專利名稱：呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其應(yīng)用，尤其是呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體及其應(yīng)用，屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硝基呋喃類藥物是人工合成的廣譜抗生素，它有非常好的抗菌作用和藥動(dòng)力學(xué)的特征，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用作為畜、禽、人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品的促生長(zhǎng)添加劑。但通過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物和代謝物均可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生癌變和基因突變，并由此推斷，人類長(zhǎng)期使用該類藥物或長(zhǎng)期食用添加該類促生長(zhǎng)劑的畜、禽、人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品，同樣也可發(fā)生癌變和基因突變，所以此類藥物禁止在治療動(dòng)物疾病和飼料中使用。
我國(guó)于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令，在農(nóng)業(yè)部發(fā)布的193號(hào)公告的《食品動(dòng)物禁用獸藥及其它化合物清單》中，硝基呋喃類抗生素在所有食品動(dòng)物和所有用途中都被禁止使用。歐盟委員會(huì)于2003年通過(guò)了 2003/181/EC委員會(huì)決議，建立了用于檢測(cè)禽肉產(chǎn)品和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物和各種方法的最小要求性能限值 (Minimum Required Performance Limits, MRPL)為 I μ g/kg,歐盟從第三國(guó)進(jìn)口的動(dòng)物性產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物的含量不得超過(guò)I μ g/kg。2004年美國(guó)FDA公布了禁止在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中使用的11種藥物名單，其中包括呋喃它酮。因此，為確保動(dòng)物源性食品的安全和對(duì)外出口貿(mào)易的發(fā)展，必須確立準(zhǔn)確可靠，靈敏度高的定性定量方法。據(jù)申請(qǐng)人了解，申請(qǐng)?zhí)枮?00610127111.4，申請(qǐng)日為2006年9月7日，名稱為《單克隆抗體介導(dǎo)的呋喃它酮?dú)埩魴z測(cè)方法及其應(yīng)用》的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)中，公開(kāi)了利用呋喃它酮的單克隆抗體檢測(cè)呋喃它酮?dú)埩?，由于呋喃它酮在體內(nèi)很快就能被代謝，而在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物是5-嗎啉基甲基-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)則能存留較長(zhǎng)的一段時(shí)間，所以該方法不能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)呋喃它酮的殘留。因此在分析此類藥物的殘留時(shí)經(jīng)常要分析其代謝后的產(chǎn)物，檢測(cè)監(jiān)管部門就以檢測(cè)代謝物為手段達(dá)到檢測(cè)呋喃它酮?dú)埩舻哪康?。目前用于呋喃它酮?dú)埩魳?biāo)示物AMOZ的檢測(cè)方法有液液萃取-高效液相色譜、固相萃取_高效液相色譜法、 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀方法等。由于儀器方法所需儀器價(jià)格昂貴，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)操作人員的要求較高，難于在基層單位推廣，不適合高通量的樣品快速篩選。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，提出一種呋喃它酮代謝物衍生物的單克隆抗體，并將該單克隆抗體應(yīng)用于檢測(cè)呋喃它酮代謝物殘留。該方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、高通量、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。
本發(fā)明所涉及的雜交瘤細(xì)胞株4B10已于2011年7月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)是CGMCC No. 5073，分類命名為抗呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
