專利名稱：一種枯草芽孢桿菌、利用此菌制備的微生物肥料及其制備方法以及此微生物肥料的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農用微生物制劑領域，具體涉及一種新的枯草芽孢桿菌及利用此菌制備的微生物肥料及其制備方法，以及此微生物肥料的應用。
背景技術：
甜瓜枯萎病(Fusariumwilt)是危害甜瓜生產的重要土傳病害，常午發病率為10% -40%，輕者造成植株生長衰弱、結瓜小而少，重者全株枯死。此病是一種世界性的甜瓜病害，遍布整個歐洲以及美洲、亞洲、非洲等地區，危害葉片、莖蔓和果實。發病初期僅有I或2個蔓失水萎蔫，之后根系變褐腐朽，縱剖根莖部可見維管束已褐，引起整株萎 蔫枯死。甜瓜枯萎病由半知菌亞門，絲孢綱，瘤座孢科，鐮孢霉屬的尖鐮孢菌甜瓜專化型(Fusariumaxysporum(Schi.) f. sp. melonisSnyder et Hansen)引起的一種土壤傳播，根部侵入,維管束寄生的系統病害。我國新疆是甜瓜(Cucumis melonL.)種植面積最大且品種資源最豐富的地區，但枯萎病的發生嚴重影響著甜瓜的品質和產量。因枯萎病為土傳病害，藥劑防治相對困難，并且由于長期用藥，病原菌逐漸產生抗藥性，且防治效果日益降低，造成土壤的污染。鑒于化學防治對環境的污染和生態平衡，甜瓜枯萎病的生物防治越來越被重視。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtiles)是一類好氧內生芽孢的革蘭氏陽性細菌,根據菌落形態生理生化特性以及形成芽孢等特點該菌命名為枯草芽孢桿菌。在自然界中廣泛存在，不僅在土壤、植物根際、體表等外界環境中廣泛存在，同時還是植物體內常見的內生細菌對人畜無毒無害，不污染環境，具有顯著的抗菌活性和極強的抗逆能力。枯草芽孢桿菌生長快、營養、簡單，能產生耐熱抗逆的芽孢，其芽孢具有抗逆性強、利于保藏的特點，又能忍受極端的外部環境，而長期存活，可以制成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型或與化學農藥混用而不失活，因此有利于生防菌劑的生產、劑型加工及在環境中的存活定殖與繁殖而且批量生產工藝簡單成本也較低，施用方便，儲存期長，是一種理想的生防微生物。國內外學者在枯草芽孢桿菌防治植物病害方面進行了大量研究，一些枯草芽孢桿菌優勢菌株已經用于防治植物病害應用中。研究認為枯草芽孢桿菌主要通過以下三種方式提高植物對病原菌的抗性(I)可以在植物根際體表或體內及土壤中快速大量繁衍和定殖，有效地排斥阻止和干擾植物病原微生物在植物上的定殖與侵染從而達到抑菌和防病的效果；(2)產生的抗菌物質，對病原菌有一定的殺滅功效；(3)可產生促植物生長的物質，增強植物和根系的生長發育，增強了植物自身的抗病性，從而間接地減少病害發生。如專利號為CN1934241B的中國專利報道了一種具有防治植物病害的拮抗活性的枯草芽孢桿菌菌株，發明人開發了一種可廣泛抗植物病害的、具有強抗真菌活性的新微生物殺真菌劑，其枯草芽孢桿菌EB120顯示出防治集中植物病害的拮抗活性，包括大麥和黃瓜白粉病、辣椒炭疽病、稻瘟病、番茄灰霉病和小麥葉銹病，顯示出良好的應用前景，但對甜瓜枯萎病有無效果尚未報道。又如專利號CN100404664C的專利報道了一株作物青枯病生防枯草芽孢桿菌菌株，該菌株能夠抑制青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的生長，并產生拮抗蛋白，可用于作物青枯病防治方面。以上兩例主要為枯草芽孢桿菌產生拮抗病菌的物質，拮抗物質直接作用于病菌，達到抗病的功效。而對于枯草芽孢桿菌促生抗病的研究卻較少報道。研究內容本發明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌以及利用此菌制備的微生物肥料及其制備方法，該微生物肥料可用于甜瓜種植，此肥料通過促進甜瓜植株和根系的生長發育，增強甜瓜植株的抗病性，而達到降低甜瓜枯萎病的發病率的目的。
