專利名稱：提高上面發酵小麥啤酒中4-乙烯基愈創木酚含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用基因工程技術提高啤酒中4-乙烯基愈創木酚含量的方法，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
4-乙烯基愈創木酚感官閾值很低，僅為O. 3mg/L,即使痕量，也能使啤酒呈現藥房味、酚味、丁香味或煙熏味，因而在大多數下面發酵啤酒中，其風味并不受歡迎，并且被稱作是“酹異味(phenolic off-flavour)”。盡管對下面發酵啤酒而言是異味物質,但是眾所周知，4-乙烯基愈創木酚卻是形成比利時白啤酒(用未發芽的小麥釀造)、德國小麥啤酒(用小 麥芽釀制)以及煙熏啤酒等上面發酵啤酒的必不可少的香味物質，也是該類啤酒全面風味評價不可或缺的特色成分。在啤酒釀造過程中，通過水解和酶解作用，許多酚酸會游離出來，在上面發酵啤酒酵母中酚酸脫羧酶的作用下，可以將其中的酚酸脫羧，形成4-乙烯基愈創木酚(呈丁香花味)等特色風味物質，可以顯著地提高上面發酵小麥啤酒的香味。目前4-乙烯基愈創木酚主要是通過化學或生物法進行合成。如中國專利文獻CN101885669A (申請號201010229531. X)公開了一種4-乙烯基愈創木酚的制備方法，步驟為(1)向反應器中依次投入喹啉、阿魏酸和作為阻聚劑的對苯二酚，打開加熱裝置，接通氮氣保護裝置，到體系無氣體溢出停止加熱，繼續攪拌40-60分鐘；(2)將上述反應中加入溶劑苯中攪拌均勻，并向該溶液中加入鹽酸，攪拌均勻，然后靜置分層，檢測水相pH值為中性為止；最后向去離子水洗后的溶液中加入干燥劑無水氯化鈣；(3)將干燥后的溶液放入蒸餾器中，在常壓下將作為溶劑的苯蒸出，然后連接上真空泵在100°C以下的氣相溫度下將產品蒸出即可。由于該方法產生部分副產物及原料殘留，無法直接添加到啤酒釀造過程中。中國專利文獻CN101397568A (申請號200810233517. X)公開了一種通過基因克隆的方法獲得ENTEROBACTER SP. PX6-4中分解阿魏酸生成4-乙烯基愈創木酚的關鍵酶阿魏酸脫羧酶的編碼區序列、并通過異源表達技術在大腸桿菌(E. COLI BL21)中大量表達了該酶；通過純化的方法獲得了阿魏酸脫羧酶的純品；運用懸滴結晶法得到阿魏酸脫羧酶的蛋白質結晶，并且掌握了該酶的結構及活性中心。由于阿魏酸是4-乙烯基愈創木酚的前體物質，在啤酒釀造過程中添加阿魏酸脫羧酶，雖然能夠提高啤酒中的4-乙烯基愈創木酚含量，但效果無法滿足實際需求。事實上，部分細菌和真菌含有PADC基因，編碼酚酸脫羧酶(phenolic aciddecarboxylase),在生物的降解代謝過程中起著非常重要的作用，例如不動桿菌Acinetobacter、突光假單胞菌 Pseudomonasfluorescens 和枯草芽抱桿菌 Bacillussubtilis等，但PADC基因應用于啤酒釀造工藝中尚未見報道。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供了一種利用基因工程技術提高上面發酵小麥啤酒中4-乙烯基愈創木酚含量的方法。一種提高上面發酵小麥啤酒中4-乙烯基愈創木酚含量的方法，步驟如下(I)從枯草芽孢桿菌中通過PCR擴增PADC基因，PADC基因核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，PCR擴增引物序列如下上游引物F-padc5，~GCGTCTAGAATGGAAAACTTTATCG~3，下游引物R-padc5’~GCGAAGCTTTTATAATCTTCCCGC~3，；(2)將步驟(I)制得的PADC基因經純化后，經內切酶XbaI和內切酶HindIII雙酶切后與同樣經內切酶XbaI和內切酶HindIII雙酶切的質粒YEp352連接，制得重組質粒YPADC，將重組質粒YPADC轉化至上面發酵酵母W303-1A，獲得上面發酵重組酵母菌株W303+padc ；·
