專利名稱：一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法
技術領域：
本發明涉及一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法。
背景技術：
鐵氧化菌是具有重要工業應用價值的微生物，能夠通過氧化酸性環境中的Fe2+、各種還原性硫化物等獲得維持其生長的能量，常見的鐵氧化菌有氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferrooxidans)、嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumfer riphium)、嗜熱氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumthermoferrooxidans)、固氮氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferrodiazotrophum)等,在濕法冶金、脫硫、重金屬污染的治理、酸性礦坑廢水的處理等領域有著重要的應用價值。在實驗室培養和工程應用過程中，鐵氧化菌以菌液的形式接種到新的培養基或反應堆等環境后，往往存在適應時間長，細胞活性恢復慢等問題，特別是工程應用過程中，細胞活性恢復的速度，直接影響到生產的效率和質量。對此，常規的方法是通過改善微生物的外部生長條件，調控保持適宜的溫度、pH、通氣量、接種量等來獲得最佳的細胞活性啟動速度和培養效果。例如，Acidithiobacillusferrooxidans菌液通常以10%的體積比接種到新的9K培養基,在適宜的初始pH(2. O左右)、溫度(30° C左右)下，通氣或震蕩培養。在這種適宜的pH值和溫度下，細菌能正常生長，在一定程度上可縮短細胞的遲緩期，提高生產效率。盡管改善微生物的外部生長條件，能在一定程度上縮短細胞的遲緩期，但其鐵氧化活性啟動速度仍受到一定的限制。Acidithiobacillusferrooxidans菌以10%的體積比接種到新的培養基，在初始pH 2. O、溫度30° C下培養，一般仍需要15-30h的遲緩期，其氧化活性仍然無法較好地滿足工業應用，特別是生物脫硫、生物濕法冶金等應用過程中，由于細胞活性較慢的啟動速度，極大地影響了反應效率和效果。

發明內容
本發明的目的在于克服上述技術缺陷，提出一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培
養方法。本發明通過以下技術方案實現其技術目的菌液中的Fe3+離子對鐵氧化菌具有強烈的抑制作用，本技術發明，利用還原劑將鐵氧化菌菌液中對微生物有抑制作用的Fe3+離子還原，然后再接種到新鮮的培養基或反應堆，或者將菌液接種到新鮮的培養基、反應堆以后，利用還原劑將鐵氧化菌菌液中對微生物有抑制作用的Fe3+離子還原，調節反應體系的酸堿度至合適數值，再在5-35° C溫度下通空氣或搖床進行細胞培養。本發明提供一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法，該方法為利用還原劑將具有亞鐵氧化活性的鐵氧化菌菌液中對微生物有抑制作用的Fe3+離子還原，調整培養體系的離子構成，然后再在5-35° C溫度下通空氣進行細胞培養或搖床進行細胞培養。
上述方法中，所述的具有亞鐵氧化活性的鐵氧化菌優選為氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)> 氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferrooxidans)、嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferriphium)、嗜熱氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumthermoferrooxidans)或固氮氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferrodiazotrophum)。上述提及的菌種,可以在中國工業微生物菌種保藏管理中心(ChinaCenter of Industrial Culture Collection, CICC)、中國典型培養物保藏中心(ChinaCenter of Type Culture Collection, CCTCC)等菌種保藏中心購得。還原劑優選為亞硫酸銨、亞硫酸鉀、硫化鈉、鐵粉、硫化氫、亞硫酸鈉中的任何一種；還原劑的用量優選為O. 02-0. 5mol/L，最優選的加入量為略高于菌液中Fe3+離子摩爾濃度的二分之一。 菌液的接種量優選為體積比1%-50%。具體地，本發明解決其技術問題所采用的具體方法步驟是 (I)取O. 1-50L的具有亞鐵氧化活性的鐵氧化菌菌液，按照O. 02-0. 5mol/L量加入亞硫酸銨、亞硫酸鉀、硫化鈉、鐵粉、硫化氫、亞硫酸鈉中的任何一種還原劑，最佳加入量為略高于菌液中Fe3+離子摩爾濃度的二分之一。(2)輕輕震蕩,使還原劑反應完全,用稀硫酸、氫氧化鈉、氨水等調酸堿性,使其恢復到 pH I. 0-3. O。(3)將步驟(2)得到的菌液按照體積比1%_50%接種到新的液體培養基或反應堆中，5-35° C溫度下，通空氣進行細胞培養或搖床進行細胞培養。另外，本發明解決其技術問題也可采用以下具體方法步驟(I)取O. 1-50L的具有亞鐵氧化活性的鐵氧化菌菌液，按照體積比1%_50%接種到新的液體培養基或反應堆中。(2)按照O. 02-0. 5mol/L量加入亞硫酸銨、亞硫酸鉀、硫化鈉、鐵粉、硫化氫、亞硫酸鈉中的任何一種還原劑，最佳加入量為反應體系中Fe3+離子摩爾濃度的二分之一。(3)使還原劑反應完全,用稀硫酸、氫氧化鈉或氨水等調酸堿性,使其恢復到pH