本發明通過以下技術方案實現。本發明涉及一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis G_l),于2012年7月16日在湖北武漢武昌路珈山武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2012287。本發明還涉及一種枯草芽孢桿菌微生物肥料，該微生物肥料由枯草芽孢桿菌CCTCC M 2012287經培養發酵后與硅藻土混合、干燥、粉碎而得。本發明還涉及所述枯草芽孢桿菌微生物肥料的制備方法，其特征在于，由如下方法制備而成I)菌種固體斜面培養將枯草芽孢桿菌CCTCC M 2012287菌種接入固體斜面，在斜面培養基中培養，溫度為30-35°C，培養時間16-24小時；2) 一級種子液擴大培養將步驟I)的枯草芽孢桿菌接種到盛有IOOOml-級種子液培養基中搖瓶培養16-24小時，培養溫度30-35°C，轉速200-300轉/分；3) 二級種子液發酵培養按I %接種量將步驟2)種子液接種到200升種子發酵罐中，培養基采用優化培養基，在30-35°C保溫培養16-20個小時，同時輔以轉速200-300轉/分，通氣量O. 5-0. 8立方米/分鐘，進行發酵培養；4)三級種子液發酵培養按10%的接種量將步驟3)的種子液接種到2000升的大發酵罐中，培養基同步驟3)，進行變溫變通氣量條件下培養，當菌體芽孢形成率達到75%并有20%形成獨立芽孢后，發酵過程結束；5)微生物肥料的制備發酵液與硅藻土按質量比5 2-5 3混合，將混合物置入隧道式干燥設備內，在70°C干熱空氣下進行3-4小時干燥，當混合物水分小于5%時烘干結束，粉碎后過100目篩并包裝，微生物肥料制備完成。本制備方法的優選方案是，所述制備步驟1-4中的培養基均采用以下條件滅菌，滅菌溫度121-125°C，15-20分鐘。本制備方法的優選方案是，制備步驟4中所述變溫變通氣量的培養條件為，先30-35°C、通氣量O. 5-0. 8立方米/分鐘、培養20小時，再升溫到37°C、通氣量加大到I. O立方米/分鐘、再培養10-12小時，輔以轉速200-300轉/分進行培養。本制備方法的優選方案是，所述制備步驟I)中斜面培養基配方為蛋白胨10g，酵母粉5g,氯化鈉IOg,瓊脂20g,蒸懼水1000ml,自然pH值。本制備方法的優選方案是，所述制備步驟2)中一級種子液培養基配方為蛋白胨10g，酵母粉5g,氯化鈉IOg,蒸懼水1000ml,自然pH值。本制備方法的優選方案是，所述制備步驟3)或4)中，培養基采用優化培養基，培養基配方如下，玉米粉I. 0-2.0%，麩皮O. 1-0. 5 %，酵母粉O. 1-0. 5 %，磷酸氫二銨O. 01-0. 05%，磷酸氫二鈉 O. 02-0. 08%，磷酸二氫鉀 O. 05-0. 08%，硫酸鈉 O. 03-0. 05%，硝酸鈉 O. 01-0. 05%，硫酸鎂 O. 01-0. 05%，硫酸亞鐵 O. 0001-0. 0003%,PH 值調至 7. 0-7. 2。本發明還涉及一種枯草芽孢桿菌微生物肥料的應用，其特征在于，在種植甜瓜過程中，使用上述枯草芽孢桿菌微生物肥料對降低甜瓜枯萎病發病率方面的應用。制備得到的微生物肥料含菌數檢測方法為，按照常規的稀釋平板法檢測微生物肥料中的活芽孢菌數，稱取干微生物肥料I. O克，加入99毫升無菌水中，進一步稀釋，稀釋到每毫升中僅有200-1000個，然后取O. I毫升稀釋菌液到無菌的固體培養基平板上，進行涂布，在37°C恒溫箱內培養24小時，計算培養皿平板上的菌落數，計數平板重復3次，取計數平板上生長的菌落數的平均值，按以下公式計算微生物肥料中的活菌數
微生物肥料活芽孢數(個/克)=平均每個平板菌落數(個)X IOX樣品稀釋倍數微生物肥料成品質量要求枯草芽孢桿菌芽孢總含量> 30 X IO8個微生物肥料含水量< 5. 0%微生物肥料細度95%以上可過100目篩孔本發明與現有技術相比的有益效果是，提供了一種新的枯草芽孢桿菌，利用其制備的微生物肥料可促進甜瓜植株和根系的生長發育，其中甜瓜植株的株高、莖粗以及成品甜瓜的瓜寬、瓜長、單重均有明顯增加；并且甜瓜的品質有明顯提升、營養成分更高；從而增強了甜瓜植株的抗病性，甜瓜枯萎病的發病率降低50-70%，提高了甜瓜產量、種植效益。
