專利名稱：用于修復石油污染土壤的微生物的固定化方法
技術領域：
本發明涉及一種用于修復石油污染土壤的微生物的固定化方法，該方法屬于微生物固定化技術，具體地說是一種用于修復石油污染土壤的固定化微生物的固定化方法。
背景技術：
石油污染土壤是石油及石化企業的重要污染之一，其中的石油污染物對人體及環境具有很高的毒害作用。國內外石油污染土壤的處理方法主要有焚燒法、填埋法、堆放法以及生物修復法等。微生物修復技術的核心是高效降解菌對石油污染物的降解作用，降解過程使污染物的成分趨向于更復雜，一些次生代謝物和中間降解產物的毒性更大，游離微生物修復作用的不足就逐漸顯現出來，如單位體積內有效降解菌濃度低、與土著菌競爭處于弱勢、抗毒 性侵害能力差等。而微生物固定化技術可以克服這些缺點和弊端，使修復效果得到大大改
盡
口 ο微生物固定化技術是20世紀80年代興起的一種新型生物技術，是指將游離的細胞(微生物)或酶定位于限定的空間區域內，并使其保持活性且能反復使用的技術。盡管微生物固定化技術被廣泛用于修復受污染的流體介質(如廢水)和半流體介質(如泥漿)環境中，但將其應用于修復受石油污染的非流體介質(如土壤)的研究，國內外報道較少。限制固定化微生物在土壤修復中應用的主要原因是土壤非流體介質本身所具有的復雜性和特殊性，給該技術提出了許多不同于在流體介質中應用固定化技術時所面臨的科學問題，如固定化技術本身存在著不足，如未開發出適用于非流體介質的固定化技術，未開發出廣譜性的固定化技術，尚未解決混合菌的固定化問題，而且缺乏對固定化顆粒的環境安全性評價和對固定化過程中環境因子調控的系統研究；固定化微生物顆粒的載體選擇，如何克服在土壤中固定化顆粒的不可回收性和污染物濃度的非均質性對固定化顆粒造成的沖擊；如何保證吸附法制備的固定化微生物的菌濃度。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提出一種用于修復石油污染土壤的微生物的固定化方法，以解決目前土壤修復過程中的高成本低效率、菌濃不足、引入二次污染這些不足；且天然植物材料可以作為土壤的疏松劑、為微生物修復土壤提供營養物質，為廢棄材料的資源化利用提供一條有效的途徑。本發明解決其技術問題所采取的技術方案是用秸桿材料做載體，在最佳吸附時間、溫度、載體量的條件下，將微生物吸附在秸桿載體上進行固定化，具體按以下步驟實現I.篩選高效石油降解菌從受石油污染的土壤中篩選石油降解菌，得到一株降解率為23%的單菌SM-3，該菌為桿狀菌，測定該菌的生長曲線，該菌株的對數生長期為5-16h，穩定期為16_25h ；
2.以勝利原油為反應底物，測定該原油的標準曲線，用以計算降解率；3.選擇秸桿材料為固定化載體，將秸桿粉碎，過80目篩。4.取粉碎后的秸桿材料3%-5% (V/V)壓實后裝入一定體積的反應釜中，用121 V高壓水蒸汽滅菌20min，然后將用牛肉膏蛋白胨液體培養基活化16h后的密度為1X1010-5X1010個/mL的菌液SM-3按20% (V/V)接到反應釜中，于30 40°C恒溫固定12 24h ；固定化所用到的菌為SM-3，將該菌用牛肉膏蛋白胨液體培養基培養至對數生長期和穩定期交界點(16h)，其游離狀態下對原油的降解率為23% ；所述牛肉膏蛋白胨液體培養基的配方為NaCl 1% (m/m),蛋白胨1% (m/m),牛肉膏O. 5% (m/m)和一定體積的蒸餾水混合均勻，以pH試紙為指示，用NaOH或鹽酸調節調節ρΗ7· 0,121°C水蒸氣滅菌20min。