I.0-3. 0，然后5-35° C溫度下，通空氣進行細胞培養或搖床進行細胞培養。本發明方法中涉及的新的液體培養基為(NH4)2S043g/l，KCl O. lg/1，K2HPO4O. 5g/1，MgSO4 · 7H20 0. 5g/l，Ca(NO3)2 · 4H20 0. 01g/l，10_90g/lFeS04 · 7H20，用稀硫酸、氫氧化鈉、氨水等調酸堿性，使其PH I. 0-3. O。本發明的有益效果是利用還原劑，將反應啟動伊始體系中對微生物有抑制作用的Fe3+離子還原，使其還原成可為細胞生長提供能量的Fe2+，解決了反應體系，特別是新接種的反應體系中Fe3+對微生物的抑制作用，從而更快地啟動鐵氧化菌的反應活性，實現了連續、高效地細胞培養和反應過程，大大提高了生產效率，進一步推動了鐵氧化菌實驗室培養以及生物脫硫、濕法冶金、污染治理等工業領域的規模生產和應用。
具體實施例方式以下結合實施例詳細地說明本發明。實施方案為便于更好的理解本發明，但并非對本發明的限制。實施例I :
配制新的液體培養基(NH4)2S043g/l，KCl O. lg/1，K2HPO4O. 5g/l，MgSO4 · 7H200. 5g/l，Ca (NO3) 2 ·4Η20 0. Olg/1,44. 5g/l FeSO4 · 7H20，用稀硫酸調節 pH 到 2. 0。取 100ml已用培養基培養好的Acidithiobacillusferrooxidans菌液,加入鐵粉O. 45g左右,輕輕震蕩，使菌液中的Fe3+離子全部還原成Fe2+，用稀硫酸調節pH到2. 0，然后將該菌液按照10%體積比，即IOOml菌液接種到900ml新配制的液體培養基中，在30° C左右通空氣或恒溫搖床培養，6-10小時，細胞顯示出較明顯的氧化活性，并開始生長。實施例2 配制新的液體培養基(NH4)2S043g/l，KCl O. lg/1，K2HPO4O. 5g/l，MgSO4 · 7H200. 5g/l, Ca(NO3)2 · 4H20 0. 01g/l，40g/l FeSO4 · 7H20，用稀硫酸調節 pH 到 I. 7。取 200ml已培養好的Leptospirillum ferrooxidans菌液，將菌液接種到1800ml新配制的液體培 養基中，加入亞硫Ife納2g左右，輕輕震湯，使之反應完全，用稀硫Ife調節pH到1.7,然后，在35° C左右通氣或恒溫搖床培養，5-10小時，細胞顯示出較明顯的氧化活性，40-50小時，Fe2+離子幾乎全部被氧化。
權利要求
1.一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法，其特征在于，該方法包括利用還原劑將具有亞鐵氧化活性的鐵氧化菌菌液中對微生物有抑制作用的Fe3+離子還原，調整培養體系的離子構成，然后再在5-35° C溫度下通空氣進行細胞培養或搖床進行細胞培養。
2.根據權利要求I所述的一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法，其特征在于，所述的具有亞鐵氧化活性的鐵氧化菌優選為氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum ferrooxidans)、嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferriphium)、嗜熱氧化亞鐵鉤端螺方定菌(Leptospirillumthermoferrooxidans)或固氮氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferrodiazotrophum)。
3.根據權利要求I所述的一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法，其特征在于，所述的還原劑優選為亞硫酸銨、亞硫酸鉀、硫化鈉、鐵粉、硫化氫、亞硫酸鈉中的任何一種。
4.根據權利要求I或3所述的一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法，其特征在于，所述的還原劑的用量優選為O. 02-0. 5mol/L。
5.根據權利要求I或3所述的一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法，其特征在于，所述的還原劑的加入量為略高于菌液中Fe3+離子摩爾濃度的二分之一。
6.根據權利要求I所述的一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法，其特征在于，所述的菌液的接種量優選為體積比1%_50%。
7.根據權利要求I所述的一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)取O.1-50L的具有亞鐵氧化活性的鐵氧化菌菌液，按照O. 02-0. 5mol/L量加入亞硫酸銨、亞硫酸鉀、硫化鈉、鐵粉、硫化氫、亞硫酸鈉中的任何一種還原劑； (2)輕輕震蕩，使還原劑反應完全，用稀硫酸、氫氧化鈉或氨水等調酸堿性，使其恢復到pH I. 0-3. O ； (3)將步驟(2)得到的菌液按照體積比1%_50%接種到新的液體培養基或反應堆中，5-35° C溫度條件下通空氣進行細胞培養或搖床進行細胞培養。
8.根據權利要求I所述的一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)取O.1-50L的具有亞鐵氧化活性的鐵氧化菌菌液，按照體積比1%_50%接種到新的液體培養基或反應堆中； (2)按照O.02-0. 5mol/L量加入亞硫酸銨、亞硫酸鉀、硫化鈉、鐵粉、硫化氫、亞硫酸鈉中的任何一種還原劑； (3)使還原劑反應完全,用稀硫酸、氫氧化鈉或氨水調酸堿性,使其恢復pHI. 0-3. O,然后5-35° C溫度條件下通空氣進行細胞培養或搖床進行細胞培養。
全文摘要
本發明涉及一種快速啟動鐵氧化菌活性的細胞培養方法。該方法是將鐵氧化菌接種到新鮮的培養基后，利用還原劑將培養基中對微生物有抑制作用的離子全部還原，調整接種菌株后培養基的離子構成，然后再在一定溫度下通空氣或搖床進行細胞培養，該方法技術操作簡單，可有效縮短接種細胞后的延滯期，快速啟動鐵氧化菌的活性，便于實驗室操作及工業連續生產，提高生產效率。
文檔編號C12N1/20GK102796689SQ20121032223
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月4日 優先權日2012年9月4日
發明者王玉建, 李大平, 陶勇, 何曉紅, 王曉梅, 張禮霞 申請人:中國科學院成都生物研究所