專利名稱：一種檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及用液相芯片的方法檢測傳染性喉氣管炎病毒的方法。
背景技術：
傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由抱疫病毒科ct -抱疹病毒亞科傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起的一種急性、接觸性上呼吸道傳染病，以呼吸困難、咳出血樣粘液、喉部和氣管黏膜水腫出血繼而糜爛為主要特征。由于引起產蛋下降和雞群死亡而造成嚴重的經濟損失，并且該病可感染各種日齡和品種的雞。本病通常突然暴發，并很快在雞群中傳播，感染率約為90% 100%，致死率5% 70%，一般在10 20%之間。May等1925年在美國首次報道該病，現已遍及世界許多養雞地區。我國自50年代以來大部分地區有不斷發生的報道，多呈地方流行性，并且發病的日齡有提前的趨勢。最早發病可見 20-40日齡,給養雞業造成嚴重損失,是集約化養雞場的重要疫病之一。目前傳染性喉氣管炎的實驗室診斷主要是病毒分離、血清學診斷、酶聯免疫吸附試驗、核酸探針、聚合酶鏈式反應等。病毒分離、血清學診斷和酶聯免疫吸附試驗這些方法雖然經典，但費時費力且敏感性差，不能檢測亞臨床感染，而傳染性喉氣管炎亞臨床感染占有重要地位。PCR技術雖具有快速、特異、敏感和易于操作的特點，在畜禽傳染病的檢測、鑒別診斷方面得到了廣泛應用但是不能進行高通量檢測，不能滿足高通量檢疫的要求，更不利于大量通關樣品的檢疫和疫情暴發時大批量樣品的緊急篩查，因而需要建立一套簡便、快速、準確的傳染性喉氣管炎篩查和檢驗技術，以滿足日常檢測的要求。液相芯片(xMAP)技術是20世紀90年代中期發展起來的高通量檢測技術。它是既可進行免疫學檢測也可進行核酸檢測的一種集流式技術、激光、熒光微球和數字信號處理為一體的新型生物分子高通量多重檢測技術。液相芯片技術最突出的優點在于僅需少量樣本即可同時定性、定量檢測同一樣本中的多種不同目的分子，即多重檢測。具體說來，與常規免疫學或核酸檢測方法相比，它具有高通量、樣品需求量小、操作簡單、靈敏度高、檢測范圍廣、特異性強、重復性好的顯著優點。液相芯片技術平臺是既能保證信息質量，又能提供相對高通量的新一代分子診斷技術平臺，這個技術平臺整合了生物檢測，微球熒光編碼，微液體傳送系統，激光實時記錄，先進電腦軟件和數據處理模式等多種先進技術。液相芯片的核心技術是把微小的微球分別染成上百種不同的熒光色(固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼)。應用時，把針對不同檢測物的微球混合后再加入微量待檢測標本，在懸液中與微粒進行特異性地結合。結合的結果可以在瞬間經激光判定后由電腦以數據信息的形式記錄下來。因為分子雜交是在懸浮溶液中進行，檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。液相芯片技術平臺具有高效性因為上百種顏色的微球可以在同一個反應體系內，所以一小份標本(血，或其它體液，組織)可以被用來同時檢測上百個生理或病理指標。液相芯片技術平臺具有高敏感性每個乳膠微球上都可以滿滿地(以共價鍵牢固結合的方式)包被上抗原、抗體、或核酸。因為探針密度高，產生的信號強，加上使用熒光檢測，所以敏感性大大高于任何現有分析、診斷方法，也高于其它芯片法。液相芯片技術平臺是一種快速檢測方法因為雜交在懸浮的液相中進行，所以反應需要時間短，雜交后常不用清洗就可以直接讀數，且檢測效率大大高于固相雜交，所用時間從幾小時縮短到十幾分鐘。

發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片方法；本發明的目的還在于提供一種檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片試劑盒。查閱相關文獻皰疹病毒的TK基因是高度保守的，ILTV不同毒株之間更加保守，英國株(Throne)和美國株￠32株)TK基因僅相差3個連續的核苷酸。從GenBank(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov)中收集傳染性喉氣管炎TK基因序列,利用Bioedit分子生物學分析軟件對大量收集的序列進行分析比較，根據實驗目的篩選傳染性喉氣管炎的特異性保守序列。 本發明在對序列分析的基礎上，根據篩選的每個亞型的保守序列，參照GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中發表的傳染性喉氣管炎TK基因序列組序列(登錄號EF552574)，應用DNAStar、Primer5. O、和Bioedit軟件分別對其進行初步分析篩選，設計了傳染性喉氣管炎的特異性引物和探針，分別對下游引物進行生物素標記，對探針進行氨基修飾。本發明提供了一對用于檢測傳染性喉氣管炎病毒的引物，其核苷酸序列為 ILTV-F: 5 ’ -AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3 ’，ILTV-R: 5，-ATGTTGGAGTGTGTTGGAATGTCA-3，，在 ILTV-R 引物的 5’ 端用生物素標記。本發明提供了與上述引物配合使用的檢測傳染性喉氣管炎病毒的探針，其核苷酸序列為5，-GCCCCACTAAGAATAATGAACCACG-3，，在其 5，端用氨基修飾。本發明提供了一種用于檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片，是將上述檢測探針與熒光標記微球偶聯制成的特異性檢測微球。進一步地，所述液相芯片中，每6. 