5.把固定了菌的3% -5% (V/V)載體連帶未被固定的菌液一起轉移到離心杯中，在1000r/min下離心IOmin,倒掉上層菌液,將下層載體無菌操作完全轉移至事先準備好的原油培養基中，30°C恒溫降解7d，降解率可達到60%，比游離菌提高近40% ；所述原油培養基的配制方法是先在一定體積的反應釜中稱取O. 4% (m/m)左右的原油，記錄準確質量，再量取20% (V/V)基礎無機鹽培養基至稱好原油的反應釜中，本底油濃度約為10000mg/L ;基礎無機鹽培養基的配方為NaCl 0. 5% (m/m),MgSO4 ·7Η20 0. 025%(m/m), (NH4)2SO4O. 1% (m/m),NaNO3O. 2% (m/m)，K2HPO4 ·3Η20 1% (m/m),KH2PO4O. 4% (m/m)和一定體積的蒸餾水混合均勻，以pH試紙為指示，用NaOH或鹽酸調節pH至7-7. 5，121 °C水蒸氣滅菌20min。6.對固定化前的樹葉進行BET表征，對固定化前和固定微生物后降解前后的樹葉進行電鏡掃描，得到該載體的內部結構性能，評價其固定化效果。本發明的有益效果是由于本發明應用吸附法制備固定化微生物，直接向滅完菌的秸桿材料載體中加入菌液吸附固定，因此，不需要繁瑣的制備工藝，將固定有微生物的秸桿材料直接投加到被石油污染的土壤，不會引入二次污染，不需要回收，不涉及到重復利用的問題，對原油的降解率較游離菌提高近40%，降低了成本、提高修復效率。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
來進一步描述本發明。本發明所述的微生物的固定化方法是用秸桿材料做載體，在最佳吸附時間、溫度、載體量的條件下，將微生物吸附在秸桿載體上進行固定化，具體步驟如下I.篩選高效石油降解菌，測定細菌生長曲線。2.測定原油標準曲線，用以計算降解率。3.對秸桿材料進行成分分析，測得其有效磷、總氮和有機質的含量分別為0. 508%。(508. 38mg · kg-1)、5. 58% (wt)和 5· 24% (wt)。4.以秸桿材料為固定化載體，用平板計數法分別考察吸附時間、溫度、搖床轉速和載體量對吸菌量的影響，計算固定率，結合實驗條件下制備的樹葉固定化微生物對原油的降解率，確定出在一定體積的反應釜中，當吸附時間為12-24h，溫度為30-40°C，載體量為3% -5% (V/V)，菌液為20% (V/V)時，其固定率和原油降解率較好；在固定化時間為15h，固定化溫度為30°C，載體量為4% (V/V)時，固定化效果最好。5.制備最佳條件下的樹葉固定化菌，即在一定體積的反應釜中，載體量4% (V/V)，接菌量20%，固定化時間15h，固定化溫度30°C。將固定微生物后的4% (V/V)載體去掉上層菌液后，無菌操作完全轉移至準備好的原油培養基中，30°C恒溫降解7d，降解率可達到60%，比游離菌提高近40%。所述的原油培養基的配制方法是先在一定體積的反應釜中稱取O. 4% (m/m)左右的原油，記錄準確質量，再量取20% (V/V)基礎無機鹽培養基至稱好原油的反應釜中，本底油濃度約為10000mg/L ;基礎無機鹽培養基的配方為NaClO. 5%(m/m)，MgSO4 ·7Η20 O. 025% (m/m), (NH4)2SO4O. 1% (m/m), NaNO3O. 2% (m/m)，K2HPO4 ·3H20I % (m/m), KH2PO4O. 4% (m/m)和一定體積的蒸懼水混合均勻，以pH試紙為指不,用NaOH或鹽酸調節PH至7-7. 5，121°C水蒸氣滅菌20min。對固定化前的樹葉進行BET表征，測得其比表面積為2. 0988m2 · g—1，孔容O. 0030cm3 · g'孔徑6. 585nm,表明稻桿材料只有簡單的介孔結構,材料主要通過表面吸附來實現對細菌的固定；對固定化前和固定微生物后降解前后的樹葉進行電鏡掃描，結果表 明孔結構主要為柱狀孔，細菌主要吸附在樹葉的表面，降解之后的材料結構會變的疏松，菌易脫落，不能重復利用，但是由于其無污染、不需回收，可以滿足土壤修復的應用。本發明在確定適宜的載體材料和固定化工藝的基礎上，提出了一種能保證微生物菌濃度、不用回收的用于修復石油污染土壤的固定化微生物的制備方法。
