專利名稱：生物轉化制備天然4-乙烯基愈創木酚的方法
技術領域：
本發明涉及生物轉化制備天然4-乙烯基愈創木酚的方法，具體地說，尤其涉及使用一株芽孢桿菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247轉化阿魏酸制備天然4-乙烯基愈創木酚的方法。
背景技術：
4-乙烯基愈創木酹(4-vinylguaiacol)又名2_甲氧基-4-乙烯基苯酹、對乙烯基愈創木酚，其分子式為C9H10O2，密度I. 11X103 kg/m3，熔點260C 29°C，沸點100°C /667Pa。常溫常壓下為無色或淡黃色油狀液體，呈發酵香氣，略帶甜味，是決定酒類、醬油、茶葉、咖啡、干酪等食品品質的主要香味成分，也是日化、醫藥、香精合成等行業較為常用的高檔香料之一。天然4-乙烯基愈創木酚主要存在于玉米酒精發酵的揮發物中。4-乙烯基愈創木酚常通過化學合成法生產，一般存在工藝路線復雜，收率低等問題。例如以阿魏酸和喹啉為底物，以對苯二酚為阻聚劑，在18(T185°C反應4飛小時后經過洗料、精制以后得到4-乙烯基愈創木酚。例如申請號為201010229531. X的發明專利涉及一種4-乙烯基愈創木酚的制備方法，步驟為(I)向反應器中，依次投入喹啉、阿魏酸和作為阻聚劑的對苯二酚，打開加熱裝置，接通氮氣保護裝置，到體系無氣體溢出停止加熱，繼續攪拌40-60分鐘；(2)將上述反應中加入溶劑苯中攪拌均勻，并向該溶液中加入鹽酸，攪拌均勻，然后靜置分層，檢測水相PH值為中性為止；最后向去離子水洗后的溶液中加入干燥劑無水氯化鈣；(3)將干燥后的溶液放入蒸餾器中，常壓將作為溶劑的苯蒸出，然后連接上真空泵在100°C以下的氣相溫度下將產品蒸出，即可包裝市售。該發明通過對4-乙烯基愈創木酚的合成工藝進行比對研究，確定了各種反應物阿魏酸，喹啉的最佳反應配比，因此反應收率得到提高。隨著生活水平的提高，人們對天然綠色產品的需要也越來越高。與化學合成相比，生物法合成4-乙烯基愈創木酚具有反應條件溫和，副產物少，提取步驟簡單，生產清潔，環境污染低，產品安全可靠等優點，正日益受到人們的重視。通過生物轉化阿魏酸生產天然4-乙烯基愈創木酚生產周期短，產物收率高，是一種經濟可行、極有產業化前景的4-乙烯基愈創木酚生產工藝。
發明內容
針對目前天然產品需求逐年增加，以及化學法合成4-乙烯基愈創木酚工藝路線復雜、收率低等問題，本發明提供了使用一株芽孢桿菌sp. HY3 CCTCC M 2012247轉化阿魏酸制備天然4-乙烯基愈創木酚的方法。本發明涉及的芽孢桿菌HY3 {Bacillus sp. HY3)，已于2012年6月25日保存于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢武漢大學；郵編430072 ;其保藏編號為CCTCC M 2012247。本發明涉及的芽孢桿菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247轉化阿魏酸制備天然4-乙烯基愈創木酚，其涉及的詳細步驟如下
(1)斜面培養將芽孢桿菌sp.HY3 CCTCC M 2012247接種到添加質量體積比為I %葡萄糖的LB固體培養基上，在30°C條件下，靜置培養20小時，得到成熟的斜面培養物；
(2)制備種子培養液用步驟(I)所得的斜面培養物，接種到添加質量體積比為1%葡萄糖的LB液體培養基中，在30°C條件下，120轉/分鐘振蕩培養15小時，制得種子培養液；
(3)轉化細胞培養使用步驟(2)所得的種子培養液，按體積百分比6%的接種量接入LB液體培養基中，在30°C條件下，120轉/分鐘振蕩培養20小時，得到轉化細胞培養液；
(4)轉化使用步驟(3)所得的轉化細胞培養液，加入I 5克/升的阿魏酸，28°C 37°C條件下，120轉/分鐘振蕩培養I 30小時，得到成熟的阿魏酸轉化液；
