在水稻中高效表達Bt蛋白Cry30Fa1的方法
【專利摘要】本發明提供一種在水稻中高效表達Bt蛋白Cry30Fa1的方法，其是在原有蛋白Cry30Fa1（GenBank:ACI22625.1）的基礎上，將編碼該蛋白的基因改造為水稻偏好的密碼子，然后將改造后的基因（Seq?ID?No.1）導入水稻中，蛋白Cry30Fa1在水稻中的表達量，比未改造的基因高，轉基因水稻對褐飛虱的抗性顯著，從而降低農藥的使用量，減少環境污染，具有重要的經濟價值和應用前景。
【專利說明】在水稻中高效表達Bt蛋白Cry30Fa1的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地說，涉及一種在水稻中高效表達Bt蛋白Cry30Fal的方法。
【背景技術】
[0002]揭飛風(Nilaparvata lugens Stdl)又稱揭稻風，屬同翅目(Homoptera),飛風科(Delphacide)，是一種遍布世界的遷飛性害蟲，是危害亞洲稻作區最嚴重的害蟲之一，嚴重影響水稻的產量及其品質，我國褐飛虱的年發生面積為1330-2000萬hm2，大約占水稻種植面積的1/2。褐飛虱對水稻的危害主要表現為以下幾方面:I)成蟲和若蟲群集于稻叢基部，刺吸水稻莖葉韌皮部中汁液，消耗稻株營養；受害重時，稻株下部變黑、腐爛發臭和癱瘓倒狀。2)成蟲產卵時刺傷稻株莖葉組織，形成大量傷口，促使水分由刺傷點向外散失，同時輸導組織破壞，同化作用減弱，加速稻株倒伏。3)褐飛虱還是傳播水稻病毒病的蟲媒，可以傳播或誘發水稻病害。此外，褐飛虱取食或產卵時造成的大量傷口，有利于水稻紋枯病等病菌的侵染；取食危害時排泄的“蜜露”，富含各種糖類和氨基酸，覆蓋在稻株上，易招致病菌的孳生。
[0003]長期以來，主要依賴于化學農藥來防治褐飛虱，但是傳統單藥劑控制方法已經很難滿足現實生產的需求，且濫用化學殺蟲劑會導致環境污染和生態環境破壞等問題。另外，褐飛虱生物型的改變、食物鏈的豐富以及對主治藥劑吡蟲啉等產生抗性的一些因素促使了褐飛虱的反復暴發。因此，世界上許多國家都在不斷挖掘和利用抗褐飛虱基因，進而選育具有持久抗蟲性水稻品種。
[0004]研究者陸續從水稻抗褐飛虱品種中定位了一系列抗飛虱主基因，目前為止，已經鑒定了水稻中35個褐飛虱抗性位點，其中4個已被克隆，并培育出一系列抗褐飛虱水稻品種。另外，對同翅目害蟲具有控制作用的基因，還包括膽固醇氧化酶基因、大豆胰蛋白酶抑制(SKTI)基因和雪花蓮外源凝集素(GNA)基因。由于GNA蛋白對人的毒性極低，但對褐飛虱、黑尾葉蟬有極強的毒殺作用，同時還能抑制蚜蟲的生長，因而已經應用于轉基因水稻中。這些抗性品種的推廣在一定階段緩解了褐飛虱的危害，獲得了較大的經濟效益，也為發展環境友好型和資源節約型農業做出了重要貢獻。
[0005]然而，褐飛虱具有快速演變形成新的生物型以適應新的抗蟲品種的能力，使一系列單一抗性的水稻品種往往很快就被新的生物型所危害，如IR26僅推廣兩年就喪失了抗性，而IR36的抗性也僅維持了 8年。因此，篩選對褐飛虱具有獨特殺蟲機理的新型基因，結合分子輔助選擇技術聚合多個抗蟲基因或QTL，已成為防治褐飛虱危害和減輕抗蟲品種對褐飛虱的選擇壓 力，延長品種使用年限的首要任務。
[0006]蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一種革蘭氏陽性細菌,在形成芽胞的同時能產生對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、同翅目、線蟲等多種害蟲具有特異殺蟲活性的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs),編碼這些蛋白的基因稱為cry或cyt基因。這些殺蟲晶體蛋白具有對人畜無害、環境友好的特點。因此，廣泛應用于農業、林業、衛生等領域的害蟲防治，成為世界上應用最廣、產量最大的微生物殺蟲劑；同時其殺蟲基因已成功地應用到轉基因抗蟲植物中，是轉基因抗蟲植物主要的基因來源。
[0007]編碼殺蟲晶體蛋白的基因稱為cry或cyt基因，由國際Bt殺蟲基因命名委員會正式命名，主要是根據殺蟲基因編碼的氨基酸序列的同源性進行分類；由于氨基酸序列差異與殺蟲特異性及毒力有密切的相關性，命名委員會規定與已知蛋白同源性低于95%即為新的模式基因(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Nei 1-Crickmore/Bt/index, html)。目前，研究者已從世界各地的昆蟲、土壤和植物體表等樣本中分離到數萬株Bt菌株，并從中挖掘出從Cryl~Cry73類殺蟲晶體蛋白，但是對昆蟲高毒力Bt菌株和Cry蛋白卻鮮有報道。
[0008]Bt及其殺蟲晶體蛋白的應用主要集中在三個方面:1)直接工業化生產；2)構建工程菌，進而轉化生產；3)培育轉基因抗蟲植物。目前商業化應用的Cry蛋白主要有CrylAa、CryIAbλ CryIAcΛ CrylC、CrylD、CrylE、CrylF、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry3A、Cry3B, Cry8A, Cry8B和Cry34/Cry35。Bt及其殺蟲晶體蛋白對植物害蟲、衛生害蟲的綠色防治做出了巨大貢獻。
[0009]然而，Cry毒素蛋白的殺蟲譜僅局限于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等特定靶標昆蟲，對于半翅目刺吸式口器的蚜蟲、飛虱、葉蟬等昆蟲只有極少有效Cry毒素的報道。同時，來源于不同物種的基因，在異種受體中的表達效率會受到影響，殺蟲晶體蛋白基因在植物中的表達量、毒力與野生菌株存在顯著差異。為避免抗性昆蟲所造成的損失，提高水稻對褐飛虱的抗性，尋找新的高毒力基因資源是解決這一問題的有效途徑，對我國的生物防治有著十分重要的意義。
