體與氣體的組合；b)從該種子中分離出胚；并且b)收集所述分離出的胚。18.如項17所述的方法，其中所述胚是雙單倍體的玉米未成熟胚。19.如項17所述的方法，其中所述胚是單倍體的玉米未成熟胚。20.如項17所述的方法，其中所述胚是二倍體玉米未成熟胚。21.如項17所述的方法，其中從玉米穗上的多個種子中分離出多個胚。22.如項21所述的方法，其中該多個胚是完整的和部分完整的胚的混合。23.如項17所述的方法，進一步包括通過將該胚的早熟萌發(precociousgermination)來繁殖分離出的胚而發育成植物。24.如項23所述的方法，其中所述繁殖包括從該胚的盾片生成胚性(embryogenic)愈傷組織。25.如項24所述的方法，其中所述的繁殖包括從植物的所述胚性愈傷組織的再生。26.根據項17所述的方法，其中所述分離出的胚具有以下胚物質，包括細胞、盾片、和分生組織；并且進一步包括轉化選自下組的胚物質，該組包括細胞，盾片，或莖端分生組織(shoot apical meristem)。27.根據項23所述的方法，其中該植物是能生育的植物。28.根據項26所述的方法，進一步包括從所述胚物質再生植物。29.根據項28所述的方法，進一步包括從該能生育的植物獲得種子。30.根據項29所述的方法，進一步包括從如此獲得的種子生長植物。31.根據項23所述的方法，進一步包括從該能生育的植物獲得種子、并且從如此獲得的種子生長植物。32.根據項17所述的方法,進一步包括用有絲分裂停滯劑(arrest agent)處理所述胚。33.根據項17所述的方法，進一步包括用有絲分裂停滯劑處理所述發芽的植物材料。
34.根據項24所述的方法，進一步包括用有絲分裂停滯劑處理所述胚性愈傷組織。35.根據項28所述的方法，進一步包括用有絲分裂停滯劑處理所述再生的植物。36.根據項17所述的方法，其中所述胚包含對于轉化有用的盾片組織。37.用于鑒別從玉米種子中分離出的單倍體胚的方法，包括(a)從玉米種子中大致同時地分離多個玉米胚；(b)收集所述分離出的胚；并且(c)通過R-nj或R1SCM2盾片表型標志物鑒別單倍體胚。38.用于從由玉米種子中分離出的單倍體胚開發雙單倍體植物的方法，包括 (a)從玉米種子中大致同時地分離多個玉米胚；(b)收集所述分離出的玉米胚；(c)通過R-nj或R1SCM2盾片表型標志物鑒定單倍體胚；并且(d)誘導該單倍體胚形成雙單倍體植物。39.根據項38所述的方法，其中該雙單倍體植物可以產生種子，該種子用于植物育種。40.用于從由玉米種子中分離的胚培育植物的方法，包括(a)從玉米種子中大致同時地分離多個玉米胚；(b)收集所述分離出的玉米胚；(c)通過測試鑒定出所希望的胚；和(d)將這些胚再生以形成植物。41.利用生命周期縮短方法將轉基因滲入(introgressing)植物的方法，所述方法其特征A)將轉基因回交入植物,和B)在未成熟胚階段收集種子；C)幾乎同時分離(displacing)由所述玉米種子產生的多個玉米胚；D)收集所述分離的玉米胚；E)通過檢測鑒定所期望的胚，F)由所述期望的胚形成植物，和G)對植物授粉并任選地重復步驟(b) - (g)。42.分離胚以快速育種的方法，包括穗授粉幾天后篩選應用具有早期胚的種子(selecting for use a few days after pollination of the ear a seed with an earlyembryo),自所述種子分離所述胚，將分離的胚置于含有篩選轉基因的試劑的介質中，在單個介質篩選步驟中篩選存在至少兩個和經常三個或多個轉基因胚，使用自篩選的胚生長的植物育種。43.項42的方法，其中介質包括具有草甘膦，草丁膦，和甘露糖的生長培養基。44.項42的方法，其中沒有一個或多個轉基因的胚不能在介質中存活。45.項42的方法，用篩選的含有下述至少之一的胚育種草甘膦抗性，和PMI (甘露糖)選擇標記，Pat或Bar選擇標記或基因。46.分析育種材料的方法，包括步驟穗的早期收獲，用快速胚提取裝置提取胚和分析用于育種的提取材料。47.項46的方法，包括萌發提取的胚的步驟和發育秧苗的步驟。48.項46的方法，其中使用篩選介質在授粉后8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20天或更多天分析用于下代的篩選的秧苗。49.項46的方法，其中早收獲，胚的提取和秧苗分析導致育種生命循環相對于種子的早收獲縮短一到三周，種子的早收獲沒有胚的去除，并且種子萌發為秧苗。50.項46的方法，包括用于分離的胚，或沉默轉基因的純度檢測。51.項47的方法，其中將提取的胚材料置于與介質和/或植物激素接觸。52.項51的方法，其中篩選所述介質和/或植物激素以促進快速萌發，生長和所得秧苗的發育。53.應用分離的胚的方法，包括下述步驟授粉幾天后，自分離種質收獲種子，從所述材料分離胚和分析胚，基于胚的分析生長發育材料，其中胚分析減少種植的植物數。54.項53的方法，其中胚分析減少檢測的，培養的或收回的植物數。55.項53的方法，其中分析分離的胚用于鑒定，分離或篩選胚或其它內部種子材料。56.項53的方法，其中授粉幾天后自分離的種質收獲種子保護收獲的種子以免丟失(harvesting seeds from segregating germplasm, a few days after pollinationprotects against loss of harvested seed)。57.項53的方法，其中授粉幾天后自分離的種質收獲種子導致快速發育后代(harvesting seeds from segregating germplasm, a few days after pollinationresults in developing progeny quickly)。附圖簡要說明圖·1Α外殼以及分配器系統種子I、噴嘴3、動力沖洗液供給軟管(Power-WashSupply Hose) 6、分配器噴嘴7、外殼8、穗軸/種子夾持器9、穗軸/穗10、穗軸/穗夾持器手柄11、穗/分配器進口門12、可滑動的板112。圖.IB胚捕獲系統外殼流出管13、收集容器14、洗液流出管15、可去除流體的篩網16。圖.1C.