專利名稱：硝普鈉在靈芝深層發酵靈芝酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及靈芝深層發酵技術，特別是硝普鈉(SNP)在靈芝深層發酵次生代謝產物靈芝酸中的應用，提高深層發酵靈芝酸的產量。
背景技術：
靈芝\_Ganoderma Iucidum (Fr. ) Krast (Polyporaceae)]隸屬于非裙菌目(無裙菌目，Aphyllophorales)靈芝科(fefloofe/maiaceae)靈芝屬{Ganoderma),素有“仙草”、“靈丹妙藥”之稱，是一種食藥兼用真菌，在中國、日本、韓國和臺灣地區有著悠久的應用歷史。現代生物學已證明靈芝子實體和菌絲體中含有多糖類、核苷類、氨基酸蛋白質類、三萜類、呋喃類、生物堿類、油脂類、留醇類、有機鍺、無機離子等活性物質，其中靈芝酸是存在于靈芝子實體、菌絲體、孢子粉的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、抗艾滋病病毒、防止動脈硬化和血栓形成、改善高血脂、提高人體免疫力、鎮痛等廣泛的藥理作用，具有很·高的藥用價值。因此，如何利用現代生物學技術提高靈芝多糖和靈芝酸產量一直是微生物學、園藝學和發酵工業的重要研究領域，對醫藥業與農業的發展具有不可估量的價值。目前，靈芝酸主要從靈芝子實體中提取。人工栽培靈芝子實體生產周期長，且生長條件和產品質量不易控制。采用深層發酵培養的方法來獲得靈芝酸，具有生產周期大大地縮短、質量易控制、主要組分和野生靈芝基本一致，且發酵菌絲體中的多糖含量也高于子實體等特點。可見，深層發酵是獲取靈芝酸的一種有效途徑。然而，產量偏低的問題仍是限制靈芝深層液體發酵規模化生產的一個瓶頸。大量的研究表明，在培養基中添加一定濃度的真菌激發子、鈣離子、銅離子、過氧化氫和茉莉酸等信號分子和植物激素均可一定程度提高靈芝酸含量。然而，動物和植物信號分子一氧化氮(NO)在食藥用真菌內的生理生化功能目前國內外尚未展開。

發明內容
本發明的目的在于提供硝普鈉在靈芝深層發酵次生代謝產物靈芝酸中的應用，硝普鈉作為誘導劑誘導靈芝深層發酵靈芝酸，以提高靈芝酸的產量。根據靈芝菌種的發酵特點和生理代謝特性經過廣泛篩選和系統的條件試驗，發現采用一氧化氮(NO)供體硝普鈉(SNP)配制一定濃度的水溶液經過濾除菌后，在靈芝細胞生長的一定階段加至深層發酵液，可以提高靈芝酸的產量。硝普鈉在靈芝深層發酵靈芝酸中的應用，其特征在于硝普鈉作為誘導劑誘導靈芝深層發酵靈芝酸，提高靈芝酸的產量。硝普鈉作為誘導劑誘導靈芝深層發酵靈芝酸的具體做法是，在靈芝深層發酵液培養3 5天時，向發酵液中加入濃度為50mmol/L的硝普鈉水溶液，硝普鈉水溶液與發酵液的體積比為O. 2 1%，繼續培養4 8天后，收獲含靈芝酸的發酵產物。本發明優選技術方案是，發酵液中加入占發酵液體積O. 4%的濃度為50mmol/L硝普鈉水溶液。
本發明的原理是一氧化氮誘導深層發酵培養的靈芝細胞氧化迸發，促進過氧化氫等活性氧的產生，進而誘導靈芝合成次生代謝物相關基因的表達。本發明采用一氧化氮(NO)供體硝普鈉晶體溶于水配制成硝普鈉水溶液作為靈芝深層發酵次生代謝產物的的誘導劑，硝普鈉通過在細胞中緩慢釋放出NO，行使其促進次生代謝物合成的功能，研究結果表明，采用本發明在靈芝發酵液中加入適量的硝普鈉可有效提高靈芝酸產量30 95%。
具體實施例方式硝普鈉(SNP)在提高深層發酵靈芝酸產量中的應用，具體方法如下
I)配制濃度為50mmol/L的硝普鈉(Na2 [Fe (CN) 5則)水溶液；
2)取冰箱保存的靈芝 \_Ganoderma Iucidum (Fr. ) Krast (Polyporaceae)]母種菌絲體接入新鮮的馬鈴薯綜合固體培養基斜面上，置于28°C培養箱中培養7天，將菌絲接入馬鈴薯綜合液體培養基，于恒溫搖床25 30°C，100 160rpm條件下培養2 5天，用分散器將菌絲球打碎即為靈芝種子液。實施例一取靈芝種子液按5%接種量分別接入四個盛有95mL液體培養基(內含葡萄糖2. O克、蛋白胨I. O克、磷酸二氫鉀O. I克、硫酸鎂O. I克)的三角燒瓶中，于恒溫搖床28°C、140rpm培養3天時，分別加入0、0. 2,0. 4、I. OmL濃度為50mmol/L的硝普鈉水溶液，繼續培養6天后，收獲含靈芝酸的發酵產物(發酵液)。發酵液5000rpm離心IOmindX淀在_45°C真空冷凍干燥36h得靈芝菌絲體。四瓶中的靈芝菌絲體各稱取O. 