專利名稱：用于檢測布魯氏菌的lamp引物及含有該引物的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及布魯氏菌的檢測，具體地說，涉及用于檢測布魯氏菌的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。
背景技術：
布魯氏菌(Brucella)是一種無芽孢、無鞭毛的對人畜有致病力的革蘭陰性胞內寄生菌，是布魯氏菌病(brucellosis,簡稱布病)的病原體。傳統的布魯氏菌種型包括羊種(3個型)、牛種(8個型)、豬種(5個型)、犬種(I個型)、綿羊附睪種(I個型)及沙林鼠種(I個型)，共6個種19個型。感染人的布魯氏菌種以前三種居多。布病患者有發(fā)熱、多汗、肝脾腫大、關節(jié)和全身肌肉痛等癥狀；布病因誤診誤治容易轉為慢性期，慢性期布病病程長， 易復發(fā)或發(fā)生再感染，可導致病人勞動力降低甚至喪失。動物感染后可導致流產、不孕、繁殖成活率下降等。在我國，布病被列為乙類傳染病，羊種、牛種布魯氏菌感染量居多，伴有豬種、犬種菌感染。診斷布病的金標準是分離培養(yǎng)布魯氏菌，然而這種方法風險較大、耗時，陽性率僅為15% 70%。血清學方法雖然是目前國內最普遍的布病檢測方法，但在布魯氏菌感染早期沒有抗體產生時，抗體檢測方法受限，加之存在血清學交叉反應，所以僅靠血清學方法容易出現布病的誤診和漏診。分子生物學方法特別是PCR技術能特異性地檢測到布魯氏菌核酸，而且該方法簡單快速，將該技術用于布魯氏菌的檢測鑒定，可以提高布病臨床診斷的準確性。然而采用常規(guī)PCR方法進行布魯氏菌檢測，對儀器設備(如PCR儀、凝膠成像系統)要求高，投入大，給技術的基層推廣造成了極大障礙。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種便于基層推廣使用的，用于檢測布魯氏菌的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測布魯氏菌(Brucella)的LAMP引物組，其包括外側正向引物F3 :5 ’ -GAACGTGTTGGATTGACCT-3 ’ ；外側反向引物B3 :5’ -TGCTGTTGTCGATGCTATCG-3’ ；及內側正向引物 FIP : 5 ’ -GCAGCCTATGATGCCGATCACTTGATCTGAGCCGTTGCCT-3 ’ ；內側反向引物BIP :5’ -CCACACCCTTCAAGCCGGATAGCCGCTGCGAATAAAGCCAA-3’ ；以及環(huán)引物LB :5’ -AAGGCTTGAAGCTTGCGGA-3’ ；環(huán)引物LF :5，-CCTTCATTGCCAGCAATCTCA-3，。本發(fā)明還提供含有上述LAMP引物組的用于檢測布魯氏菌的試劑盒。前述試劑盒中還包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、甜菜堿、Mg2+、反應緩沖液中的一種或多種。更優(yōu)選地，前述試劑盒還包括標準陽性模板。本發(fā)明進一步提供上述LAMP引物組或試劑盒在檢測布魯氏菌中的應用，包括步驟1)提取樣品中的DNA ;2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行LAMP-PCR擴增反應；3)分析PCR產物，即對上述擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳檢測結果判定樣品中是否含有布魯氏菌。其中，LAMP-PCR反應體系以25 μ I計為
模板DNAΙμ
IOmMdNTPs2.5μ1
20μΜ 引物 FIP2μ1
_7] 20μΜ 引物 BIP2μ1
20μΜ 引物 F30.25μΙ
20μΜ 引物 Β30.25μ1
20μΜ 引物 LBI μ!