動力沖洗液壓系統入口 29、無菌沖洗容器31、沖洗壓力泵32、紫外沖洗液滅菌器33、沖洗壓力表34、出口 35、歧管(manifold) 36、泵出口 (pump outlet) 37、歧管閥38。圖.2A早熟胚(8D. A. P.)萌發隨后進行幼苗發育(胚切除后7天)。圖.2B早熟胚(12D. A. P.)萌發隨后進行幼苗發育(胚切除后48天)。圖.3A 本發明的一個實施方案示出了手柄、穗、種子物質、流體2、外殼、用于旋轉的裝置、分配器、噴嘴、側面對側面并且旋轉的穗的移動性、收集點。圖.3B本發明的一個實施方案示出了并聯的穗分離機理，在4個穗上(可以使用任何的倍數)每個穗150個胚，噴射時間3分鐘，在一個小時(an hour)中產生了 12，000個分離的胚。這個實施方案還示出了自動化的手柄、穗、種子物質、流體、外殼、用于旋轉的裝置、分配器、噴嘴、旋轉的穗的移動性、收集點。圖.3C 本發明的一個實施方案示出了手柄/夾持器、穗、種子物質、流體、外殼、用于旋轉的任選的裝置、噴嘴、收集點。圖.4.從用本發明切除的早熟萌發的18-20D. A. P.的胚得到的年幼的玉米幼苗。P. ff. I.E. E系統用于胚切除。圖.5從該動力沖洗分離系統得到假定的單倍體植物。所有植物(胚切除后約35天)先前用一種有絲分裂停滯試劑進行處理。圖.6使用從源于動力沖洗的胚拯救的植物得到的花粉在對照植物上種子的生成。圖.7在源于動力沖洗的胚拯救的植物上能生育的雄花穗的生成。發明詳細說明定義
在本披露中數字范圍是近似的，并且因此可以包括該范圍之外的數值，除非另外指明。數字范圍包括從最低值到最高值的所有的數值并且包括該最低值和最高值(以單位的增量)，前提是在任意低值和任意高值之間有至少兩個單位的差別。作為實施例，如果組合的，物理的或其他的特性像例如分子量，粘度，熔融指數，等是從100到1，000，它旨在使所有單個的值，例如100、101、102，等，以及亞范圍，例如100到144、155到170、197到200，等，清楚地列舉出來。對于含有小于一或含有大于一的分數(例如I. 1、1. 5，等)數值的范圍，適當時一個單位被認為是O. 0001、0. 001、0. 01或O. I。對于含有小于十(例如I到5)的一位數的范圍，一個單位通常被認為是O. I。這些僅僅是確切地想要的實施例，并且在列舉的最低值和最高值之間的數值的所有可能的組合將被認為是在本披露中清楚地說明了。在本披露中提供了數字范圍，它們用于，除其他事物之外，混合物中組分的相對量，以及在這些方法中所述的不同的溫度和其他參數范圍。術語“分離”指處理目標組織(例如胚或其他組織的外植體)，該目標組織保留在更大的組織復合物(例如種子)中或形成更大的組織復合物(例如種子)的一部分，以便將該目標組織從至少一半的該更大復合物進行物理分離。在某些實施方案中，該分離的目標組織可以是從至少約50%、60%、70%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的該更大的復合物，或其任何分數進行物理分離。在其他實施方案中，從多于約80%到約100%、約90%到約100%、或約99%到約100%的該更大的復合物，或期間任何分數分離目標組織。在一些實施方案中，可以從約100%的該更大的復合物分離目標組織。本發明涉及可以用于提高從種核切除目標植物材料的效率的多種方法和裝置。本發明的這些裝置和方法可以用于快速切除并且分離完整的胚或部分完整的胚。大多數這些胚能夠發育成能生育的種子，從而生成植物。使用本發明的這些方法和裝置從種子快速分離大量的有活力的胚。這些方法和裝置對單子葉植物(包括玉米)工作良好。本發明的這些方法和裝置提供了用于快速切除并且分離大量的完整的或部分完整的，大部分有活力的成熟的或未成熟的胚的一種裝置。在其他實施方案中，本發明的方法和裝置提供了用于分離感興趣的其他種子內物質的一種裝置。該目標植物材料可以是任何希望的物質包括但不限于未成熟的胚，成熟的胚，部分的胚，完整的胚，以及胚和其他植物材料的一種組合物。該方法可以用于大致同時地從種子分離多個胚。一種流體流可以用于分離胚。該流體流包括但不限于液體，氣體，或液體和氣體的組合。用于提取胚的裝置本發明涉及一種裝置，該裝置包括壓力源，和流體沖洗源。該壓力源可以是泵系統，壓縮機，氣壓或液壓系統，或能夠提供加壓流體的任何其他裝置。該流體可以是氣體，液體或這兩種的某種組合。在另一個實施方案中，該裝置進一步包含分配器以便將該流體沖洗流出的流導向到種子上。另外，該裝置可以包含種子或穗的夾持器。該流體進入未修飾的或修飾的種子中，例如裂開的種子，并且從該種核中分離胚和其他種子內物質。在另一個實施方案中，本發明涉及用于提取一種植物胚的裝置，包括一種流體的壓力源，其中該流體被導向到種子上從而可以分離出種子內物質，以及用于收集所希望的種子物質的一種收集裝置。一種壓力源包括但不限于泵系統，壓縮機，氣壓或液壓系統，或能夠提供加壓流體的任何其他裝置。該流體可以是氣體，液體或氣體和液體的組合。 在另一個實施方案中，該裝置進一步包含一種分配器以便將該流體導向到種子上。該流體接觸種子，該種子可以在某些方面未作修飾或者做了改變，并且從該種子分離胚和其他種子內物質。本發明還涉及用于提取胚的一種裝置，包括用于種子的夾持器，一種生成流體流的裝置，以及用于將該流體流導向種子的一種噴嘴，其中該噴嘴連接到生成該流體的裝置上。該種子可以是提取胚所希望的任何種子，包括但不限于玉米、小麥、大麥、燕麥、稻、和草。該夾持器可以由任何適合的材料制成，包括但不限于鐵、鋼、特氟綸(Teflon)、復合材料(composites)、鈦、鋁、鎳、銅、錫、塑料、聚氯乙烯，以及聚烯烴。該夾持器可以配置成適合于固定種子或含有種子的植物的形狀(confine)包括但不限于圓形，矩形，正方形，三角形，八角形以及五角形。該夾持器可以用于限制該種子，在植物上包含的一種種子，或在花上包含的一種種子。例如，在將該種子放入該夾持器之前可以從該玉米穗取出玉米種子。在另一個實施方案中，可以將該玉米糖放在該夾持器中。在另一個實施方案中，在將該種子放在該夾持器中之前可以對該種子進行改變從而暴露胚。玉米胚和胚乳包在在玉米穗上生成的玉米種子中。該種子或種核保護該種子內物質包括脆弱的胚。為了從種子中提取胚，將種冠或頂部進行手工或機械地去除或切開以將胚暴露出來。可以以不同的成熟度和大小切除胚。