權利要求
1.一種用于修復石油污染土壤的微生物的固定化方法，該方法是采用秸桿材料載體，在控制吸附時間、溫度、轉速、載體量的條件下，將微生物吸附在秸桿材料載體上進行固定化，其特征在于實施該法的具體驟如下 1)從受石油污染的土壤中篩選石油降解菌，得到一株降解率為23%的單菌SM-3，該菌為桿狀菌，測定該菌的生長曲線，該菌株的對數生長期為5-16h，穩定期為16-25h ； 2)以勝利原油為反應底物，測定該原油的標準曲線，用以計算降解率； 3)選擇稻桿材料為固定化載體，將稻桿材料粉碎，過80目篩； 4)取粉碎后的秸桿材料按3%-5%(V/V)壓實后裝入一定體積的反應釜中，用121°C高壓水蒸汽滅菌20min，然后將用牛肉膏蛋白胨液體培養基活化16h后的密度為1X1010-5X1010個/mL的菌液SM-3按20% (V/V)接到反應釜中，于30 40°C恒溫固定.12 24h ； 固定化所用到的菌為SM-3，將該菌用牛肉膏蛋白胨液體培養基培養至對數生長期和穩定期交界點(16h)，其游離狀態下對原油的降解率為23% ； 所述牛肉膏蛋白胨液體培養基的配方為NaCl 1% (m/m),蛋白胨1% (m/m),牛肉膏O.5% (m/m)和一定體積的蒸懼水混合均勻，以pH試紙為指示,用NaOH或鹽酸調節調節pH7. 0,121 °C水蒸氣滅菌 20min ； 5)把固定了菌液的3%-5%(V/V)載體連帶未被固定的菌液一起轉移到離心杯中，在1000r/min下離心IOmin,倒掉上層菌液,將下層載體無菌操作完全轉移至事先準備好的原油培養基中，30°C恒溫降解7d，降解率可達到60%，比游離菌提高近40% ； 所述原油培養基的配制方法是先在一定體積的反應爸中稱取O. 4%(m/m)左右的原油，記錄準確質量，再量取20% (V/V)基礎無機鹽培養基至稱好原油的反應釜中，本底油濃度約為10000mg/L ;基礎無機鹽培養基的配方為NaCl 0. 5 (m/m), MgSO4 · 7H20 O. 025% (m/m), (NH4) 2S040. I % (m/m), NaNO3O. 2% (m/m), K2HPO4 · 3H201% (m/m), KH2PO4O. 4% (m/m)和一定體積的蒸餾水混合均勻，以pH試紙為指示，用NaOH或鹽酸調節pH至7-7. 5，121 °C水蒸氣滅菌20min。
全文摘要
本發明公開了一種用于修復石油污染土壤的微生物的固定化方法，它是選擇秸稈為載體，在固定化時間為15h、固定化溫度為30℃、轉速為160r/min和載體量:菌量=1:4-7的最佳吸附條件下，將微生物吸附在秸稈材料載體上進行固定化，將固定有微生物的秸稈材料直接投加到被石油污染的土壤，不會引入二次污染，不需要回收，不涉及到重復利用的問題，對原油的降解率較游離菌提高近40％。本發明為廢棄農作物的資源化利用提供一條有效的途徑。
文檔編號C12N11/14GK102876655SQ20121033136
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者張秀霞, 耿春香, 趙朝成, 秦麗姣 申請人:中國石油天然氣股份有限公司, 中國石油大學(華東)