由以上雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體命名為4B10’，其制備步驟如下a.制備免疫原和包被原采用間醛基苯甲酸法將載體蛋白與呋喃它酮代謝產(chǎn)物小分子偶聯(lián)，合成免疫原和包被原；b.動(dòng)物免疫注射以Balb/c鼠作為免疫動(dòng)物，免疫途徑為頸背部皮下多點(diǎn)注射，融合前的超強(qiáng)免疫途徑為腹腔免疫；c.篩選動(dòng)物免疫血清用間接酶聯(lián)免疫吸附法和競(jìng)爭(zhēng)間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選免疫鼠血清；d.制備雜交瘤細(xì)胞取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,經(jīng)過(guò)亞克隆獲得可以穩(wěn)定分泌抗呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4B10 ；e.制備并純化單克隆抗體對(duì)小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞4B10，采集腹水，對(duì)腹水進(jìn)行液相層析純化，獲得呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體4B10’。
其中，步驟a所述載體蛋白為牛血清白蛋白和卵清白蛋白，對(duì)應(yīng)的免疫原為 AMOZ-BSA,包被原為AMOZ-OVA ;所述間醛基苯甲酸法中，交聯(lián)劑活化載體小分子衍生物的時(shí)間為廣2 h，用呋喃它酮代謝物小分子衍生物與載體蛋白偶聯(lián)反應(yīng)1(T15 h。所述步驟b 中的各次免疫注射劑量為100 μ g/只。所述步驟e中對(duì)免疫小鼠腹腔進(jìn)行單克隆抗體細(xì)胞株的注射量為(I 5) X IO6個(gè)/只。
通過(guò)亞型鑒定得出本發(fā)明單克隆抗體的亞型為IgGl型。
常規(guī)制備呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體的方法主要是通過(guò)藥物的羧基與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，本發(fā)明是將呋喃它酮代謝物小分子通過(guò)間醛基苯甲酸進(jìn)行衍生化并將衍生產(chǎn)物的羧基通過(guò)混合多元酸酐法與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，這樣，該法合成的完全抗原， 通過(guò)“交聯(lián)臂”間醛基苯甲酸的作用，可以將呋喃它酮代謝物小分子充分暴露出來(lái)，使機(jī)體更容易識(shí)別該抗原決定簇，提高抗原的免疫原性，在后期篩選過(guò)程中可以獲得針對(duì)呋喃它酮代謝物衍生物的抗體。呋喃它酮代謝物衍生物結(jié)構(gòu)式如下HOOC 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該單克隆抗體在制備檢測(cè)呋喃它酮代謝物中的應(yīng)用，主要是將其應(yīng)用于制備呋喃它酮代謝物殘留的檢測(cè)試劑盒和膠體金試條紙。
本發(fā)明的有益效果是通過(guò)小鼠雜交瘤細(xì)胞株4B10產(chǎn)生的單克隆抗體4B10’，該抗體與其它呋喃類代謝物衍生物交叉反應(yīng)率低，能夠大量生產(chǎn)，并可用于制備檢測(cè)呋喃它酮代謝物的酶聯(lián)免疫分析法試劑盒和膠體金試紙條，達(dá)到快速、特異、且靈敏地檢測(cè)牛奶， 肌肉及水產(chǎn)品中的呋喃它酮代謝物殘留的目的，為檢測(cè)呋喃它酮代謝物殘留的試劑盒研制奠定基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例一中免疫原的OD335標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例一中包被原的OD335標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一試劑與材料準(zhǔn)備鹽酸呋喃它酮(AM，上海安譜科學(xué)儀器有限公司，C13963000)呋喃它酮代謝物(ΑΜ0Ζ， 上海安譜科學(xué)儀器有限公司，⑶E0-NF003);間醛基苯甲酸(Alfa B21277) ；DMF (sigma, D4551)，牛血清白蛋白(BSA) (Jackson，001-000-173)，卵清白蛋白(OVA) (Sigma, A5503), 弗氏完全佐劑(Sigma, F5881)，弗氏不完全佐劑(Sigma, F5506)，四甲基聯(lián)苯胺(TMB) (Amresco, 0759)，HAT (Sigma, H0262)和 HT (Sigma, H0137)，氯化鈉(Amresco, 0241)，氯化鉀(Amresco, 0395),磷酸二氫鉀(Sigma, P9791),磷酸氫二鈉(Sigma, 71639),羊抗鼠 IgG-HRP (Jackson, 115-035-044)，二甲基亞砜(DMSO) (Applichem, 0231)，聚乙二醇 4000 (PEG4000) (Sigma, P7306), DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco, C20270)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞Balb/c鼠(6-8周齡，雌性)，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物中心，SP2/0 (小鼠骨髓瘤細(xì)胞)由中科院生物物理研究所感染與免疫研究中心唐捷教授惠贈(zèng)。