胚的大小(以毫米測量)是年齡，親本基因型以及環境的函數。如果不采取足夠的注意，在分離過程中可能損壞胚。授粉后(D. A. P. )5-11天范圍內的小的未成熟的胚通常比12天或更多D. A. P的更老的和更大的胚更脆弱。使本發明的這些方法和裝置改善到足以分離時十分有活力的成熟的或小的不成熟的玉米胚。在另一個實施方案中，在將該穗插上該夾持器之前，準備用于提取胚/種子物質種子。可以使用手術刀切下核冠(頂部)從而在較小的阻力下動力沖洗可以穿透該種核的內部。通過從種子去除種冠(seed cap)，流體的壓力僅需要足以從種子的腔中分離胚即可。加壓的流體不需要具有適配為劈開種腔的強力。強力劈開流體壓力可以降低通過本發明分離的有活力的完整胚的百分比。如果該胚不是所希望的物質，可能增加流體壓力并且避免去除或切下種冠。這可能要求這種壓力的水平是脈沖或改變的。用于生成一種流體流的裝置包括但不限于泵，壓縮機，氣壓系統和液壓系統。該流體包括但不限于液體，氣體，液體和氣體的混合物，以及一種凝膠。該液體或氣體可以是對植物材料不造成損害或產生負面影響的并且在室溫下是氣態或液體的任何液體或氣體。該氣體可以是兩種或以上氣體的一種組合或混合物。最常用的氣體是空氣。最常用的液體是水。該液體或氣體可能容易受適合于影響該植物材料的其他化學品、組分、流體、分散的固體或溶液所浸染。例如，單子葉植物的種子和多數植物的種子已經將胚包被在一種保護性的外殼中。由于任何數量的潛在的細菌或真菌污染，將受保護的組織暴露于外部環境可能導致胚生活力的喪失。解決這種憂慮的一個辦法是使用一種抗生素或殺生物劑，例如植物防腐劑混合物或抑制細菌和/或真菌在流體中生長的化合物的某種混合物。例如，消毒劑、抗細菌或抗真菌組分和/或減少該植物材料污染的組分，或增加生活力，脅迫耐性，或生長習性或該植物材料的生長或細胞分裂速度的組分可以用于本發明的流體中。這些措施有助于減少污染的作用。 該流體至少是一種要素(element)，該要素可以用于將暴露的胚從種子或種核中分離出。在一個實施方案中，將該流體從一種或多種裝置釋放并且導向這些種子。該流體可以從流體分配裝置強力地推進。該流體分配裝置可以包括適配為將該加壓流體導向到含有所希望的一個或多個胚的切開的一個或多個種核的一種固定的或定向地可旋轉的一個或多個噴嘴或一個或多個噴射口。用于這些種子的流體的量和力足以將該目標植物材料(例如一種未成熟的胚)從這些種子中分離出來。可以將流體連續地或同時施加到多個種子上。使用的流體可以是連續的或非連續的(例如，脈沖的或波形的力)使用的流體的量優選地足以克服目標物(例如胚)和非目標物(例如非胚組織例如胚乳)來自彼此的粘附力，從而允許分離該目標物和非目標組織。可以使用任何適合的一種流體或多種流體用于從它的種子中取出目標組織，并且可以組合地，順序地或同時地使用多種流體。通過一種流體通過單獨地或組合地使用如下的任意一種可以取出胚或其他希望的物質一種固定的，可移動的，或可旋轉的分配器，穗或噴嘴。固定的意指將它固定在特定的位置。可移動的意指能夠在Χ、γ、或Z軸上，或在這些軸的兩個的一種組合上移動。可轉動意指能夠通過該X、Y、和Z軸移動，例如以圓形或螺旋形的方式移動。在另一個實施方案中，用于產生一種流體流的裝置是一種固定位置的分配器，從而該分配器僅指向方向但適配于環繞該穗旋轉，而該穗是固定的或可移動的。在另一個實施方案中，用于產生一種流體流的裝置是一種分配器，該分配器是可移動的并且環繞該穗旋轉，而該穗是固定的或可移動的。在另一個實施方案中，用于產生一種流體流的裝置是一種分配器，該分配器是固定的或可移動的并且環繞該旋轉的穗旋轉，而該分配器上的噴嘴是固定的，可旋轉的或可移動的。在另一個實施方案中，用于產生一種流體流的裝置是在固定位置上的一種分配器，其中穗也在固定位置上，其中該穗或分配器兩者都是可移動的。許多其他的排列組合是同樣有用的并且在本發明的范圍內。分配器噴嘴或噴射口的類型可以在直徑和長度上改變從而適合于從種子中切除在不同的發育階段的胚。在一個實施方案中，噴嘴可以含有小的圓形的孔口或口。該分配器可以具有錐形末端并且可以根據需要就從分配器噴嘴的頂部到種子的距離向上或向下放置。在另一個實施方案中，該流體可以加壓。該流體可以在產生流體流的裝置中加壓或可以將該流體引導到單獨的裝置中，在該裝置中可以將該流體加壓。來自壓力源使用的壓力的量可以通過該分配器改變。可以使用引起胚從種子中的分離和取出而不會產生不使希望的植物材料的任何壓力。有用的動力沖洗輸出量(每平方英寸的磅數(P. s. I.))可以是范圍從約 20-150，包括 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145以及以外的量。基于在此披露的傳授的內容，本領域的普通技術人員應當知道僅僅在常規實驗下改變該分配器的大小，分配器噴嘴開口的直徑和形狀，流體的量和形式，裝載流體從而提取這些胚的管子的直徑或長度以及從種子分離這些未成熟胚的壓力將是有可能的。在每個這些實施方案中，該流體噴霧有效區域以及力足以適用于胚取出。多數的所希望的種子物質通過流體的力從腔中沖洗下來。這些沖洗下來的物質當從穗上脫離后隨后進行收集。在另一個實施方案中，該裝置可以另外包含可以用于獲得該目標植物組織的一種分離裝置或一種過濾器。該沖洗流體可以含有所希望的物質，例如未成熟的胚，和其他的不希望的物質，例如胚乳，穎片，以及種皮或果皮組織。通過一種或多種適合的技術可以實現分離，包括但不限于通過大小排除的分離(例如，通過一個或多個過濾步驟的過濾)，基于疏水性，親水性，親油性，或其他吸引力的分離，以及通過質量或密度差異的分離(例如通過離心、沉降、和傾析的分離)。該分離的一個步驟或多個步驟可以是任選的，例如當它們用于組織培養時不需要另外分離完整的或部分的胚。在另又一個實施方案中，該裝置可以另外包含一種殺菌裝置。在一個實施方案中，該殺菌裝置可以用于在接觸種子前對該液體，氣體或液體和氣體的組合進行殺菌。在另一個實施方案中，該殺菌裝置可以用于使細菌和真菌孢子不能存活，它們可能與該目標植物組織或該液體或氣體有關。任何方案或裝置可以用于對該沖洗液體進行殺菌，前提是使該細菌和真菌孢子不能存活，并且該目標植物組織不受影響。該殺菌裝置包括但不限于發射紫外線輻射、X-射線、微波等離子體輻射、電子束輻照、以及輻射的裝置。