(3)利用11° P麥汁對步驟(2)制得的上面發酵重組酵母菌株W303+padc進行擴大培養，培養條件為25 28°C搖床，220 240r/min，獲得上面發酵酵母W303+padc ；(4)將步驟(3)制得的上面發酵酵母W303+padc接種于11° P麥汁中，在溫度為16 18°C進行發酵培養至糖度為4° P時，密封發酵容器保壓至雙乙酰含量低于O. lmg/L,降溫至O 2°C，保存5 8天，制得4-乙烯基愈創木酚含量為I. 6 I. 8mg/L的啤酒。根據本發明優選的，所述步驟(I)中，PCR反應程序為94°C預變性3min ;94°C模板變性30s，52. 6°C引物退火30s，72°C引物延伸45s, 30個循環；72°C延伸IOmin0根據本發明優選的，所述步驟(2 )中，重組質粒YPADC轉化上面發酵酵母W303-1A采用醋酸鋰轉化法。根據本發明優選的，所述步驟(3)和步驟(4)中的11° P麥汁的制備方法如下大麥芽和小麥芽按重量比3 2混合后，以EBC標準磨進行粉碎，采用浸出糖化法經糖化后，經過濾、煮沸后，制得11° P麥汁。根據本發明進一步優選的，上述糖化的具體步驟為投料溫度為37°C，保持20min ;升溫至45°C保持30min，然后升溫至52°C保持40min ;再升溫至65°C，保持70min ；最后升溫至78°C浸出即可。有益效果本發明首次通過對上面發酵酵母進行基因工程改造獲得具有特殊功能的啤酒酵母，并將該酵母用于啤酒釀造，從而顯著提高了上面發酵小麥啤酒中的4-乙烯基愈創木酚含量，突出了上面發酵小麥典型的丁香花味。該方法為改善啤酒口味和香味提供了新的方法，為基因工程應用于啤酒釀造領域奠定了基礎。


圖I為PCR獲得的PADC基因的電泳圖；其中M為 D2000DNA Marker, 1、2、3、4、5、6、7 為 PADC 基因；圖2為質粒YEp352與PADC基因PCR純化產物的雙酶切電泳圖；其中A為Ikb DNA Maker，B為 YEp352質粒，C為PADC PCR純化產物，D為D2000DNAMaker ；圖3為重組質粒YPADC的構建過程示意圖；圖4為重組質粒YPADC的酶切鑒定電泳其中M為Ikb DNAMarker, I為XbaI和HindIII雙酶切重組質粒YPADC，2為重組質粒YPADC，3為XbaI和HindIII雙酶切質粒YEp352，4為XbaI和HindIII雙酶切PADC基因，5 為 D2000DNAMarker ；圖5為克隆菌株W303+padc的菌落PCR驗證電泳圖；其中M-D2000DNAMarker，I 為出發菌株 W303-1A，2 21 為克隆菌株 W303+padc ；圖6為出發菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc的SDS-PAGE電泳圖；其中M為marker，I為出發菌株W303-1A，2為克隆菌株W303+padc ；圖7為出發菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc酶活性的柱狀對比示意圖；
圖8為出發菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc釀造的啤酒的外觀濃度和雙乙酰含量變化曲線圖；圖9為出發菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc釀造的啤酒的4_乙烯基愈創木酚含量柱狀對比示意圖；圖10為出發菌株W303-1A和克隆菌株W303+padc釀造啤酒的感官品評示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。生物材料來源枯草芽孢桿菌購自上海勒布生物科技有限公司，商品編號為ACCC10627 ；上面發酵啤酒酵母W303-1A購自德國Doemens啤酒學院；內切酶XbaI,內切酶HindIII,質粒YEp352購自Fermentas公司；培養基枯草芽孢桿菌培養基鹿糖30. 0g、磷酸二氫鉀4. 5g、硫酸銨2. 5g、蛋白胨10g、碳酸|丐2g、酵母膏5g和瓊脂20g，然后在IOOOmL水中充分溶解，再121°C高壓滅菌。大腸桿菌E. coli DH5 α培養基LB 酵母提取物58,胰蛋白胨1(^,似(^1(^,溶于9501]11^蒸懼水中，用51 NaOH調pH至7. 