專利名稱：一種有效快速提取海洋微藻rna的方法
技術領域：
本發明屬于微藻開發利用技術領域，特別是涉及一種有效快速的提取海洋微藻RNA的方法。
背景技術：
海洋微藻是水體生態系統中主要的初級生產者，占海洋生物物種的40. 86%，有體積小、數量大、細胞結構簡單、生長周期短、生物量大、光合效率高、適應力強、不受氣候限制、易培養等優點，因此受到了人們的廣泛關注。微藻中所含有的微藻油脂、多糖、色素等在水產養殖餌料、能源、醫藥、保健品、化工和環保等方面具有重要經濟價值，因此開發和利用海洋微藻具有重要的意義。而且，微藻中含有大量與有效活性成分相關的基因，因此提取其RNA,再反轉錄成cDNA進行PCR擴增目的基因的方法對于研究相關基因提供了有效途徑。但由于海洋微藻含鹽量高和糖類物質較多等特點，采用提取動物RNA和陸生植物RNA的試劑 盒效果不夠理想。因此，開發出一種快速高效提取海洋微藻RNA的新方法是十分必要的。目前市場上還沒有專門針對海洋微藻的RNA提取試劑盒，而采用已有的植物RNA提取試劑盒的提取效果并不好。原因可能是由于海洋微藻含鹽量高和所含糖類物質較多，從而影響其RNA的提取效果。且現有的方法大都操作步驟繁瑣、需要時間較長、價格較高，而且電泳結果中有雜帶。因此，有必要提供一種簡便、快速、經濟并且效果好的提取海洋微藻RNA的方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種有效快速提取海洋微藻RNA的方法，使提取微藻RNA步驟簡便、快速、經濟實用，能滿足現有技術的上述需求。本發明的提取海洋微藻RNA的方法，其步驟如下將液氮研磨后的微藻樣品加入到溫度為60-65°C的十六烷基三甲基溴化銨和P -巰基乙醇的混合提取液中，再在60-65°C加熱；加熱結束后再加入氯仿、異戊醇混合液，混合后離心；取上清液后再次加入氯仿、異戊醇混合液；混合后離心；取上清液后加入LiCl，混均后放入-80°C條件下沉淀，再離心去除上清液，將沉淀用75%的乙醇洗滌1-2次，待乙醇揮發完全后加入DEPC水溶解完成提??；其中3-巰基乙醇是在使用的時候才與十六烷基三甲基溴化銨混合制成混合提取液。上述混合提取液中十六烷基三甲基溴化銨和P -巰基乙醇體積比為60 :1。上述的氯仿、異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 :1。本發明克服了海洋微藻含鹽量高和所含糖類物質較多對提取植物RNA的影響，較市場上的植物RNA提取試劑盒提取效果更好，不出現雜帶，操作步驟簡便、快速、效果好。
具體實施例方式下面對本發明快速高效的提取海洋微藻RNA的方法做進一步說明。首先所有試劑瓶均需進行DEPC與超純水的混合溶液進行滅菌，兩者的體積比為I :1000,滅菌條件為37°C搖床中滅菌24h，目的是去除環境中的RNA酶，防止提取的目的RNA被降解；其次在I. 5ml離心管中加入600 ill十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和10 yl
3-巰基乙醇，￠-巰基乙醇必須現用現加，原因是￠-巰基乙醇是一種還原劑，可降低氧對細胞產生的氧化損傷，若提前加入則沒有還原作用，在60-65°C的水浴鍋中進行預熱。與此同時將離心好的新鮮藻體放入液氮中，待藻體可以固體狀態取出后，倒出研磨，研磨過程保持一直有液氮，研磨過程防止迸濺而造成樣品損失。將研磨后的微藻樣品放入預熱好的離心管中，加熱lOmin，每隔2min搖勻I次；再加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，渦旋混合后，在4°C條件下進行離心(12000rpm, IOmin);取上清液再次加入等體積的氯仿/異戍醇(24:1)，渦旋混合后，在4°C條件下進行離心(12000rpm, IOmin);取上清液放入新的離心管中，加入IOmoI/L的LiCl，使其終濃度為2mol/L ;放入_80°C條件下沉淀lh，在4°C條件下進行離心(12000rpm, 30min)，去除上清液，用75%的乙醇洗滌2次，帶其揮發完全后加入 30 u IDEPC水溶解10-20min ;測定其純度，準備進行反轉錄。