此外，該殺菌裝置還由可去除細菌、真菌和病毒物質的一種過濾器構成。可以使用不同大小的一種或一種以上的過濾器。在下文中，除非另外指明本發明的分配器和穗被認為是固定的，可旋轉的或可移動的或在這些參數之間可切換的。在一些實施方案中該分配器和穗同時從種子中取出胚，在其他的實施方案中從該穗中同時取出至少兩個或以上胚。一些實施方案可以設想從該穗中同時取出多數(即使不是所有的)的胚。在圖IA中所示的一個實施方案中，該穗軸/種子夾持器9夾住玉米穗10并且旋轉該穗并且從而該種子/種核一個或多個種核I經過該沖洗分配器的一個或多個噴嘴7。另外地，該一個或多個分配器7是可移動的從而當玉米穗旋轉時可以將該流體2導向到玉米穗10的不同的區域。該穗的旋轉可以在任何軸上，包括長軸或短軸。可替代地，該旋轉可以是該分配器的旋轉。在又另一個實施方案中，該軸和分配器在X，Y和Z軸的至少一個上都可以是可移動的。分配該流體2從而取出該穗上的感興趣的這些種子的內部物質。更確切地說，圖IA示出了一種流體供應管6，它連接到分配器7上，該分配器可以連接噴嘴3，該噴嘴被適配為用于接合到該分配器上。該分配器7可以導向到或調整外殼8內的流體2。該流體供給軟管6連接到一種流體源上。該流體2可以儲存在罐，圓柱體，用于儲存氣體的容器，用于儲存液體的容器或任何其他適合的儲存裝置中。該流體供給軟管6可以具有任何希望的長度并且可以由任何適合的材料制成，包括鋼，塑料，鐵，橡膠，和聚烯烴。如圖IA中所示，通過該外殼8的頂部的開口將該流體供給軟管6插入該外殼8中。然而，通過該外殼的一側或通過該外殼8的底部可以將該流體供給軟管6插入該外殼8中。在圖IA中所示的一個實施方案中，將該穗或穗軸10固定在穗軸/種子夾持器9上并且通過該穗軸/穗夾持器手柄11旋轉。該手柄11可以適配成機械旋轉或手動旋轉。通過本領域中已知的任何裝置可以實現機械旋轉包括但不限于使用電動機，氣動機，小型發動機，電的動力源，電池，氣體的動力源，丙烷發動機，和由水提供動力的發動機。如圖IA中所示，在至少一個實施方案中，將該穗軸/穗夾持器9設計為插入該外殼8中，從而使該穗軸/穗夾持器9的一部分置于該外殼8的外面。在又另一個實施方案中，該穗軸/穗夾持器可以設計為使該夾持器的一部分置于該外殼的兩端的外面。可以對稱地設計該穗軸/穗夾持器9從而該夾持器9的類似的長度置于該外殼的兩側的外面。在 另一個實施方案中，可以將該穗軸/穗夾持器9設計為該夾持器9只有一端置于該外殼8的外面。圖IA描繪了連接到該穗軸/穗夾持器9上的一種手柄11 (它是可任選的)。可以將手柄11置于該穗軸/穗夾持器的兩端或置于單一的一端。圖IA中所示的該具體的外殼具有進口門12用于插入該穗或這些種子。在該實施方案中的流體分配器7連接到可配合地接合到該外殼中的可滑動的板112上。該板允許該流體分配器7的移動，這保持了流體噴霧在該外殼8中。該外殼8可以是任何尺寸的包括但不限于圓形、正方形、矩形、三角形、八角形、橢圓形、五角形、六角形、平行四邊形、菱形、鳶形(kite)、和梯形。該外殼可以是任何大小包括但不限于 2X2、2X3、2X4、2X6、2X8、3X3、3X4、3X6、3X8、4X4、4X6、4X8、5X5、5X6、5X8、6X6、6X8、以及8X8英尺。該外殼8由單一件材料或多件材料制成。該外殼8可以由塑料、纖維玻璃、玻璃、橡膠、聚烯烴、聚乙烯、聚苯乙烯、HDPE、和木材制成。該外殼可以能夠在任何位置開口包括但不限于頂部、底部、右側和左側。圖IB描繪了一個實施方案包括用于分離該沖洗液體，未成熟的胚，以及其他種子部分的一個或多個篩網或過濾器。該流體從該種子I中沖洗出該種子的胚4，與許多其他殘留的種子部分一起，流入該外殼8中。該外殼8具有外殼流出管13，它將該流體2以及胚4和種子部分排出至該收集容器14中。在該實施方案中，該容器14包括流體可滲透的篩網16，當流體2流過該容器14時它根據大小捕獲胚4和種子部分。然后使清潔的流體2從該容器14流入該沖洗液流出管15用于或者排放或者循環再利用。一種流體可滲透的篩網可以是任何材料或裝置，它將希望的物質與不希望的物質分開，包括但不限于過濾器、膜、篩、網狀物、網、濾紙、Whatman濾紙、布、粗棉布、以及其他過濾或蒸餾裝置。該流體可滲透的篩網可以基于大小，形狀，流動強度，或上述這些特性的任意組合進行分離。該流體可滲透的篩網可以是一種過濾器包括但不限于重力過濾器、壓力過濾器、側向流過濾器、表面過濾器(在壓力下操作的單途徑系統)、深度過濾器、以及連續旋轉過濾器。
圖IB顯示該外殼有助于將這些分離出的種子部分(包括未成熟的胚)引導到特定的位置。將這些種子部分引導到該外殼中的開口處，含有該未成熟的玉米胚以及其他種子部分的沖洗液可以通過它進行收集或流過。這些種子部分是從該開口或流出軟管可收集的。在本發明的又另一個實施方案中，可以將這些種子部分累積到適合于收集這樣的物質的收集容器中。在圖IC中所示的實施方案中，存在可以用于使細菌和真菌孢子失去活性的紫外殺菌系統，以及用于調節氣體或液體或每一個的混合物的壓力(20-150p. s. i.)或流量或流速的裝置，以及一種分配器噴霧裝置，它可以包括一種軟管、分配器、和/或噴嘴。在一個實施方案中該分配器裝置在特定的方向上是可移動的，或可以編程為一種特定的噴霧方式，具有或者穩定的、平穩的、脈沖的或可變的速度。用于生產加壓流體(或者液體或者氣體或者混合物)的不同的方法在本領域中是已知的并且本敘述并非旨在將本發明限制于這種方法。圖IC描繪了由本發明的一個實施方案中使用的該流體壓力系統30。該流體2是無菌水，它儲存在容器31中，鄰近于該壓力 泵32，紫外流體滅菌器33，流體壓力表34以及岐管36。流體2流入容器31的入口 29，在該容器中儲存該流體2。然后該流體移動通過出口 35進入泵32，并且穿過該泵流出口 37進入滅菌器33中。該流體2流過該紫外燈，流出該滅菌器流出口 31至岐管36。用岐管閥38將該流體2釋放進入供給軟管6中用于流體分配。