0，加蒸餾水定容至IOOOmL (如果配制固體培養基，還需加I. 5wt%的瓊脂)，分裝，121°C高壓滅菌20min。酵母菌培養基YPD (IL):酵母提取物IOg,胰蛋白胨20g,溶于950mL蒸懼水中(如果配制固體培養基，還需加1.5被％的瓊脂)，？!1自然，121°C高壓滅菌20min后，冷卻到55°C，然后加入115°C單獨滅菌30min的葡萄糖溶液，使葡萄糖終濃度為2wt%，蒸餾水定容至1L。SC固體平板培養基(IL):無氨基酸的酵母氮源(YNB) 6. 7g，腺嘌呤50mg，尿嘧啶50mg,組氨酸IOOmg,色氨酸IOOmg,亮氨酸IOOmg,精氨酸20mg,天冬氨酸IOOmg,谷氨酸IOOmg,異亮氨酸30mg,賴氨酸30mg,甲硫氨酸20mg,苯丙氨酸50mg,絲氨酸150mg,蘇氨酸150mg,酪氨酸30mg,纟顏氨酸150mg,調節pH值為6. 5,加入I. 5%的瓊脂,再加入40wt%葡萄糖使之終濃度為2wt%，蒸餾水定容至1L，在121°C下滅菌15min。SCTffa固體平板培養基為省略尿嘧啶的SC固體平板培養基。
設備EBC標準磨購自德國Biihler公司；LB8全自動糖化儀購自Lochner公司；實施例I.枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis DNA的提取挑取枯草芽孢桿菌，接種于枯草芽孢桿菌培養基，36°C震蕩過夜培養。取IOOmL菌液，5000r/min離心lOmin，棄上清液；菌體沉淀用IOmL TE緩沖液(Tris- EDTA緩沖液)懸浮，加O. 5mL10wt%十二烷基硫酸鈉，50 μ L蛋白酶K，混勻，37°C保溫Ih0加I. 5mL5mol/LNaCl，混勻。力卩 I. 5mL CTAB/NaCl 溶液(NaCll. 4M, CTAB2%, Tris · CllOOmM, EDTA20mM，巰基 乙醇O. 2%)，混勻，65°C保溫20min。用等體積抽提液I抽提，抽提液I按酚氯仿異戊醇的體積比為25:24:1混合,5000r/min離心IOmin,移取上清液至干凈離心管,用等體積抽提液II抽提，抽提液II按氯仿異戊醇的體積比為24:1混合，取上清液移至干凈管中。加I倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜置lOmin，10000r/min離心15min得到DNA沉淀。加Λ 700 μ I體積濃度為70%的乙醇，70 μ 13mol/LNaAc漂洗DNA沉淀，溶解于ImL TE緩沖液，-20°C保存。去除RNA :加5 μ LRNase,加1/10體積3mol/LNaAc,加2倍體積無水乙醇IOmin后，將DNA沉淀溶于ImL TE，_20°C保存，制得枯草芽孢桿菌DNA。2.弓丨物設計及PADC基因片段的克隆上游引物F-padc5，~GCGTCTAGAATGGAAAACTTTATCG~3，SEQIDN02下游引物R-padc5，~GCGAAGCTTTTATAATCTTCCCGC~3，SEQIDNO.3上游引物5’端引入XbaI酶切位點(下劃線部分)，下游引物5’端引入HindIII酶切位點(下劃線部分)，由Invitrogen公司合成。以F-padc和R-padc為引物，枯草芽孢桿菌DNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(PCR)，反應體系為50 μ L，具體如下
F-padcI μL
R-padc丨
dNTPs4 nL
Easy Taq I Οχ buffer5 μ
IkiciIIiis subtilis DNA I ,uLddH2037 .uL