具體實施例方式本發明涉及的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis G-1)，已于2012年7月16日在湖北武漢武昌路珈山武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2012287。實施例I通過以下的方法制備本發明降低甜瓜枯萎病發病率的微生物肥料I、菌種固體斜面培養斜面培養基配方為蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化鈉IOg,瓊脂20g，蒸餾水1000ml，自然pH值，滅菌條件為125 °C、15分鐘；將枯草芽孢桿菌CCTCC M2012287菌種接入固體斜面，培養溫度為35°C，培養時間16h ；2、一級種子液擴大培養將枯草芽孢桿菌接種到盛有IOOOml —級種子液培養基中搖瓶培養16小時，培養溫度35°C，轉速250轉/分；一級種子液培養基配方為蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000ml，自然pH值，滅菌條件為125°C、15分鐘；3、二級種子液發酵培養按1%接種量接種到200升種子發酵罐中，培養基采用優化培養基，培養基配方如下玉米粉I. O %，麩皮O. I %，酵母粉O. I %，磷酸氫二銨O. 01 %，磷酸氫二鈉O. 02 %，磷酸二氫鉀O. 08 %，硫酸鈉O. 03 %，硝酸鈉O. 01 %，硫酸鎂O. 01 %，硫酸亞鐵O. 0001%，PH值調至7. O，滅菌條件為125°C、15分鐘；在30°C保溫培養20個小時，同時輔以轉速250轉/分，通氣量O. 5立方米/分鐘，進行發酵培養；4、三級種子液發酵培養按10%的接種量接種到2000升的大發酵罐中，三級培養基配方同二級培養基配方，培養條件同二級種子液發酵培養，培養時間為20個小時后，升溫到37°C、通氣量加大到I. O立方米/分鐘，再培養12小時，當菌體芽孢形成率達到75%并有20%形成獨立芽孢后，發酵過程結束；5、微生物肥料的制備三級種子液與硅藻土按質量比5 3混合，將混合物置入隧道式干燥設備內，在70°C干熱空氣下進行3-4小時干燥，當混合物水分小于5%時烘干結束，粉碎后過100目篩并包裝，微生物肥料制備完成。實施例2通過以下的方法制備本發明降低甜瓜枯萎病發病率的微生物肥料I.菌種固體斜面培養斜面培養基配方為蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化鈉IOg,瓊脂20g，蒸餾水1000ml，自然pH值，滅菌條件為123 °C、18分鐘；將枯草芽孢桿菌CCTCC M2012287菌種接入固體斜面，培養溫度為35°C，培養時間16h ； 2. 一級種子液擴大培養將枯草芽孢桿菌接種到盛有IOOOml —級種子液培養基中搖瓶培養20小時，培養溫度30°C，300轉/分；一級種子液培養基配方為蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000ml，自然pH值，滅菌條件為123°C、18分鐘；3. 二級種子液發酵培養按I %接種量接種到200升種子發酵罐中，培養基采用優化培養基，培養基配方如下玉米粉1.5%，麩皮0.5%，酵母粉0.3%，磷酸氫二銨0.05%，磷酸氫二鈉O. 05 %，磷酸二氫鉀O. 05 %，硫酸鈉O. 03 %，硝酸鈉O. 01 %，硫酸鎂O. 03 %，硫酸亞鐵O. 0003%, PH值調至7. 0，滅菌條件為123°C、18分鐘；在30°C保溫培養20個小時，同時輔以轉速200轉/分，通氣量O. 6立方米/分鐘，進行發酵培養；4.三級種子液發酵培養按10%的接種量接種到2000升的大發酵罐中，三級培養基配方同二級培養基配方，培養條件同二級種子液發酵培養，培養時間為20個小時后，升溫到37°C、通氣量加大到I. O立方米/分鐘，再培養10小時，當菌體芽孢形成率達到75%并有20%形成獨立芽孢后，發酵過程結束；5.微生物肥料的制備發酵液與硅藻土按質量比2 I混合，將混合物置入隧道式干燥設備內，在70°C干熱空氣下進行3-4小時干燥，當混合物水分小于5%時烘干結束，粉碎后過100目篩并包裝，微生物肥料制備完成。實施例3通過以下的方法制備本發明降低甜瓜枯萎病發病率的微生物肥料I、菌種固體斜面培養斜面培養基配方為蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化鈉IOg,瓊脂20g，蒸餾水1000ml，自然pH值，滅菌條件為121°C、20分鐘；將枯草芽孢桿菌CCTCC M2012287菌種接入固體斜面，培養溫度為30°C，培養時間24h ；2、一級種子液擴大培養將枯草芽孢桿菌接種到盛有IOOOml —級種子液培養基中搖瓶培養16小時，培養溫度35°C，轉速300轉/分；一級種子液培養基配方為蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000ml，自然pH值，滅菌條件為121°C、20分鐘；3、二級種子液發酵培養按1%接種量接種到200升種子發酵罐中，培養基采用優化培養基，培養基配方如下玉米粉2.0%，麩皮O. 1%，酵母粉O. I%，磷酸氫二銨O. 