該泵32可以是有效地移動和/或加壓該流體的任何類型的裝置包括但不限于正排量泵(a positive displacement pump)、高壓泵(a high pressure pump)、氣動泵(air-operated pump)、波紋管泵(bellows pump)、隔膜泵(diaphragm pump)、撓性葉輪泵(flexible impeller pump)、方定片泵(rotary vane pump)、接性套泵(flexible linerpump)、PTFE章動盤泵(PTFE nutating disc pump)、螺桿泵、柱塞泵、壓力沖洗泵、以及噴霧嘴栗(progressing cavity pump, plunger pump, pressures washer pump, and a spraynozzle pump)。該壓力表34可以是任何類型的壓力表包括但不限于直接讀數型壓力表、間接讀數型壓力表、傳統的壓力表、充填式壓力表、以及商用壓力表。壓力表可以從多種商業來源得至丨J包括 Omega Engineering (Stamford, Connecticut)0圖3A-C中的以下實施方案中顯示了通常地不同的裝置設計。圖3A示出了正在移動穿過該分配器的一對旋轉的玉米穗。圖3B示出了在用分配器噴霧的同時適配為旋轉的多個穗。圖3C示出了玉米穗，與具有分配器環繞該穗的外部的外殼，該環繞是以該穗及該分配器均無須需要移動的方式。可將一穗玉米放置其中的外殼可以適配為控制任何偏轉的流體噴霧。在圖3C的可替代的實施方案中，該外殼與該分配器是一體的。在圖3C中，該分配器或該穗或兩者可以或者以相同的方向或者以相反的方向旋轉。因此，如果該分配器旋轉，該外殼的內部可以旋轉。因此，該實施方案具有或者固定的分配器或者允許移動，和/或旋轉或者該穗或者該一個或多個分配器，或該穗和該一個或多個分配器兩者的裝置。另夕卜，這些實施方案中任何一個可以具有運輸系統，它在自動化的系統中將多個穗移動與該流體沖洗液接觸。圖3A-C示出了本發明的裝置的不同的實施方案。圖3A中，通過旋轉的夾持器9夾持該玉米穗或穗10。這些穗10可以手動旋轉或通過動力源進行機械旋轉。釋放流體2的這個或這些噴嘴3的方向可以適配為可移動的，可旋轉的或固定的。在該實施方案中，該分配器7和/或該這些噴嘴3可以成角度。夾持器9的旋轉允許該穗旋轉從而所有的種子可以出現在該分配器前。在另一個實施方案中，該加壓流體的力既可以用于沖洗出種子內部物質并且由于這種沖洗的向量性也可以用于沿旋轉方向移動該單個穗/多個穗的這兩個目的。流體2可以是一種氣體或液體或這兩者的一種混合物。可任選地，可以將多個噴霧裝置/分配器7引入到本實施方案中。這些噴霧裝置7可以固定或是可旋轉的并且定向地可移動的，其中穗10是固定的，可旋轉的或可移動的。另一種任選是其中這種或這些分配器7可以環繞穗10旋轉，其中該穗也是旋轉的，如圖3B中所示。在圖3B中，將這種或這些分配器7置于圓柱體、環、殼或外殼樣裝置之中，其中噴嘴3或噴射口 3被適配為對該穗10上的種子I的所有側面強力釋放流體2。在操作中，該分配器環繞該穗并且從該穗的一端移動到另一端。在另一個實施方案中，該穗移動穿過分配器，其中該分配器不是必須移動的。在又另一個實施方案中，該穗和該分配器兩者可以移 動。因此，該裝置可以具有一個或多個噴嘴3或噴射口 3并且這些噴嘴可以下移到該穗10處，或該穗10可以旋轉和/或移動到這些噴嘴3中或兩者能夠以相同的或相反的方向移動。在這個實施方案中，將噴射口 3或噴嘴3可以直接地或間接地由動力源提供動力。在另一個實施方案中，該裝置可以具有環繞這個或這些穗10放置的多個分配器噴嘴3或噴射口 3并且這些噴射口 3以及穗10均不要求旋轉。該噴射表面積足于覆蓋該穗10。圖3C示出了又另一個實施方案，該實施方案具有填滿噴嘴3的環繞的外殼，這些噴嘴環繞該穗同時將加壓流體2導向這些種子I。該圓柱體(或可替代地盒樣的外殼或外殼)可以是固定的，其中將這些穗被運輸穿過這圈流體2。在另一個實施方案中，該圓柱體(或可替代地盒樣的外殼或外殼)可以是旋轉的，其中將這些穗被運輸穿過這圈流體2。在又一個實施方案中，該穗可以是固定的，其中該圓柱體環繞該穗10旋轉或沿該穗10移動。在許多實施方案中，將該噴霧稍微導向到該外殼的底部從而易于使該種子物質從該穗10脫離并且進入該收集容器14中是有用的。在這些實施方案中，通過該流體2的力將所希望的種子物質從該種腔中沖洗入容器14中。也可以通過穗的旋轉力的輔助將該種子物質沖洗下來。這些沖洗下來的種子物質40，當從穗10上脫離后隨后進行收集。然后將收集的種子物質40進行篩選或過濾，從而定位該胚物質40。在一些實施方案中，該胚物質4將是所希望的目標植物材料。在又另一個實施方案中，所希望的目標植物材料可以是非胚物質。由于多種原因的任意一種，可以收集非胚物質。它對于分析，或測試或收集蛋白、淀粉、或其他種子物質包括位于該非胚物質中的轉基因物質可能是有用的。可替代地，可以收集該非胚和胚物質兩者。這些穗的位置，該外殼的形狀以及該分配器噴霧裝置可以適配為將該脫位的種子物質導向限定的區域從而有助于收集。通過使用適配為將所希望的物質從不希望的物質中分離出來的篩網可以在收集容器中收集這些分離的胚和其他種子物質，如圖IC中所示。圖IB是圖IA的側面圖，沒有穗和手柄。該外殼的下部包含該種子材料捕獲系統40。該種子材料捕獲系統40包含允許將該種子材料漏到該收集容器14中的外殼流出管13，該收集容器包含沖洗液體流出管15用于收集使用過的分配的流體。可以使用該外殼的底部的托盤來收集該脫位的植物種子物質。此后，如果該種子物質需要分離則可以使用篩選或重量分離系統。用于提取胚的方法本發明涉及用于從種子中分離胚的一種方法，包括向種子施加一種流體流，其中該流體或者是一種液體、氣體或者是液體和氣體的組合，從該種子中分離胚，并且收集該分離出的胚。在又一個實施方案中，本發明涉及用于從玉米種子中分離胚的一種方法，包括從玉米種子中大致同時地分離多個玉米胚，并且收集所述分離出的玉米胚。使用本發明的方法可以有效地并且快速地分離任何數目的胚。本發明的方法可以用于分離一種雙單倍體、一種單倍體、或一種二倍體未成熟的胚。在此描述的方法和裝置可以與使用種子中物質的多種另外的方法一起使用。這些 另外的方法包括單不限于用于轉化內部單倍體種子物質、二倍體種子物質或單倍體和二倍體種子物質的一種組合，形成用于植物再生的愈傷組織；再生單倍體/雙單倍體植物材料；或用于分析在該內部物質中發現的遺傳物質、油、蛋白、淀粉、外來數據等。這些方法的每通過由一種流體產生的力通過快速切除種子物質(包括胚)來改進。