(5)4-乙烯基愈創木酚濃度檢測阿魏酸轉化液樣品經分析純乙酸丁酯萃取后檢測4-乙烯基愈創木酚濃度。其中，步驟(4)中所述的轉化溫度優選是30 35°C。其中，步驟(4)中所述的加入的阿魏酸濃度優選為0. 5 2克/升。其中，步驟(4)中所述的轉化時間優選是5 20小時。在上述利用芽孢桿菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247轉化阿魏酸制備天然4-乙烯基愈創木酚的方法中，種子培養和轉化細胞培養使用的LB液體培養基配方為葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調節pH至7. 0 ;斜面培養使用的LB固體培養基為在此培養基基礎上添加質量體積比為I. 6%的瓊脂。本發明的有益效果是，天然阿魏酸一般可從可再生的原料比如麥麩、谷糠中提取得到，使用芽孢桿菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247轉化阿魏酸制備天然4-乙烯基愈創木酚的方法有反應條件溫和，環境污染小，產物濃度高，副產物少，提取步驟簡單，生產清潔，產品環境友好，安全可靠等優點，可有效解決采用化學合成法遇到的多種難題。本發明屬于生物技術領域，采用該方法可高轉化·率生產天然4-乙烯基愈創木酚，具有很大的應用前景。
具體實施例方式實施例I :
芽孢桿菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌體在種子培養15小時后以體積百分比6%接種量接入轉化培養基中，菌體培養20小時后加入0. 2克/升阿魏酸，在30°C條件下120轉/分鐘振蕩培養。10小時后取樣測定4-乙烯基愈創木酚濃度。本發明涉及的芽孢桿菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247轉化阿魏酸制備天然4-乙烯基愈創木酚，其涉及的詳細步驟如下
(1)斜面培養將芽孢桿菌sp.HY3 CCTCC M 2012247接種到添加質量體積比為I %葡萄糖的LB固體培養基上，在30°C條件下，靜置培養20小時，得到成熟的斜面培養物；
(2)制備種子培養液用步驟(I)所得的斜面培養物，接種到添加質量體積比為1%葡萄糖的LB液體培養基中，在30°C條件下，120轉/分鐘振蕩培養15小時，制得種子培養液；
(3)轉化細胞培養使用步驟(2)所得的種子培養液，按體積百分比6%的接種量接入LB液體培養基中，在30°C條件下，120轉/分鐘振蕩培養20小時，得到轉化細胞培養液；
(4)轉化使用步驟(3)所得的轉化細胞培養液，加入0.2克/升的阿魏酸，30°C條件下，120轉/分鐘振蕩培養10小時，得到成熟的阿魏酸轉化液；
(5)4-乙烯基愈創木酚濃度檢測阿魏酸轉化液樣品經分析純乙酸丁酯萃取后檢測4-乙烯基愈創木酚濃度，最終4-乙烯基愈創木酚濃度為0. 147克/升，摩爾轉化率為95. 1%。在上述利用芽孢桿菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247轉化阿魏酸制備天然4-乙烯基愈創木酚的方法中，種子培養和轉化細胞培養使用的培養基配方為葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調節pH至7. 0 ;斜面培養使用的固體培養基為在此培養基基礎上添加質量體積比為I. 6%的瓊脂。實施例2: 芽孢桿菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌體在種子培養15小時后以體積百分比6%接種量接入轉化培養基中，菌體培養20小時后加入0. 5克/升阿魏酸，在30°C條件下120轉/分鐘振蕩培養。其中種子培養和轉化細胞培養使用的培養基配方同實施例I。10小時后取樣測定4-乙烯基愈創木酚濃度為0.366克/升，摩爾轉化率為94. 7%。實施例3:
芽孢桿菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌體在種子培養15小時后以體積百分比6%接種量接入LB液體培養基中，菌體培養20小時后加入I克/升阿魏酸，在30°C條件下120轉/分鐘振蕩培養。其中種子培養和轉化細胞培養使用的培養基配方同實施例I。10小時后取樣測定4-乙烯基愈創木酚濃度為0.710克/升，摩爾轉化率為
91.8%。實施例4
芽孢桿菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌體在種子培養15小時后以體積百分比6%接種量接入LB液體培養基中，菌體培養20小時后加入2克/升阿魏酸，在30°C條件下120轉/分鐘振蕩培養。其中種子培養和轉化細胞培養使用的培養基配方同實施例I。10小時后取樣測定4-乙烯基愈創木酚濃度為I. 4克/升，摩爾轉化率為90. 5%。實施例5
