專利名稱：一種檢測活動性肺結核病的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于血清生物學標志物研究，涉及檢測活動性肺結核病特異的miRNA的試劑盒，通過一種能鑒定活動性肺結核病特異的miRNA去捕獲血清生物學標志物，并用有定量控制的miRNA分析，在血清中檢測活動性肺結核病。
背景技術：
肺結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性肺部感染性疾病，是嚴重威脅人類健康的疾病。中國流行形勢十分嚴峻；現有活動性肺結核病患者約130萬例，新發病例145萬例/年，每年新發病例占全球人口總數的18%，死亡人數達13萬例/年，超過了其他傳染病死亡人數的總和。肺結核病的高發病和死亡率，以及通過空氣傳播,對病人、病人所接觸的事物和社會都產生相當大的負擔。因此，對肺結核病患者及時早期診斷是控制傳染源，遏制肺結核病流行的最重要措施。目前，臨床常規應用的診斷方法均有顯著缺陷，如痰涂片檢測一靈敏度低；結核分支桿菌培養一陽性率低(約30%)且耗時久(長達6-8周);胸部X線檢查一無肺結核病特征性改變；PCR檢測一假陽性和假陰性均高；結核菌素試驗一不能區分結核自然感染和卡介苗接種；血清結核抗體檢測一靈敏度和特異性均不理想。因此，迫切需要發現一種特異性強的新的生物學標志物，建立快速、敏感、高效的診斷技術，防止肺結核疾病蔓延。 近年來研究表明，血清中的miRNAs能作為診斷疾病的候選生物學標志物，研究涉及前列腺癌、肝癌、肺癌、大腸直腸癌、乳腺癌、白血病及卵巢癌等多種腫瘤，且血清是方便和容易得到的樣品，從血清中尋找疾病生物標志物一直以來是人們研究的熱點。由于miRNAs不易在血液中被各種酶降解，并且具有組織和細胞特異性，能夠用于疾病分子診斷和疾病預后預測，適合作為疾病的候選生物學標志物。根據疾病生物標志物研究的要求，應用1-2個miRNAs作為疾病標志物，特異性低。同時由于不同患者的個體差異，使得僅用1-2個miRNAs判斷疾病顯得極不可靠。應該篩選出一組miRNAs,建立miRNAs的組合物可使結果更加可靠。所以，研究活動性肺結核病患者特異的血清miRNAs的組合物，作為生物標志物，對早期診斷肺結核病具有重要的意義。然而，目前尚無肺結核病特異血清miRNAs組合物的研究報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測活動性肺結核病的診斷試劑盒，該試劑盒由RNA提取緩沖液，活動性肺結核病特異的血清miRNA組合物、內參反轉錄引物、PCR引物以及熒光定量RT-PCR反應液構成，其中活動性肺結核病特異的血清miRNA組合物由4個差異表達的血清 miRNAs 組成hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101。RNA提取緩沖液=QIAzof Lysis Reagent、氯仿、無水乙醇、RffT溶液、RPE溶液和RNAase-free 水。熒光定量RT-PCR反應液包括反轉錄和熒光定量PCR反應液；反轉錄反應液總RNA、反轉錄引物(2 μΜ)、5Χ反應緩沖液、dNTP (10 mM)、RNase抑制劑、反轉錄酶；熒光定量 PCR 反應液SYBR>re iz 位 Taq (Tli RnaseH Plus) (2X )、PCR 上游引物(10 μ Μ)、PCR 下游引物(10 μ Μ)、ROX Reference Dye (50X )、模板 cDNA 和 ddH20。逆轉錄引物序列為
hsa-miR-29c :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’ ；hsa-miR-101 :5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3，；內參hsa-miR-16 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’。PCR上游引物序列
hsa-miR-29c :5’ -GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA-3’ ；hsa-miR-101 :5’ -GGGTACTGTGATAACTGAAGG-3’ ；
內參 hsa-miR-16 :5，-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT—3，。 PCR 通用的下游引物是5’ -AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。試劑盒的使用方法提取活動性肺結核病患者與健康對照者、肺炎、肺癌和慢性阻塞性肺病患者血清中的總RNA ;應用血清miRNA組合物hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101的特異反轉錄引物對樣本的總RNA進行反轉錄得到cDNA ；應用PCR特異引物進行SYBR Green染料熒光定量PCR檢測樣本中血清miRNA的表達水平；應用MedCalc軟件和Logistic逐步回歸模型，分析血清組合物hsa-miR-29c、hsa_miR-22、hsa-miR-320b 和 hsa-miR-101 的 ROC 曲線，曲線下面積(AUC)是 O. 911 (P < O. 0001,95%Cl = O. 847-0. 954)，靈敏度為90. 2%、特異性為75. 0%，表明該特異血清miRNAs組合物診斷活動性肺結核病具有較高的準確性。本發明的另一個目的是提供所述的試劑盒在活動性肺結核病血清檢測中的應用。本發明試劑盒具有以下優點(I)本發明采用活動性肺結核病的特異血清miRNAs組合，可應用于活動性肺結核病血清的早期檢測，為活動性肺結核病的早期診斷提供了新的方法。并為開發miRNAs診斷試劑盒奠定了基礎；(2)與以往傳統的結核桿菌檢測等方法相比，本發明是一種在血清miRNAs水平上的檢測，對活動性肺結核病具有早期診斷價值；