本發明的方法包括一種玉米轉化系統或一種愈傷組織生產系統或如果這些胚的一部分懷疑是單倍體胚則包括一種染色體加倍系統。該分離轉化系統適配為生產轉化的植物材料。該分離的愈傷組織生產系統適配為生產植物愈傷組織。用于該染色體加倍系統的分離的胚適合于生產一種雙單倍體植物材料。可以將該分離的物質在用于誘導早萌發，或用于產生所希望的細胞或DNA，在體外篩選，以及生命周期縮短的過程中。轉化本發明可以用于植物，這些植物不必誘導單倍體，由于存在或缺少顏色標志物可以對它們進行選擇或丟棄。當用于轉化的目的時，這些植物可以是單倍體或它可以是種質(近交的或雜交的)。植物轉化是通過已知的方法例如粒子轟擊、whiskers法、電穿孔或農桿菌將遺傳物質引入到不同的可轉化植物組織中的一種方法。一種希望的可轉化的組織是在分離出的未成熟的玉米胚中可得到的未成熟的玉米盾片。該動力沖洗分離是用于快速分離大量的未成熟胚的一種方法。因此，總的實驗室轉化生產量可以增加，但是降低了成本和勞動。然而，由于這些胚的小的尺寸，它們可能很難在該種子內物質的碎片中被找出來，除非使用適當的分離和鑒別方法。當在該分離出的未成熟的胚上進行轉化時，可以使用遺傳物質例如構建體、質粒、載體、轉基因、染色體以及類似物從而提供給該胚中的植物材料以多種不同性狀，例如對除草劑、昆蟲、病毒、細菌、真菌、線蟲、干旱、熱、冷、冷凍、過分的潮濕、鹽的應激、以及氧化應激的抗性或耐受性(或如果希望的易感性)、應激耐受性或增加的農業值的性狀像產量、濕度、保綠性、莖強度、外觀、雄性不育、干透、直立能力(standability)、或不同的產品特征(product profiles)例如淀粉、油、蛋白、乙醇生產潛力、氨基酸組成、以及類似物。可以從轉化的植物的種子中分離未成熟的胚。可以進一步測試這些胚從而證實該遺傳(合成的或另外仍然定義為遺傳的)物質的穩定整合。通常，被轉化的遺傳物質具有事件(event)，該事件包括某些類型的標志物(該標志物可以是目標轉基因或一種另外的轉基因)，這允許從所不希望的物質中區別出所希望的物質。可以使用不同類型的標志物包括可篩選的標志物例如編碼熒光素酶、珊瑚基因或β -葡萄糖醛酸酶UidA基因(GUS)或可選擇的標志物可以包括甘露糖選擇(P. Μ. I.)、對抗生素例如卡那霉素、潮霉素B、慶大霉素的抗性或對除草劑例如草丁膦(glufosinate) (bar或pat基因)以及草甘膦(glyphosate)(EPSPS;CP4)的抗性以及對于本領域中的普通技術人員已知的其他的物質。不同的標志物示于美國專利號 5，767，378,5, 550，318 ;5，633，435 ;5，780，708 和 6，118，047 中，所有這些專利通過引用結合在此。轉化方法、用于胚性愈傷組織誘導的方案，以及染色體加倍方案對于本領域中的普通技術人員是已知的。雖然如此，將這些方法的以下傳授的內容列出并通過引用用于由來自植物的物質制備愈傷組織的方法結合在此，這些植物包括玉米美國專利號7，067，719、6，730，824,6, 143，563,5, 134，074 ;通過將DNA引入一種植物的基因組中轉化植物，包括本領域中已知的許多已知的方法例如在美國專利號5,015, 580 ;5，550,318 ;5，538, 880 ；6，160，208 ；6, 399, 861,6, 403, 865 中的微粒轟擊，在美國專利號 5，635，055 ;5，824，877 ；5，591，616 ;5，981，840和6，384，301中傳授的農桿菌介導的轉化；在5，302，523 ；和5, 464, 765中傳授的Whisker轉化。 愈傷組織以及幼苗的生成本發明分離的胚可以形成愈傷組織或提供萌發以及幼苗發育。為了實現此目標，將分離的胚物質置于與植物組織培養基例如由Murashige和Skoog (M. S培養基)、或Chu等人(N6培養基)、或Gamborg等人(B5)描述的那些或其他組織培養鹽混合物或水培(Hoegland)溶液，包括碳水化合物源(例如，蔗糖、麥芽糖，等)接觸。這些有助于產生的幼苗快速萌發、生長并且發育。另外地，將一種或多種細胞分裂素(例如，激動素、玉米素、6-芐基氨基嘌呤、噻苯隆(thidiazuron))或范長素(auxin)(例如,2，4_ 二氯苯氧基乙酸、α-萘乙酸、吲哚-3- 丁酸、吲哚-3-乙酸)或赤霉酸(例如GA3)植物激素或植物激素的不同組合包括在該植物培養基中持續給定的一段時間來I)誘導胚性愈傷組織從盾片或胚軸發育或2)在芽頂端分生組織中影響細胞分裂或3)增強得到的幼苗的生長以及發育應該是有可能的。該誘導的胚性愈傷組織可以轉化和/或再生從而形成植物以及種子。可替代地，如果希望，該分離的胚的這些細胞、盾片、芽頂端分生組織或該胚本身可以進行遺傳改變。可以將這樣的物質進行轉化、誘變、化學處理或類似的處理并且然后使用從而再生一種植物，優選地一種能夠產生花粉以及種子(除非不育是希望的改變)的植物。分析可以直接分析動力沖洗分離的胚以及其他種子內物質。該分析可以用于胚或其他種子內物質的鑒別、分離和選擇。種子的表型例如該種子物質的糯性(waxy)、高或低植酸、油、蛋白、氨基酸、或其他淀粉的質量或獨特地與存在或缺少轉基因相關聯的表型。培育培育的方法包括以下步驟，S卩早期收獲穗，使用一種快速胚提取裝置例如在圖中所示的動力沖洗機提取胚并且分析所提取的物質用于選擇。快速培育方法的方法實施方案包括通過將胚置于培養基中用具有對于這些轉基因選擇的試劑來選擇胚中的轉基因。已經發現在單獨的培養基選擇步驟中可以選擇這些早期胚找到存在至少兩種并且通常是三種或以上的轉基因。例如如果希望的是三個轉基因在該胚中并且在分離物質中的這些轉基因可以具有一種草甘膦抗性基因，以及與一種疾病相關的一種PMI (甘露糖)可選擇的標志物或昆蟲抗性基因，以及一種Pat或Bar可選擇標志物或基因，通過將該胚置于培養基上可以鑒別出所希望的三個轉基因物質，該培養基包含生長培養基包括草甘膦、草丁膦、以及甘露糖。帶有這三個標志物的胚將存活并且不具有一個或多個這些基因的胚將不能存活。因此具有這三個基因的培育物質或玉米系可以鑒別出來并且選擇用于該穗的授粉后幾天內進一步的使用。本領域中的普通技術人員應該理解任意數量的其他可篩選或可選擇標志物以及相關的試劑、除草劑、抗生素等可以用于篩選不同的轉基因。