芽孢桿菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌體在種子培養15小時后以體積百分比6%接種量接入LB液體培養基中，菌體培養20小時后加入I克/升阿魏酸，在30°C條件下120轉/分鐘振蕩培養。其中種子培養和轉化細胞培養使用的培養基配方同實施例I。5小時后取樣測定4-乙烯基愈創木酚濃度為0. 705克/升，摩爾轉化率為91.2%。實施例6
芽孢桿菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌體在種子培養15小時后以體積百分比6%接種量接入LB液體培養基中，菌體培養20小時后加入I克/升阿魏酸，在30°C條件下120轉/分鐘振蕩培養。其中種子培養和轉化細胞培養使用的培養基配方同實施例I。20小時后取樣測定4-乙烯基愈創木酚濃度為0.718克/升，摩爾轉化率為
92.9%。實施例8 芽孢桿菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌體在種子培養15小時后以體積百分比6%接種量接入LB液體培養基中，菌體培養20小時后加入I克/升阿魏酸，在37°C條件下120轉/分鐘振蕩培養。其中種子培養和轉化細胞培養使用的培養基配方同實施例I。10小時后取樣測定4-乙烯基愈創木酚濃度為0. 714克/升，摩爾轉化率為
92.3%。
權利要求
1.ー種生物轉化制備天然4-こ烯基愈創木酚的方法，其特征在于所述方法是以天然阿魏酸為底物，以芽孢桿菌sp. HY3 CCTCC M 2012247為生物催化劑，進行反應制得所述4-こ烯基愈創木酚。
2.根據權利要求I所述的生物轉化制備4-こ烯基愈創木酚的方法，其涉及的步驟如下 (1)斜面培養將芽孢桿菌心sp.HY3 CCTCC M 2012247接種到添加質量體積比為I %葡萄糖的LB固體培養基上，在30°C條件下靜置培養20小時，得到成熟的斜面培養物； (2)制備種子培養液用步驟(I)所得的斜面培養物，接種到添加質量體積比為1%葡萄糖的LB液體培養基中，在30°C條件下，120轉/分鐘振蕩培養15小時，制得種子培養液； (3)轉化細胞培養使用步驟(2)所得的種子培養液，按體積百分比6%的接種量接種到添加質量體積比為I %葡萄糖的LB液體培養基中，在30°C條件下，120轉/分鐘振蕩培養20小時； (4)轉化使用步驟(3)所得的轉化細胞培養液，加入天然阿魏酸，在28°C 37°C條件下，120轉/分鐘振蕩培養I 30小時，得到成熟的阿魏酸轉化液。
3.根據權利要求2所述的生物轉化制備天然4-こ烯基愈創木酚的方法，其特征是所述天然阿魏酸的濃度為I 5克/升。
4.根據權利要求2所述的生物轉化制備天然4-こ烯基愈創木酚的方法，其特征是制備種子培養液及轉化細胞培養使用的培養基配方均為葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調節pH至7. 0 ;斜面培養使用的固體培養基是在此培養 基基礎上添加質量體積比為I. 6%的瓊脂。
5.根據權利要求2所述的生物轉化制備天然4-こ烯基愈創木酚的方法，其特征在于步驟(4)中所述的轉化溫度是30 37°C。
6.根據權利要求2所述的生物轉化制備天然4-こ烯基愈創木酚的方法，其特征是步驟(4)中所述的轉化時間為5 20小時。
7.根據權利要求2所述的生物轉化制備天然4-こ烯基愈創木酚的方法，其特征是阿魏酸轉化液樣品經分析純こ酸丁酯萃取后檢測4-こ烯基愈創木酚濃度。
8.ー種芽孢桿菌YiYMMaciIIus sp. HY3)，其特征是該菌株已于2012年6月25日保存于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2012247。
全文摘要
一種生物轉化制備天然4-乙烯基愈創木酚的方法，該方法以芽孢桿菌Bacillussp.HY3CCTCCM2012247為生物催化劑，以天然阿魏酸為底物，通過微生物轉化制備天然4-乙烯基愈創木酚。該生產過程包括(1)斜面培養,(2)制備種子培養液，(3)轉化細胞培養,(4)轉化。本發明屬于生物技術領域，采用該方法可高轉化率生產天然4-乙烯基愈創木酚，可用于煙酒、食品等領域，具有很大的應用前景。
文檔編號C12P7/22GK102776246SQ20121028891
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月15日 優先權日2012年8月15日
發明者華棟梁, 張曉東, 張 杰, 李巖, 梁曉輝, 許敏, 許海朋 申請人:山東省科學院能源研究所