20μΜ 引物 LFΙμ
8U4ilBstDNA 聚合酶ΙμΙ
10 X NEB緩沖液2.5μ1
IOOmM MgSO4ΙμΙ
IOOmM甜菜堿ΙμΙ
(JdH2O補足至 25μ1;其中，IOXNEB緩沖液的成分為200mM Tris-HClUOOmM KCl、IOOmM (NH4)2SO4'60mM MgSO4 和 l%Tween 20，以水配制。LAMP-PCR反應條件為63°C 50分鐘，80°C 5分鐘，冰上終止反應。用上述引物組對待測樣品DNA進行恒溫擴增，若電泳檢測結果出現梯狀DNA條帶，則該樣品含有布魯氏菌病菌，若沒有擴增出條帶，則該樣品中不含布魯氏菌病菌。本發(fā)明采用的環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP),其作為一種新型的核酸擴增方法，擺脫了特殊擴增儀器和繁瑣檢測過程的約束，能在6(T65°C左右利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶和4 / 6特異性引物(針對目的片段的6 / 8區(qū)域)對核酸進行高效擴增。與傳統的PCR技術相比，LAMP技術的特異性和靈敏性都更勝一籌。其原理是6(T65°C是雙鏈DNA復性和延伸的最佳溫度范圍，在65°C左右DNA合成處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，因此該溫度下有新合成的DNA。LAMP技術依靠4種特異引物和一種活性較高的鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，使鏈置換DNA反應處于一種動態(tài)循環(huán)中。擴增主要分為兩個階段，一是LAMP反應中起始結構的合成階段，二是后續(xù)擴增循環(huán)階段。任何引物與雙鏈DNA中的任一條鏈進行堿基互補配對延伸時，另一條鏈就會解離成單鏈。上游內部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補單鏈。FIP上的Flc與此單鏈上的Fl為互補結構。自我堿基配對形成環(huán)狀結構。以此鏈為模板。下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結構的單鏈。迅速以3’末端的Fl區(qū)段為起點.以自身為模板，進行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結構，自此完成反應的第一階段。第二階段是擴增循環(huán)階段，以莖環(huán)狀結構為模板，FIP與莖環(huán)的F2c區(qū)結合。開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結構。迅速以3’末端的B I區(qū)段為起點，以自身為模板。進行DNA合成延伸及鏈置換。形成長短不一的2條新莖環(huán)狀結構的DNA，BIP引物上的B2與其雜交。啟動新一輪擴增。且產物DNA長度增加一倍。為增加靈敏性在反應體系中可以另外添加2條環(huán)狀引物LF和LB，它們分別與莖環(huán)狀結構結合啟動鏈置換合成，反復循環(huán)。擴增的最后產物是包括不同數量莖環(huán)結構和長度各異DNA的混合物，且產物DNA為擴增靶序列的交替反向重復序列。環(huán)介導等溫擴增方法結果判定方法包括①肉眼觀察法核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子和反應溶液中的子(Mg2+)結合，生成副產物焦磷酸鎂白色沉淀物。依據此原理，通過肉眼觀察副產物焦磷酸鎂白色沉淀是否產生從而判斷擴增是否發(fā)生。②熒光染料法通過肉眼觀察白色沉淀是否產生來判斷擴增是否發(fā)生存在一定的視覺誤差，而通過添加熒光染料例如SYBR Green I、溴化乙錠(EB)等進行呈色反應，結果更易判定。例如，SYBR Green I熒光染料特異性的與雙鏈DNA的小溝結合后發(fā)出比原來強80(Γ1000倍的熒光。在核酸大量 合成時，SYBR Green I會自動摻入雙鏈DNA中，如果發(fā)生擴增反應，反應結束時混合液由橙色變成綠色，并伴有白色沉淀的產生；反之，反應結束時顏色依然保持SYBR Green I的橙色不變。③瓊脂糖凝膠電泳法根據LAMP原理，LAMP反應的最終產物含有若干倍莖長度的莖環(huán)結構和類似花椰菜的結構。所以，產物在瓊脂糖凝膠上電泳呈現的不是單一條帶，而是典型的梯狀條帶。④濁度儀檢測利用日本榮研株式會社研制的針對LAMP的實時監(jiān)控終點濁度儀對LAMP反應結束后生成的白色沉淀一副產物焦磷酸鎂進行全程監(jiān)控，不僅可以使擴增和檢測一管一步完成，而且使擴增過程更加直觀，可以對產物進行定量。本發(fā)明將LAMP引物恒溫擴增技術用于布魯氏菌病菌的快速檢測，可快速、準確、便捷地檢測出血清標本中的布魯氏菌。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR方法更高，對布魯氏菌的早期預防、病原監(jiān)測等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，更適合用于布魯氏菌病流調現場或基層衛(wèi)生防疫。與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于(一)所選靶序列使得檢測更敏感，更特異。布魯氏菌插入序列IS711在不同布魯氏菌種型中有多個插入位點和不同的拷貝數，而且比較穩(wěn)定。在布魯氏菌主要流行菌種中，羊種布魯氏菌、豬種布魯氏菌均有7個完整的IS711拷貝，牛種菌有6個完整拷貝和I個不完整拷貝。而綿羊附睪種布魯氏菌更有多達38個IS711拷貝。本發(fā)明選取該序列作為靶基因，不僅在目的序列的拷貝數上優(yōu)于其它序列，而且序列中CG含量(50%以上)以及Tm值都非常適合LAMP的引物設計要求。通過對10倍梯度稀釋的布魯氏菌不同種型基因組DNA進行擴增，顯示出靈敏度上的差異，其中對綿羊附睪種布魯氏菌的靈敏度最低。(二)反應時間更短。通過在LAMP體系中添加環(huán)引物，使反應時間縮短近半，反應最快在20min便能出現條帶,而不加入環(huán)引物,反應時間至少需要30min。(三)本發(fā)明構建的LAMP體系不僅可用于布魯氏菌菌株檢測，還可用于臨床標本的早期檢測。