如果在本發明傳授的內容的范圍內有用于選擇或篩選該轉基因的任何手段，則在該胚中可以鑒別任何類型的轉基因。在授粉后8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或更久的時間內通過使用選擇培養基可以鑒別幼苗的下一代。相對于沒有將胚去除并且萌發成幼苗的早期收獲的種子，該培育的方法可以將培育時間縮短一到三周。本領域中的普通技術人員應該理解用于同時胚提取的裝置可以在培育周期內顯著地減少時間和勞動。這種方法還允許種系的純度測試的一種方法，這些種系可能不期望分離，或具有沉默的轉基因。 幼苗形成本發明分離的胚可以萌發并且經歷幼苗發育。為了實現這個目標，該分離的胚物質被置于與植物組織培養基接觸中或潛在地包括植物激素例如上述在轉化章節中描述的那些。選擇這些培養基和/或植物激素從而有助于最終幼苗的快速萌發、生長以及發育。可替代地，如果希望，再生的起始可以等待并且這些細胞、盾片、芽頂端分生組織可以進行遺傳測試或遺傳改變。可以將這樣的物質轉化、誘變、化學處理或類似的處理并且然后使用從而再生一種植物，優選地一種能夠產生花粉以及種子的植物(除非不育是希望的改變)。分析可以直接分析動力沖洗分離出的胚以及其他種子內物質。該分析可以用于胚或其他種子內物質的鑒別、分離和選擇。可以測定該種子的基因型和/或該種子的表型例如該種子物質的糯性、低或高水平的脂肪酸、淀粉酶、不育、高或低植酸、油、蛋白、氨基酸、或其他淀粉的質量或獨特地與一種轉基因存在或缺少相關聯的一種表型。基于這些測定，可以對某些胚進行選擇或舍棄。這種非常早期的種子的分析提供了基本的培育時間、工作量、生產成本、土地使用、以及總的培育速度和效率。在授粉后幾天內在該培育過程中通過從分離的種質中收獲種子，該培育過程花費顯著地更少的時間而發育成有用的玉米物質。如果天氣條件不理想，該早期收獲窗口(window)可以提供需要的靈活性從而更快地發育子代并且從而保護該種子收獲。一旦收獲該穗，可以從該物質中提取這些胚并且非胚物質例如果皮(母本DNA)和胚乳可以鑒別并對其進行所希望的基因型或表型測試。基于該種子材料或它的DNA的這種測試或其他分析可以對培育物質進行選擇。這種早期選擇減少了種植、測試、培養或在隨后的季節中收獲的植物的數目。雙單倍體一種非常大的改進的未成熟玉米胚提取系統在收集單倍體物質的過程中是重要的步驟。就標準的胚切除方案而言，玉米的平均大小的穗可能要求普通的實驗室工作者無論怎樣要花費從20分鐘到40分鐘的時間來從單獨的穗單個地提取并且培養所有胚。然而，使用該動力沖洗分離系統將胚的分離(穗加工時間)減少到約1-3分鐘/穗。
胚提取效率對于單倍體玉米染色體加倍方法(包括雙單倍體培育方法)是重要的。這是尤其合理的，因為單倍體胚誘導的頻率通常很低。例如，多種蛋白體誘導物例如KEMS, ZMS、WS14、K. H. I.、RWS、RWK-76、Stock6、等在單倍體誘導率上有變化，通常范圍從約2%到10%。為了檢測該誘導的單倍體種子，將使用花色苷基因的一種表型標志物系統結合到該單倍體誘導物父本中。要求多種調節(C1/P11和R1/B1)和結構基因(Al、A2、Bzl、Bz、C2)用于花色苷表達(Chen and Coe, Biochemical Genetics.15:333-346,1977.,Procissi et al. , Plant Cell, 9:1547-1557, 1997. , Taylor andBriggs, Plant Cell, 2:115-127, 1990. , Dooner et al. , Annual Review of Plant Genetics, 25:173-199, 1991. , Panavas, et al. , Genetics, vl53. 979-991. 1999. , Styles, Maydica 38:127-133. 1993. , Piazza et al. , Plant Physiology, 128. :1077-1086, 2002. , Cross and Alexander, Euphytica 33:577-582. 1984. , Coe et al. 1988,The Genetics ofCorn. 81-258. In:Sprague GF, Dudley Jff(eds)Corn and Corn Improvement, 3rd ed. Amer.Soc. Agronomy, Madison)。總的來說，許多單倍體誘導物依賴于使用R-nj花色苷標志物單元型從而通過花 色苷色素沉著的位置表達使單倍體能夠在種子中被鑒別出來。單倍體種子在該種子的頂或冠部在糊粉組織中展示了花色苷色素沉著，但在該胚的盾片中沒有色素沉著。可替代地，二倍體種子在兩個位置上都有色素沉著。有時候，在種子的多個部分中花色苷表達的可見的差異可能是有問題的。通常是已知的用于調節種子中花色苷表達的可計分的花色苷標志物基因的列表包括R-nj、Rl_scml22、Rl-scm2、Rl_scm: 3、Rl-scm、RI-mb (大理石糊粉)、Rl-r: standard、Rl-Randolph、Rl-ch: Stadler> Rl-d:Catspaw, A, C> Rl_d:Arapaho、Rl_nj、(Rl_nj :Cudu)、(Rl-nj :Chase)、Rl_sc:124、Rl-sup-Rl-suppressible、Rl KlO-II ；R1 M-Xl、Rl_ch、Rl-g、Rl-lsk、Rl-r、Rl_scl22、Rl_sc*5691、Rl-sk:nc_2、Rl_sk、Rl-st.等以及本領域中已知的其他物質。可替代地，基于在3-5日齡幼苗的根中存在或缺少色素沉著其他的花色苷標志物提供用于在幼苗階段單倍體的鑒別(參見Tyrnov and Zavalishina, DAN276:735-738， 1984)。取決于使用許多已知的用于在種子中花色苷表達的調節基因的哪一種，種子或胚中紫色著色將顯示于種子以及胚成熟的不同階段。因此在單倍體胚拯救鑒別方法中并不是所有種子花色苷標志物是有用的，因為在胚發育的早期階段用于鑒別的顏色是不明顯的。我們已經發現 X26b=Rlscm2 (未知背景)、M242G=Rlscm2 (W22 背景)、X17F=Rlscm3、X19A=Rlscm4、以及X26C=Rlscl22，花色苷種子標志物單倍體在未成熟胚(12D. A. P.)