(3)本發明對活動性肺結核病檢測的靈敏度為90. 2%、特異性為75. 0%，具有較高的準確性。因此本發明可實現對活動性肺結核病的早期預警和早期診斷；(4)本發明血清miRNA的檢測技術先進、高通量，組合物的構建方法設計精確、合理可行，為提高活動性肺結核病的早期診斷提供了一種新的評估方法。


圖1是活動性肺結核病患者、健康對照者血清中hsa-miR-29c的表達水平。圖2是活動性肺結核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-29c的表達水平。圖3是活動性肺結核病患者、健康對照者血清中hsa-miR-22的表達水平。
圖4是活動性肺結核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-22的表達水平。圖5是活動性肺結核病患者、健康對照者血清中hsa-miR-320b的表達水平。圖6是活動性肺結核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-320b的表達水平。圖7是活動性肺結核病患者、健康對照者血清中hsa-miR-101的表達水平。圖8是活動性肺結核病患者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中hsa-miR-101的表達水平。圖 9 是血清 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101 組合物診斷活動性肺結核病的ROC曲線。
具體實施例方式本發明將結合附圖和具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。實施例1
一種檢測活動性肺結核病的診斷試劑盒，該試劑盒有RNA提取緩沖液，活動性肺結核病特異的血清 miRNA 組合物hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101 以及內參的反轉錄引物和PCR引物，熒光定量RT-PCR反應液。逆轉錄引物序列為
hsa-miR-29c :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’ ；hsa-miR-22 :5， -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT-3，；hsa-miR-320b :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’ ；hsa-miR-101 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3’ ；
內參 hsa-miR-16 :5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3，。PCR上游引物序列為
hsa-miR-29c :5’ -GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA-3’ ；hsa-miR-101 :5’ -GGGTACTGTGATAACTGAAGG-3’ ；
內參 hsa-miR-16 :5，-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT—3，；
PCR 通用的下游引物序列是5’ -AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。試劑盒的使用方法提取活動性肺結核病患者與健康對照者、肺炎、肺癌和慢性阻塞性肺病患者血清中的總RNA ;應用血清miRNA組合物hsa_miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101的特異反轉錄引物對樣本的總RNA進行反轉錄得到cDNA ；應用PCR特異引物進行SYBR Green染料熒光定量PCR檢測樣本中血清miRNA的表達水平；應用MedCalc軟件和Logistic逐步回歸模型，分析血清組合物hsa-miR-29c、hsa_miR-22、hsa-miR-320b 和 hsa-miR-101 的 ROC 曲線，曲線下面積(AUC)是 O. 911 (P < O. 0001,95%Cl = O. 847-0. 954)，靈敏度為90. 2%、特異性為75. 0%，表明該特異血清miRNAs組合物診斷活動性肺結核病具有較高的準確性。
試劑總RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；反轉錄試劑盒購自Fermentas公司；熒光定量PCR試劑購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。材料96孔板及膜購自Axygen公司。RNA提取緩沖液=QIAzof Lysis Reagent、氯仿、無水乙醇、RffT溶液、RPE溶液和RNAase-free 水。熒光定量RT-PCR反應液包括反轉錄和熒光定量PCR反應液；反轉錄反應液總RNA、反轉錄引物(2 μΜ)、5Χ反應緩沖液、dNTP (10 mM)、RNase抑制劑、反轉錄酶；熒光定量 PCR 反應液=SYBRtrewiz 位 Taq (Tli RnaseH Plus) (2X )、PCR 上游引物(10 μ Μ)、PCR 下游引物(10 μ M)、ROX Reference Dye (50X )、模板 cDNA 和 ddH20。實施例2 試劑盒應用