100g，溶解于IOmL無水乙醇中，超聲波提取3次，每次lh，IOOOOrpm離心lOmin，上清液于60°C下水浴蒸干；殘余物用6mL蒸餾水浸提，再用8mL氯仿萃取，氯仿中的靈芝酸用4mL的5% NaHCO3萃取兩次，每次4mL,合并萃取液；再用8mL酸化氯仿(pH 3. O 2. O)振搖萃取；在50°C蒸發氯仿，最后用0.6mL無水乙醇振搖溶解靈芝酸。靈芝酸經756MC紫外可見分光光度計在于245納米吸收峰確定，分別得2. 11毫克、2. 74毫克、4. 20毫克、2. 87毫克靈芝酸。實施例二 取靈芝種子液按5%接種量分別接入四個盛有95mL液體培養基(內含葡萄糖2. O克、蛋白胨I. O克、磷酸二氫鉀O. I克、硫酸鎂O. I克)的三角燒瓶中，于恒溫搖床28°C、140rpm培養5天時，分別加入0、0. 2,0. 4、I. OmL濃度為50mmol/L的硝普鈉水溶液，繼續培養4天后，收獲含靈芝酸的發酵產物(發酵液)。發酵液5000rpm離心IOmindX淀在_45°C真空冷凍干燥36h得靈芝菌絲體。四瓶中的靈芝菌絲體各稱取O. 100g，溶解于IOmL無水乙醇中，超聲波提取3次，每次lh，IOOOOrpm離心lOmin，上清液于60°C下水浴蒸干；殘余物用6mL蒸餾水浸提，再用8mL氯仿萃取，氯仿中的靈芝酸用4mL的5% NaHCO3萃取兩次，每次4mL,合并萃取液；再用8mL酸化氯仿(pH 3. O 2. 0)振搖萃取；在50°C蒸發氯仿，最后用0.6mL無水乙醇振搖溶解靈芝酸。靈芝酸經756MC紫外可見分光光度計在于245納米吸收峰確定，分別得2. 35毫克、2. 96毫克、4. 38毫克、3. 24毫克靈芝酸。實施例三取靈芝種子液按5%接種量分別接入四個盛有95mL液體培養基(內含葡萄糖2. O克、蛋白胨I. O克、磷酸二氫鉀0. I克、硫酸鎂0. I克)的三角燒瓶中，于恒溫搖床28°CU40rpm培養4天時，分別加入0,0. 2,0. 4、I. OmL濃度為50mmol/L的硝普鈉水溶液，繼續培養6天后，收獲含靈芝酸的發酵產物(發酵液)。分別對四瓶中的發酵液進行5000rpm離心IOmin,沉淀在-45 真空冷凍干燥36h得靈芝菌絲體。四瓶中的靈芝菌絲體各稱取O. 100g，溶解于IOmL無水乙醇中，超聲波提取3次，每次lh，IOOOOrpm離心lOmin，上清液于60°C下水浴蒸干；殘余物用6mL蒸餾水浸提，再用SmL氯仿萃取，氯仿中的靈芝酸用4mL的5% NaHCO3萃取兩次，每次4mL,合并萃取液；再用8mL酸化氯仿(pH 3. O 2. O)振搖萃取；在50°C蒸發氯仿，最后用0.6mL無水乙醇振搖溶解靈芝酸。靈芝酸經756MC紫外可見分光光度計在于245納米吸收峰確定，分別得I. 98毫克、2. 82毫克、3. 69毫克、2. 67毫克靈芝酸。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制；任何熟悉本領域的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術內容對本發明技術方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發明技術方案保護的范圍內。·
權利要求
1.硝普鈉在靈芝深層發酵靈芝酸中的應用，其特征在于硝普鈉作為誘導劑誘導靈芝深層發酵靈芝酸，提高靈芝酸的產量。
2.根據權利要求I所述硝普鈉在靈芝深層發酵靈芝酸中的應用，其特征在于硝普鈉作為誘導劑誘導靈芝深層發酵靈芝酸的具體做法是，在靈芝深層發酵液培養3 5天時，向發酵液中加入濃度為50mmol/L的硝普鈉水溶液，硝普鈉水溶液與發酵液的體積比為0. 2 1%，繼續培養4 8天后，收獲含靈芝酸的發酵產物。
3.根據權利要求2所述硝普鈉在靈芝深層發酵靈芝酸中的應用，其特征在于所述硝普鈉水溶液與發酵液的體積比為0. 4%。
全文摘要
本發明公開硝普鈉在靈芝深層發酵靈芝酸中的應用，旨在提高深層發酵靈芝酸產量，硝普鈉作為誘導劑在靈芝深層發酵液培養3～5天時加入以誘導靈芝深層發酵靈芝酸，本發明采用一氧化氮供體硝普鈉晶體溶于水配制成硝普鈉水溶液作為靈芝深層發酵靈芝酸的誘導劑，硝普鈉通過在細胞中緩慢釋放出一氧化氮，行使其促進次生代謝物靈芝酸合成的功能，實驗研究結果表明，采用本發明在靈芝發酵液中加入適量的硝普鈉可有效提高靈芝酸產量30～95%。
文檔編號C12P33/00GK102816824SQ201210299040
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月22日 優先權日2012年8月22日
發明者王松華, 吳高永, 張波, 蔣圣娟, 吳萍, 金光明 申請人:安徽科技學院