05%,磷酸氫二鈉O. 08 %，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鈉0.05%，硝酸鈉0.05%，硫酸鎂0.05%，硫酸亞鐵O. 0001%，PH值調至7. 2，滅菌條件為121°C、20分鐘；在35°C保溫培養16個小時，同時輔以轉速300轉/分，通氣量O. 8立方米/分鐘，進行發酵培養；4、三級種子液發酵培養按8%的接種量接種到2000升的大發酵罐中，三級培養基配方同二級培養基配方，培養條件同二級種子液發酵培養，培養時間為20個小時后，升溫到37°C、通氣量加大到I. O立方米/分鐘，再培養10小時，當菌體芽孢形成率達到75%并有20%形成獨立芽孢后，發酵過程結束；5、微生物肥料的制備發酵液與硅藻土按質量比2 I混合，將混合物置入隧道式干燥設備內，在70°C干熱空氣下進行3-4小時干燥，當混合物水分小于5%時烘干結束，粉碎后過100目篩并包裝，微生物肥料制備完成。實施例4通過以下的方法制備本發明降低甜瓜枯萎病發病率的微生物肥料I、菌種固體斜面培養斜面培養基配方為蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化鈉IOg,瓊脂20g，蒸餾水1000ml，自然pH值；將枯草芽孢桿菌CCTCC M 2012287菌種接入固體斜面，培養溫度為35°C，培養時間20h ； 2、一級種子液擴大培養將枯草芽孢桿菌接種到盛有IOOOml —級種子液培養基中搖瓶培養24小時，培養溫度30°C，轉速200轉/分；一級種子液培養基配方為蛋白胨10g，酵母粉5g,氯化鈉IOg,蒸懼水IOOOml,自然pH值；3、二級種子液發酵培養按1%接種量接種到200升種子發酵罐中，培養基采用優化培養基，培養基配方如下玉米粉1.0%，麩皮0.3%，酵母粉0.5%，磷酸氫二銨0.05%，磷酸氫二鈉O. 05 %，磷酸二氫鉀O. 05 %，硫酸鈉O. 03 %，硝酸鈉O. 01 %，硫酸鎂O. 03 %，硫酸亞鐵O. 0003%，PH值調至7. O ;在30°C保溫培養20個小時，同時輔以轉速300轉/分，通氣量O. 8立方米/分鐘，進行發酵培養；4、三級種子液發酵培養按10%的接種量接種到2000升的大發酵罐中，三級培養基配方同二級培養基配方，培養條件同二級種子液發酵培養，培養時間為20個小時后，升溫到37°C、通氣量加大到I. O立方米/分鐘，再培養12小時，當菌體芽孢形成率達到75%并有20%形成獨立芽孢后，發酵過程結束；5、微生物肥料的制備發酵液與硅藻土按質量比5 2混合，將混合物置入隧道式干燥設備內，在70°C干熱空氣下進行3-4小時干燥，當混合物水分小于5%時烘干結束，粉碎后過100目篩并包裝，微生物肥料制備完成。實施例5盆栽試驗與田間試驗驗證I、盆栽試驗設置盆栽試驗，種植甜瓜，設置2個處理，處理I為在甜瓜植株雙葉期將本發明制備的枯草芽孢桿菌肥料稀釋100倍，采用罐根方式，每株苗施入稀釋液30ml ;處理2為施入30ml清水對照，盆栽培養15天，測定甜瓜苗的株高、根長、莖粗、根干物質量、地上部分干物質量。如表I所示，試驗結果表明稀釋100倍的枯草芽孢桿菌肥料能明顯提高根長，增加幅度16. 03%，與對照比較達到極顯著差異(P<0.01);莖粗增加幅度6. 54%，與對照比較達到顯著性差異(P < O. 05);根干重增幅達36. 4%，達到極顯著性差異(P < O. 01);枯草芽孢桿菌肥料處理的冠根比遠小于對照，這說明枯草芽孢桿菌肥料處理能促進甜瓜根系的生長。表I枯草芽孢桿菌肥料對甜瓜植株苗期生長的影響
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis G-I)，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌于2012年7月16日在湖北武漢武昌路珈山武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2012287。