的胚拯救后24小時內提供盾片色素沉著。另外，將Rlscm2花色苷標志物單元型引入一種玉米單倍體誘導物允許鑒別至至少12D. A. P的單倍體胚。一些上述顏色標志物可能提供用于甚至更早的盾片色素沉著是有可能的。不合宜的少見的誘導單倍體玉米胚使每個胚對于染色體加倍的目的是重要的。手工提取未成熟的胚用于雙單倍體生產的目的是有可能的，但是由于它們小的尺寸以及要求用于雙單倍體培育計劃的單倍體胚的巨大的數目，這種手工提取是相當有問題的。然而，本發明積累了(以極高的數目)最適合的植物部分(未成熟胚)用于染色體加倍。該動力沖洗分離系統將該未成熟的胚與它的相應的未成熟的芽分離。這種分離的胚物質是所希望的用于有絲分裂停滯目標物質。通過暴露于培養條件，培養基，包括化學品或激素，有絲分裂停滯使染色體加倍，從而生成能生育的玉米雙單倍體。使用秋水仙堿，氧化亞氮以及其他化學品的加倍的方法示于Gayen等人，"Chromosome doubling in haploidsthrough colchicine, ^Maize Genet. Coop. Newslett, . 68:65, (www.agron.missouri.edu/mnl/68/101gayen. html), 1994, WAN and WIDHOLM, Plant Breeding 114(3):253 - 255, 1995·，Kato, "Chromosome doubling of haploid maize seedlings using nitrous oxide gasat the flower primodial stage, "Plant Breeding, 121:370-377，2002;W0/2007/038075 ;以及美國專利7135615中，將其通過引用結合在此。因此，本發明，這種動力沖洗分離系統通過增加每單位時間胚提取的效率以及通過降低胚提取的成本這兩者增加了將雙單倍體用于玉米培育中。此外，使用Rlscm2顏色標志物單元型提供了用于鑒別未成熟單倍體胚的方法，并且因此提供了一種高度有用的顏色標志物用于未成熟單倍體胚的鑒別。這些未成熟單倍體胚可以用于染色體加倍的目的。提供以下的實施例是用于說明本發明，并且不是用于限制。實施例I :來自12D.A.P.胚的未成熟胚的切除并且早萌發。該實施例展示了使用一種流體沖洗系統來從玉米的穗上切除/分離未成熟玉米胚。該流體壓力沖洗系統的滅菌將5加侖10% Clorox (6. 0%次氯酸鈉)溶液通過示于圖IA-C中的泵、岐管、軟管、以及紫外滅菌器系統連續地反復循環，持續約30分鐘。然后通過將Clorox溶液流出穿過該噴霧器軟管和箱裝置(

圖1A)并且向下進入該流出管而從該系統中排出。將5加侖的無菌水循環直接穿過該系統并且流出進入該流出管。將5加侖的無菌Millipore水或自來水連續地再循環穿過該裝置的整個流體系統持續30分鐘，然后儲存在罐中直至用于該流體壓力提取這些胚。最后，用70%的乙醇沖洗該外殼/噴霧箱裝置(圖I)并且允許其干燥。在使用前將該穗夾持器，噴頭(分配器/噴嘴)，以及用于拾取該穗的夾子在70%的乙醇中殺菌5-10分鐘，并且允許其干燥。未成熟的穗的制備授粉后12天(12D.A.P.)從溫室收獲51個未成熟的雜交的玉米穗并且通過將它們浸入50%Chlorox (6%次氯酸鈉)溶液中20分鐘進行滅菌。然后用無菌水以5分鐘間隔將這些穗沖洗三次從而去除該殺菌溶液。為了準備用于在層流罩中進行胚提取的這些穗，使用一把無菌的手術刀將種核頂部去除，注意不要切到胚軸。切除未成熟胚。使用無菌夾子，將該穗置于該噴霧箱裝置的內部并且使用烤肉架式的桿將其固定到位(穗夾持器)(圖I)。通過岐管將該液壓噴霧系統調節到約90p. s. i.。使用該烤肉架式裝置，旋轉該穗同時該分配器噴嘴將一束流體集中到該穗上。該流體來回經過這些切開的種核表面直到所有的胚和胚乳成分從該種子中被排除或分離。收集釋放的二倍體胚以及胚乳組織并且然后通過10目和20目兩個篩子流出。將無菌水噴霧到胚以及在10目篩子上收集的碎片上，以便將它們沖洗通過用于在20目篩子上捕獲。將得到的胚快速轉移到培養皿中用4ml液體Murashige和Skoog (M. S.)組織培養基飽和的濾紙上。然后在28。C下在400PPFD (光合光量子通量密度)的光亮度下每天16小時培養這些胚持續3天的時間。
結果在2小時的時間內提取來自51個穗的未成熟胚。盡管大多數這些胚是完整的，但是一些盾片件從一些胚上脫落。雖然對一些盾片造成損傷，在所有的穗中多數胚軸仍然保留在有活力的條件下。表I中的數據展示了在來自25個穗的胚中觀察到的萌發速率。考慮到僅在一小時內切除所有胚，這些數據證明了該系統在每單位時間切除速率以及在這些分離的未成熟玉米胚中觀察到的高水平的早萌發這兩個方面的效率。表I.來自25個穗胚的胎拯救以及萌發頻率。 ·
權利要求
1.用于鑒別從玉米種子中分離出的單倍體胚的方法，包括 (a)從玉米種子中大致同時地分離多個玉米胚； (b)收集所述分離出的胚；并且 (c)通過R-nj或R1SCM2盾片表型標志物鑒別單倍體胚。
2.用于從由玉米種子中分離出的單倍體胚開發雙單倍體植物的方法，包括 (a)從玉米種子中大致同時地分離多個玉米胚； (b)收集所述分離出的玉米胚； (c)通過R-nj或R1SCM2盾片表型標志物鑒定單倍體胚；并且 (d)誘導該單倍體胚形成雙單倍體植物。
3.根據權利要求2所述的方法，其中該雙單倍體植物可以產生種子，該種子用于植物育種。
全文摘要
本發明涉及用于從種子中分離目標植物材料的快速并且有效的方法和裝置以及用于提取植物胚的方法和裝置。在一個實施方案中，本發明涉及用于從玉米種子中分離出胚的方法和裝置。在另一個實施方案中，可以將所分離的胚進行繁殖并且再生成為植物。本發明涉及用于鑒別從玉米種子中分離出的單倍體胚的方法和用于從由玉米種子中分離出的單倍體胚開發雙單倍體植物的方法。
文檔編號C12Q1/04GK102816829SQ201210285148
公開日2012年12月12日 申請日期2009年5月22日 優先權日2008年5月23日
發明者威廉.P.布洛克, 喬什.西弗森 申請人:先正達參股股份有限公司