檢測活動性肺結核病患者、健康對照者、肺癌患者、肺炎患者及慢性阻塞性肺病患者血清中 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101 的表達水平。樣本收集活動性肺結核病患者82例、健康對照者108例,肺癌、肺炎和慢性阻塞性肺病患者各30例。取血清樣本中的總RNA :在200 μ L血清樣本中加入700 μ L Qiagen裂解液混勻，靜置5分鐘；加入140 μ L氯仿,劇烈震蕩,靜置3分鐘；12000 rpm, 4°C尚心15分鐘后取上清，加入1. 5倍體積的無水乙醇混勻；將上述混合物加到柱子中，8000 rpm離心18秒，棄收集液；加入700 μ L RffT溶液，8000 rpm離心18秒，棄收集液；加入500 μ L RPE溶液，8000rpm離心18秒，棄收集液，重復2次；全速，離心I分鐘；加入30-60 μ L RNAase-free水，靜置I分鐘，8000 rpm離心I分鐘。

引物設計
miRNAs反轉錄引物在通用莖環的3’端加上6個對應miRNAs的成熟序列3’端反向互補的堿基，通用莖環序列5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3’miRNAs反轉錄引物序列
hsa-miR-29c :5， -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGT
T-3’ ；hsa-miR-320b :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’ ；hsa-miR-101 :5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3，；內參hsa-miR-16 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’。PCR上游引物序列
hsa-miR-29c :5’ -GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’ ；hsa-miR-22 :5’ -CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3J ；hsa-miR-320b :5’ -AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA-3J ；hsa-miR-101 :5’ -GGGTACTGTGATAACTGAAGG-3J ；
內參 hsa-miR-16 :5，-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT—3，。PCR 下游通用弓 I 物序列5，-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3，。反轉錄反應體系2.5 UL總RNA，0. 5yL反轉錄引物(2 μΜ)，1.0μ 5X反應緩沖液，O. 5 μ L dNTP( IOmM), O. 25 μ L RNase抑制劑，O. 25 μ L反轉錄酶，總體積5 μ L。反應條件65°C反應5分鐘；冰上放置10分鐘；42°C延伸60分鐘；70°C滅活15分鐘。反應得到的cDNA用于熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR 反應體系10μ L SYBR Green Μ χ,Ο. 4μ L ROX染料，O. 8 μ L上游引物(10 μ Μ)，O. 8 μ L下游引物(10 μ Μ)，1. O μ L cDNA模板，補ddH20至總體積20 μ L。反應條件95°C預變性30秒；95°C變性5秒，60°C退火延伸31秒，40個循環。數據處理miRNA表達倍數的變化公式為RQ = 2_AAc\ RQ代表相對表達變化量；ΔΔ Ct = (CT miRNA -Ct miR-16)實驗組-(CT miRNA_CT miR-16)對照組平均值；實驗設立陰性對照和重復實驗，陰性對照反應體系中加ddH20，所有熒光定量PCR均做3次重復
統計分析米用 GraphPad Prism 5 軟件中 Nonparametric Mann-ffhitney test 進行統計(產< O. 05時，具有顯著性差異，產< 0.01時，具有極顯著性差異)，差異表達的miRNA數據處理結果以平均值土標準誤表示，繪制含誤差線的散點圖(參見圖1-圖8)。實施例3活動性肺結核病的特異血清hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b和hsa-miR-101組合物的建立