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟如下a. 制備免疫原AMOZ-BSA和包被原AM0Z-0VA 本發(fā)明所述的人工抗原采用間醛基苯甲酸法將AOMZ衍生化，并利用AMOZ衍生物上的羧基和載體蛋白上的氨基進(jìn)行偶聯(lián)，從而合成呋喃它酮抗原。
—、完全抗原合成I、將2 mg呋喃它酮代謝產(chǎn)物小分子標(biāo)準(zhǔn)品與2. 7 mg間醛基苯甲酸在I. 5 mL吡啶溶液中15°C震蕩反應(yīng)24 h。
2、將反應(yīng)液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后溶于400 μ L DMF溶液中，加三丁胺5 μ ，冰浴振湯10 min后，加氣甲酸異丁酷3 μ I冰浴振湯I(xiàn) h。
3、于冰浴條件下將反應(yīng)產(chǎn)物緩慢滴加入BSA溶液或OVA溶液，滴加完畢后4°C攪拌反應(yīng)24 h。
4、在 0. 01 M pH 7. 4 的 PBS 中透析。
二、免疫原及包被原偶聯(lián)比測(cè)定免疫原與包被原偶聯(lián)比測(cè)定方法三硝基苯磺酸法(TNBS法)，具體過(guò)程如下I、將載體蛋白BSA或OVA溶解在0. I Μ,ρΗ 8. 5碳酸氫鈉溶液中，配制成O μ g/mL, 20 μ g/mL, 40 μ g/mL, 60 μ g/mL, 80 μ g/mL, 100 μ g/mL, 120 μ g/mL 共 7 個(gè)濃度梯度(用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線)；同時(shí)，將待測(cè)樣品按同樣的方法配制成150 μ g/mL的濃度。
2、將TNBS溶解于0. I M，pH 8. 5碳酸氫鈉溶液中，配制成0. 01% (w/v)溶液。
3、將0. 5 mL TNBS溶液分別加入I mL 6個(gè)標(biāo)樣和I個(gè)待測(cè)樣品中，混勻，37°C下孵育2 h。
4、在上述 7 個(gè)樣品中加入 0. 5 mL 10% SDS 和 0. 25 mL I N HCL。
5,335 nm處測(cè)定各樣品的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算待測(cè)樣品中伯胺含量。
表I BSA與OVA標(biāo)準(zhǔn)樣的OD33權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生呋喃它酮代謝物衍生物的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4B10，是小鼠雜交 瘤細(xì)胞系 CGMCC No. 5073。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述雜交瘤細(xì)胞株4B10產(chǎn)生的單克隆抗體4B10’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述單克隆抗體4B10’，其特征在于所述單克隆抗體亞型為IgGl型。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述單克隆抗體4B10’在檢測(cè)呋喃它酮代謝物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其應(yīng)用，尤其是呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體及其應(yīng)用，屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的呋喃它酮代謝物衍生物單克隆抗體4B10’是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株4B10產(chǎn)生，其亞型是IgG1型。本發(fā)明的有益效果是通過(guò)小鼠雜交瘤細(xì)胞株4B10產(chǎn)生的單克隆抗體4B10’，能夠大量生產(chǎn)，可用于制備檢測(cè)呋喃它酮代謝物的酶聯(lián)免疫分析法試劑盒和膠體金試紙條，達(dá)到快速且靈敏地檢測(cè)肌肉、牛奶、及水產(chǎn)品中的呋喃它酮代謝物的目的。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102936583SQ201210335960
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者唐宏, 崔迎利, 王曉艷 申請(qǐng)人:泰州康正生物技術(shù)有限公司