Easy Taq DNA Polymerase I μ LPCR 反應程序為94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，52. 6°C退火 30s，72°C延伸 45s，30個循環；72°C延伸IOmin。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖I所示，由圖I可以看出，擴增出了 I條約504bp的特異性片段，符合預期PADC基因片段的大小504bp。3. PCR產物的純化取PCR 產物 200 μ L 和 6xLoading Buffer40 μ L,以及 5 μ L D2000DNA Marker 上樣，跑I. 5%瓊脂糖凝膠電泳。然后，用上海捷瑞生物工程有限公司GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行PCR產物的純化。
4. PCR產物的酶切和連接以限制性內切酶XbaI和HindIII分別將純化的PADCPCR產物和質粒YEp352進行酶切，如圖2所示，反應體系分別為30 μ L和20 μ L0反應混合物要依次加入，輕輕彈擊混合均勻，離心機離心5秒鐘。放37°C水浴。
權利要求
1.一種提高上面發酵小麥啤酒中4-乙烯基愈創木酚含量的方法，其特征在于，步驟如下 Cl)從枯草芽孢桿菌中通過PCR擴增PADC基因，PADC基因核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，PCR擴增引物序列如下 上游引物F-padc5’ -GCG TCTAGA ATGGAAAACTTTATCG-3’ 下游引物R_padc5’ -GCG AAGCTT TTATAATCTTCCCGC-3’ ； (2)將步驟(I)制得的PADC基因經純化后，經內切酶XbaI和內切酶HindIII雙酶切后與同樣經內切酶XbaI和內切酶HindIII雙酶切的質粒YEp352連接，制得重組質粒YPADC，將重組質粒YPADC轉化至上面發酵酵母W303-1A，獲得上面發酵重組酵母菌株W303+padc ； (3)利用11°P麥汁對步驟(2)制得的上面發酵重組酵母菌株W303+padc進行擴大培養，培養條件為25 28°C搖床，220 240r/min，獲得上面發酵酵母W303+padc ； (4)將步驟(3)制得的上面發酵酵母W303+padc接種于11°P麥汁中，在溫度為16 18°C進行發酵培養至糖度為4° P時，密封發酵容器保壓至雙乙酰含量低于O. lmg/L，降溫至O 2°C，保存5 8天，制得4-乙烯基愈創木酚含量為I. 6 I. 8mg/L的啤酒。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I沖，PCR反應程序為94°C預變性3min ;94°C模板變性30s，52. 6°C引物退火30s，72°C引物延伸45s，30個循環；72°C延伸IOmin0
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，重組質粒YPADC轉化上面發酵酵母W303-1A采用醋酸鋰轉化法。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)和步驟(4)中的11°P麥汁的制備方法如下大麥芽和小麥芽按重量比3 2混合后，以EBC標準磨進行粉碎，采用浸出糖化法經糖化后，經過濾、煮沸后，制得11° P麥汁。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，上述糖化的具體步驟為投料溫度為37°C，保持20min ;升溫至45°C保持30min，然后升溫至52°C保持40min ;再升溫至65°C，保持70min ;最后升溫至78°C浸出即可。
全文摘要
本發明公開了一種提高上面發酵小麥啤酒中4-乙烯基愈創木酚含量的方法，將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的PADC基因進行克隆，保留其遺傳特性，使其在大腸桿菌中表達，并將該PADC基因轉化至上面發酵酵母菌株W303-1A中，以構建一株上面發酵啤酒酵母W303+padc。本方法可顯著提高上面發酵小麥啤酒中的4-乙烯基愈創木酚含量，突出小麥啤酒典型的丁香花味。
文檔編號C12R1/125GK102899212SQ20121044486
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年11月8日
發明者崔云前, 周廣田 申請人:山東輕工業學院