[0010]2009年本發明 人從四川省沐川原始森林地區土壤中分離得到的新Bt菌株BtMC28。通過對BtMC28菌株的毒力測試表明，BtMC28對鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲等，均具有極聞的毒力。
[0011]后期通過擴大測試害蟲種類，發現該菌株純蛋白對褐飛虱具有很強的殺蟲活性，在48h的殺蟲校正死亡率為95%。通過對BtMC28菌株所有Cry蛋白生物活性測定，僅殺蟲晶體蛋白Cry30Fal (GenBank:ACI22625.1)蛋白對褐飛虱具有殺蟲活性(48h，LC50為I μ Μ)。在相同背景下，其殺蟲活性相較Powell等所報道的雪花蓮凝集素(GNA)更高(LC5tl為4 μ Μ)，是目前國內外首次發現對褐飛虱具有特異殺蟲活性的Cry類蛋白。該蛋白可用于制備主要針對褐飛虱以及其他蟲害的廣譜Bt殺蟲劑，將其基因序列轉化水稻，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農藥的使用量，減少環境污染，具有重要的經濟價值和應用前景。

【發明內容】

[0012]本發明的目的是提供一種在水稻中高效表達Bt蛋白Cry30Fal的方法。
[0013]為了實現本發明目的，本發明首先提供一種編碼Bt蛋白Cry30Fal的基因，即Cry30Fal基因，其核苷酸序列為:
[0014]i) Seq ID N0.1 ;或
[0015]ii)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質的核苷酸序列；或
[0016]iii)在嚴格條件下與Seq ID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列；
[0017]所述嚴格條件為在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0018]本發明還提供含有Cry30Fal基因的載體、宿主細胞和工程菌。
[0019]本發明還提供Cry30Fal基因或含有該基因的載體在制備轉基因植物(如水稻)中的應用。
[0020]本發明還提供用于擴增Cry30Fal基因的特異性引物對，包括正向引物F5’ -GCGCATATGATGAAGCCGTACCAGAGCGAGAAT-3’ 和反向引物 R5’ -CGGAATTCTTAGTTCACTGGACAAGCAAACGCA-3，。
[0021]本發明還提供一種在水稻中高效表達Bt蛋白Cry30Fal的方法，采用農桿菌介導的方法，將含有Cry30Fal基因的載體轉入水稻(如水稻品種蜀恢818)愈傷組織中，轉化的材料經過共培養-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選高效表達Bt蛋白Cry30Fal的轉基因水稻植株。
[0022]優選地，所述載體為植物雙元表達載體。
[0023]更優選地，所述載體的出發載體為P⑶MAR-Hyg。
[0024]Cry30Fal蛋白的氨基酸組成如表1所示。
[0025]表lCry30Fal蛋白的氨基酸組成
[0026]
【權利要求】
1.編碼Bt蛋白Cry30Fal的基因，其特征在于，其核苷酸序列為:
i)Seq ID N0.1 ;或 ii)SeqID N0.1所示的核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質的核苷酸序列；或 iii)在嚴格條件下與SeqID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴格條件為在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。
2.含有權利要求1所述基因的載體。
3.含有權利要求1所述基因的工程菌。
4.權利要求1所述基因或權利要求2所述載體在制備轉基因植物中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述植物為水稻。
6.用于擴增權利要求1所述基因的特異性引物對，其特征在于，包括正向引物F5’-GCGCATATGATGAAGCCGTACCAGAGCGAGAAT-3’ 和反向引物 R5’ -CGGAATTCTTAGTTCACTGGACAAGCAAACGCA-3，。
7.—種在水稻中高效表達Bt蛋白Cry30Fal的方法，其特征在于，采用農桿菌介導的方法，將權利要求2所述的載體轉入水稻愈傷組織中，轉化的材料經過共培養-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選高效表達Bt蛋白Cry30Fal的轉基因水稻植株。
8.根據權利要 求7所述的方法，其特征在于，所述載體為植物雙元表達載體。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述載體的出發載體為pCDMAR-Hyg。
10.根據權利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，使用的水稻品種為蜀恢818。
【文檔編號】C12N15/32GK103937816SQ201410119119
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月27日 優先權日:2014年3月27日
【發明者】朱軍, 張欽斌, 李平, 鄧其明, 李雙成, 劉懷年, 王世全, 王玲霞, 鄭愛萍 申請人:四川農業大學