運用 MedCalc 軟件計算單個血清 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b 和hsa-miR-101診斷活動性肺結核病的ROC曲線，包括靈敏度、特異性和曲線下面積(AUC)，結果顯示血清 hsa-miR-29c，hsa-miR-22，hsa-miR-320b 和 hsa-miR-101 的 AUC 分別是(λ 723、O. 711,0. 702,0. 706，敏感性分別是 51. 2%,67. 5%,94. 9%,90. 1%，特異性分別是 87. 4%、70. 5,36. 4%,44. 2%。結果說明單個血清miRNA診斷活動性肺結核病敏感性和特異性都不聞。米用Logistic 逐步回歸模型計算血清 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa_miR-320b和hsa-miR-101組合物診斷活動性肺結核病的ROC曲線，通過數據計算和分析，構建活動性肺結核病特異血清 hsa_miR-29c, hsa-miR-22, hsa-miR-320b 和 hsa-miR-101 組合物的Logistic逐步模型的回歸方程Logit(p) = -O. 4975+1. 54103*(hsa_miR-29c)+ 0.35142*(hsa-miR-22)-2· 07802* (hsa_m`iR-320b) _2· 14771* (hsa-miR-101)(表 1)，4 個血清miRNAs組合物診斷活動性肺結核病的ROC曲線，靈敏度為90. 2%、特異性為75. 0%，曲線下面積(AUC)是 O. 911 0° < O. 0001,95% Cl = O. 847-0. 954)，并繪制圖形(參見圖 9)，比單個血清miRNA，4個血清miRNAs組合物AUC在O. 9以上時，診斷活動性肺結核病具有較高的準確性，同時敏感性高和特異性強。說明血清hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b和hsa-miR-101組合物可用于制備活動性肺結核病的診斷試劑盒。
權利要求
1.一種檢測活動性肺結核病的診斷試劑盒，由RNA提取緩沖液，活動性肺結核病特異的血清miRNA組合物、內參反轉錄引物和PCR引物以及熒光定量RT-PCR反應液構成，其中活動性肺結核病特異的血清miRNA組合物由4個差異表達的血清miRNAs組成hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa_miR-320b 和 hsa-miR-101 ;所述的 RNA 提取緩沖液有QIAzol Lysis Reagent、氯仿、無水乙醇、RffT溶液、RPE溶液和RNAase-free水；所述的突光定量RT-PCR反應液，包括反轉錄和熒光定量PCR反應液；其中反轉錄反應液有總RNA、2剛反轉錄引物、5X反應緩沖液、10 mM dNTP、RNase抑制劑、反轉錄酶；熒光定量PCR反應液有SYBR7￥e iz 位 Taq , Tli RnaseH Plus、PCR 上游引物、PCR 下游引物、ROX ReferenceDye、模板 cDNA 和 ddH20 ； 逆轉錄引物序列為hsa-miR-29c :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’，hsa-miR-22 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT-3’，hsa-miR-320b :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’，hsa-miR-101 :5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3’，內參 hsa-miR-16 :5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3，，PCR上游引物序列為hsa-miR-29c :5’ -GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’，hsa-miR-22 :5’ -CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3’，hsa-miR-320b :5’ -AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCA-3’，hsa-miR-101 :5’ -GGGTACTGTGATAACTGAAGG-3’，內參 hsa-miR-16 :5，-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT—3，； PCR 通用的下游引物序列是5’ -AGTGCAGGGTCCGAGGTAIT-3’。
2.根據權利要求1所述的試劑盒在活動性肺結核病血清檢測中的應用。
全文摘要
本發明提供一種檢測活動性肺結核病的診斷試劑盒，由RNA提取緩沖液，活動性肺結核病特異的血清miRNA組合物、內參反轉錄引物、PCR引物以及熒光定量RT-PCR反應液構成，其中活動性肺結核病特異的血清miRNA組合物由4個差異表達的血清miRNAs組成hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101。本發明采用活動性肺結核病的特異血清miRNAs組合，在血清miRNAs水平上對活動性肺結核病檢測，靈敏度為90.2%、特異性為75.0%，對活動性肺結核病具有早期診斷價值，可實現對活動性肺結核病的早期預警和早期診斷。
文檔編號C12Q1/68GK103045723SQ20121033828
公開日2013年4月17日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者李繼承, 張星 申請人:浙江大學