(四)本發(fā)明提供的LAMP檢測方法成本低、設備簡單、使用方便，適合基層大規(guī)模的布病篩查工作。


圖I為 本發(fā)明實施例2的向LAMP產物中加入SYBR Green I染料后肉眼觀察結果；其中，1飛管為布魯氏菌倍比稀釋后擴增結果(呈綠色)，7管為陰性對照(呈橙色)。圖2為本發(fā)明實施例3的LAMP法和常規(guī)PCR法的靈敏度檢測電泳結果；其中，M為IOObp DNA Marker ;1 6分別為濃度范圍IOOpg / μ I-Ifg / μ I的10倍梯度稀釋質粒標準品擴增結果；Ν為空白對照；7 12分別為濃度范圍IOOpg / μ I-Ifg / μ I的常規(guī)PCR10倍梯度稀釋質粒標準品擴增結果。圖3為本發(fā)明實施例4的LAMP特異性電泳檢測結果；其中，M為IOObp DNAMarker ； " θ分別對應的菌株為漢賽巴爾通體、霍亂弧菌、土拉弗朗西斯菌、大腸桿菌 0:157、大腸桿菌0:16、小腸結腸耶爾森菌0:9、金黃葡萄球菌、布魯氏菌5444、1611和13305。
圖4為本發(fā)明實施例4的布魯氏菌6個種19個型標準菌株LAMP檢測電泳結果；其中，M為IOObp DNA Marker ;I 19分別對應布魯氏菌牛8個型，羊3個型，豬5個型，犬、綿羊附睪和沙林鼠各I個型。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例均按照常規(guī)實驗條件，如SambiOOk等分子克隆實驗手冊(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技術規(guī)程,或按照制造廠商所建議的實驗條件。實施例I用于檢測布魯氏菌的LAMP弓丨物組的合成在GenBank中選擇布魯氏菌(Brucella)特異性保守基因一插入序列IS711作為目的基因(GenBank中編號為DQ845343. 1)，根據第141080 141282位的序列通過在線工具http://primerexplorer. jp/e/V4設計、篩選并合成一套參數符合LAMP引物設計要求的引物。其中包括2條內引物(FIP、BIP)，2條外引物(F3、B3)和2條環(huán)引物(LB、LF)。序列見表I :表I布魯氏菌LAMP檢測方法弓I物序列
權利要求
1.用于檢測布魯氏菌(Brucella)的LAMP引物組，其特征在于，其包括 外側正向引物 F3 :5’ -GAACGTGTTGGATTGACCT-3’ ； 外側反向引物 B3 :5’ -TGCTGTTGTCGATGCTATCG-3’ ；及內側正向引物 FIP :5’ -GCAGCCTATGATGCCGATCACTTGATCTGAGCCGTTGCCT-3’ ； 內側反向引物 BIP :5’ -CCACACCCTTCAAGCCGGATAGCCGCTGCGAATAAAGCCAA-3’ ；以及 環(huán)引物 LB :5’ -AAGGCTTGAAGCTTGCGGA-3’ ；環(huán)引物 LF :5’ -CCTTCATTGCCAGCAATCTCA-3’。
2.含有權利要求I所述LAMP引物組的用于檢測布魯氏菌的試劑盒。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、BstDNA聚合酶、甜菜堿、Mg2+、反應緩沖液中的一種或多種。
4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
5.權利要求I所述LAMP引物組或權利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測布魯氏菌中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，包括以下步驟 1)提取樣品中的DNA； 2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行LAMP-PCR擴增反應； 3)分析PCR產物。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，LAMP-PCR反應體系以25μ I計為模板DN AΙμ IOmM dNTPs2.5u.l 20μΜ 引物 FIP2μ1 2_Μ 引物BIP2μ1 20μΜ 引物 F30.25μ1 20μΜ! #Β30.25μ! 20μΜ 引物 LBΙμ 20μΜ 引物 LFΙμ8υ/μ1 Bst DNA聚合崎Ιμ 10 X NEB緩沖液2.5μ1 IOOmM MgSO4ΙμΙIOOmM甜菜堿ΙμΙCidH2O補足至 25μ1; 其中，IOXNEB 緩沖液的成分為200mM Tris-HClUOOmM KCl、IOOmM (NH4) 2S04、60mMMgSO4 和 l%Tween 20，以水配制。
8.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于，LAMP-PCR反應條件為63°C50分鐘，.80 °C 5分鐘，冰上終止反應 。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測布魯氏菌(Brucella)的LAMP引物及含有該引物的試劑盒，所述引物包括2條內引物(FIP、BIP)，2條外引物(F3、B3)和2條環(huán)引物(LB、LF)(如Seq ID No.1-6所示)。本發(fā)明將LAMP引物恒溫擴增技術用于布魯氏菌病菌的快速檢測，可快速、準確、便捷地檢測出血清標本中的布魯氏菌。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR方法更高，對布魯氏菌的早期預防、病原監(jiān)測等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，更適合用于布魯氏菌病流調現場或基層衛(wèi)生防疫。
文檔編號C12Q1/68GK102816847SQ20121029127
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月15日 優(yōu)先權日2012年8月15日
發(fā)明者姜海, 崔步云, 張利, 田國忠, 樸東日, 趙鴻雁 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所