整個過程樣品應始終在碎冰中，操作者帶口罩和手套，防止RNA降解。實施例I首先在I. 5ml離心管中用移液槍加入600 ill十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和IOu I ￠-巰基乙醇，在60-65°C的水浴鍋中進行預熱；其次離心0. 5g新鮮藻體(球等鞭金藻、綠色巴夫藻、小球藻、杜氏鹽藻以及三角褐指藻)放入液氮中，待藻體可以固體狀態取出后，倒出研磨，將研磨后的微藻樣品放入預熱好的離心管中，加熱IOmin ;用移液槍再加入610 V- I的氯仿/異戍醇(24:1),潤旋混合后,在4°C條件下進行離心(12000rpm, IOmin);取上清液500 u I再次加入500 u I的氯仿/異戊醇(24:1)，渦旋混合后，在4°C條件下進行離心(12000rpm, IOmin);取上清液400 U I方文入新的離心管中，加入100 ii I的10mol/L的LiCl，使其終濃度為2mol/L ;放入_80°C條件下沉淀lh，在4°C條件下進行離心(12000rpm，30min)，去除上清液，用75%的乙醇洗滌2次，帶其揮發完全后加入30 ii IDEPC水溶解10-20min,完成RNA的提取。采用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計測定提取的RNA純度和濃度，RNA純度為 I. 868，濃度為 1070ng/u I0一般RNA純度均保持在I. 8-2. 0的有效區間范圍內。若實驗開始未在水浴鍋中進行加熱，其純度往往偏高在2. I左右并且RNA的濃度與加熱后相比較而言要降低50%以上。
權利要求
1.一種有效快速提取海洋微藻RNA的方法，其步驟如下將液氮研磨后的微藻樣品加入到溫度為60-65°C的十六烷基三甲基溴化銨和巰基乙醇的混合提取液中，再在60-65°C加熱；加熱結束后再加入氯仿、異戊醇混合液,混合后離心；取上清液后再次加入氯仿、異戊醇混合液；混合后離心；取上清液后加入LiCl，混均后放入-80°C條件下沉淀，再離心去除上清液，將沉淀用75%的乙醇洗滌1-2次，待乙醇揮發完全后加入DEPC水溶解完成提??；其中β_巰基乙醇是在使用的時候才與十六烷基三甲基溴化銨混合制成混合提取液。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述的混合提取液中十六烷基三甲基溴化銨和β -巰基乙醇的體積比為60 :1。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述的氯仿、異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 =I0
全文摘要
本發明涉及一種有效快速提取海洋微藻RNA的方法，其步驟如下將液氮研磨后的微藻樣品加入到溫度為60-65℃的十六烷基三甲基溴化銨和β-巰基乙醇的混合提取液中，再在60-65℃加熱；加熱結束后再加入氯仿、異戊醇混合液，混合后離心；取上清液后再次加入氯仿、異戊醇混合液；混合后離心；取上清液后加入LiCl，混均后放入-80℃條件下沉淀，再離心去除上清液，將沉淀用75%的乙醇洗滌1-2次，待乙醇揮發完全后加入DEPC水溶解完成提取；其中β-巰基乙醇是在使用的時候才與十六烷基三甲基溴化銨混合制成混合提取液。本發明克服了海洋微藻含鹽量高和所含糖類物質較多對提取植物RNA的影響，較市場上的植物RNA提取試劑盒提取效果更好，不出現雜帶，操作步驟簡便、快速、效果好。
文檔編號C12N15/10GK102776175SQ20121030891
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者李林, 王帥, 鄭立 申請人:國家海洋局第一海洋研究所