2.一種枯草芽孢桿菌微生物肥料，其特征在于，該微生物肥料由枯草芽孢桿菌CCTCC M2012287經培養發酵后與硅藻上混合、干燥、粉碎而得。
3.權利要求2所述枯草芽孢桿菌微生物肥料的制備方法，其特征在于，由如下方法制備而成 1)菌種固體斜面培養將枯草芽孢桿菌CCTCCM 2012287菌種接入固體斜面，在斜面培養基中培養，溫度為30-35°C，培養時間16-24小時； 2)一級種子液擴大培養將步驟I)的枯草芽孢桿菌接種到盛有IOOOml-級種子液培養基中搖瓶培養16-24小時，培養溫度30-35°C，轉速200-300轉/分； 3)二級種子液發酵培養按I %接種量將步驟2)種子液接種到200升種子發酵罐中，培養基采用優化培養基，在30-35°C保溫培養16-20個小時，同時輔以轉速200-300轉/分，通氣量O. 5-0. 8立方米/分鐘，進行發酵培養； 4)三級種子液發酵培養按10%的接種量將步驟3)的種子液接種到2000升的大發酵罐中，培養基同步驟3)，進行變溫變通氣量條件下培養，當菌體芽孢形成率達到75 %并有20%形成獨立芽孢后，發酵過程結束； 5)微生物肥料的制備發酵液與硅藻土按質量比5 2-5 3混合，將混合物置入隧道式干燥設備內，在70°C干熱空氣下進行3-4小時干燥，當混合物水分小于5%時烘干結束，粉碎后過100目篩并包裝，微生物肥料制備完成。
4.根據權利要求3枯草芽孢桿菌微生物肥料的制備方法，其特征在于，所述制備步驟1-4中的培養基均采用以下條件滅菌，滅菌溫度121-125°C，15-20分鐘。
5.根據權利要求3枯草芽孢桿菌微生物肥料的制備方法，其特征在于，制備步驟4中所述變溫變通氣量的培養條件為，先30-35°C、通氣量O. 5-0. 8立方米/分鐘、培養20小時，再升溫到37°C、通氣量加大到I. O立方米/分鐘、再培養10-12小時，輔以轉速200-300轉/分進行培養。
6.根據權利要求3枯草芽孢桿菌微生物肥料的制備方法，其特征在于，制備步驟I)中斜面培養基配方為蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化鈉IOg,瓊脂20g,蒸懼水1000ml,自然pH值。
7.根據權利要求3枯草芽孢桿菌微生物肥料的制備方法，其特征在于，制備步驟2)中一級種子液培養基配方為蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化鈉IOg,蒸懼水1000ml,自然pH值。
8.根據權利要求3枯草芽孢桿菌微生物肥料的制備方法，其特征在于，制備步驟3)或4)中，所述優化培養基配方如下，玉米粉1.0-2. 0%，麩皮O. 1-0. 5%，酵母粉O. 1-0. 5%,磷酸氫二銨O. 01-0. 05 %，磷酸氫二鈉O. 02-0. 08 %，磷酸二氫鉀O. 05-0. 08 %，硫酸鈉O.03-0. 05%，硝酸鈉 O. 01-0. 05%，硫酸鎂 O. 01-0. 05%，硫酸亞鐵 O. 0001-0. 0003%，PH 值調至 7. 0-7. 2。
9.一種枯草芽孢桿菌微生物肥料的應用，其特征在于，在種植甜瓜過程中，使用權利要求2所述的微生物肥料對降低甜瓜枯萎病發病率方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，于2012年7月16日在湖北武漢武昌路珈山武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCM2012287。本發明同時公開了利用此菌制備的微生物肥料及其制備方法以及此微生物肥料在甜瓜種植方面的應用，所述微生物肥料通過促進甜瓜植株和根系的生長發育，增強甜瓜植株的抗病性，而達到降低甜瓜枯萎病的發病率的目的；并且提高了甜瓜的商品瓜產量，且品質有一定的改善。
文檔編號C12R1/125GK102888356SQ201210322029
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月3日 優先權日2012年9月3日
發明者葛春輝, 孫九勝, 王新勇, 楊新華, 馮耀祖, 朱莉, 徐萬里, 唐光木, 孟鳳軒 申請人:新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所