25X IO5個熒光微球加入濃度為O. Inmol/yL的探針2 μ L。本發明提供了一種用液相芯片檢測傳染性喉氣管炎病毒的方法，其特征在于，用本發明提供的引物，對樣品DNA進行PCR擴增，PCR產物與偶聯在熒光微球上的探針分子雜交后，檢測突光值，確定樣品中是否含有傳染性喉氣管炎病毒。具體地，包括下列步驟I)提取樣本中傳染性喉氣管炎病毒DNA;2)以步驟I)提取的樣本DNA為模板，以上述引物(ILTV-F和ILTV-R)進行PCR反應；3)將上述氨基修飾的探針與熒光標記微球偶聯；4)雜交將帶有生物素標記的步驟2)中的PCR產物與步驟3)中偶聯到熒光微球上的探針在PCR儀上雜交；5)檢測熒光值，以平均熒光值大于200且為陰性對照3倍以上熒光值所對應的檢測標本為陽性。本發明提供了一種用于檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片檢測試劑盒，含有一對引物和本發明提供的上述液相芯片，所述引物核苷酸序列為ILTV-F: 5 ’ -AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3 ’，ILTV-R: 5，-ATGTTGGAGTGTGTTGGAATGTCA-3，，在 ILTV-R 引物的 5’ 端用生物素標記。本發明提供的液相芯片檢測試劑盒中，使用上述引物進行PCR擴增的25μ L工作體系為IOxbuffer 2. 5 μ L, IOmmoI/L dNTP 2. O μ L, taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L，DNA 模板2. 0 μ L, 10 μ mol/L 上游引物 ILTV-F O. 5 μ L, 10 μ mol/L 下游引物 ILTV-R l.OyL,不含 RNA 酶的 ddH20 16. 5 μ L0其中，PCR擴增的工作條件為95°C預變性5min ;94°C變性40s，58°C退火40s，72°C延伸40s，共35個循環;72°C延伸IOmin0其中，PCR擴增產物與液相芯片雜交的工作條件為95°C變性5min后，54°C雜交30mino本發明提供了引物在制備傳染性喉氣管炎病毒液相芯片檢測試劑盒中的應用，所述引物核苷酸序列為 ILTV-F: 5 ’ -AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3 ’，ILTV-R: 5，-ATGTTGGAGTGTGTTGGAATGTCA-3，，在 ILTV-R 引物的 5’ 端用生物素標記。本發明提供了探針在制備傳染性喉氣管炎病毒液相芯片檢測試劑盒中的應用，所述探針的核苷酸序列為5 ’ -GCCCCACTAAGAATAATGAACCACG-3 ’，且在其 5 ’ 端用氨基修飾。本發明提供了用于檢測傳染性喉氣管炎病毒的生物素標記引物和特異性探針，利用該引物和探針建立一種檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片方法，該方法具有速度快，操作簡單、敏感性高、特異性好等優點，適合于臨床標本中傳染性喉氣管炎病毒的檢測。


圖I為ILT病毒TK基因PCR擴增電泳結果，其中泳道1_6分別為傳染性喉氣管炎病毒陽性樣品，7為陰性對照，M為DL2000DNA Marker。圖2為樣品檢測柱狀圖，其中X1-5分別代表感染ILTV樣品DNA。圖3為PCR方法對傳染性喉氣管炎病毒不同濃度模板的TK基因敏感性電泳圖，其中M為DL2000DNA Marker,泳道1_4分別為傳染性喉氣管炎病毒模板濃度Ing/ μ L，O. Ing/μ L，0. Olng/μ L，0. OOlng/μ L，5 為陰性對照。圖4為ILTV病毒液相芯片敏感性柱狀圖，其中X1-X6對應模板濃度分別為Ing/μ L，0. lng/μ L，0. oing/μ L, O. OOlng/μ L, O. OOOlng/μ L，0. OOOOlng/μ L，C 為陰性對照，B
為空白對照。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。實施例I探針和引物的設計與修飾從GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中收集傳染性喉氣管炎病毒 TK 基因序列，利用Bioedit分子生物學分析軟件對大量收集的序列進行分析比較，根據實驗目的篩選傳染性喉氣管炎病毒特異性保守序列。在對序列分析的基礎上，根據篩選的每個亞型的保守序列，參照GenBank中發表的傳染性喉氣管炎病毒的TK基因組序列(登錄號EF552574)，應用DNAStar、Primer5. O和Bioedit軟件分別對其進行初步分析篩選。 本發明經過反復研究，多次試驗，設計了一對傳染性喉氣管炎病毒的特異性引物以及特異性探針，分別對下游引物進行生物素標記，對探針進行氨基(NH2)修飾。引物和探針的序列如下表所示表I傳染性喉氣管炎病毒液相芯片引物和探針
權利要求
1.一種檢測傳染性喉氣管炎病毒的引物,其核苷酸序列為ILTV-F:5， -AAAACTTGAATGTCGGGAGG-3，， ILTV-R:5’ -ATGTTGGAGTGTGTTGGAATGTCA-3’，在 ILTV-R 引物的 5’ 端用生物素標記。
2.一種與權利要求I所述引物配合使用的檢測傳染性喉氣管炎病毒的探針，其核苷酸序列為 5’ -GCCCCACTAAGAATAATGAACCACG-3’，在其 5’ 端用氨基修飾。
3.一種用于檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片，其特征在于，是權利要求2所述的檢測探針與熒光標記微球偶聯制成的特異性檢測微球。
4.如權利要求3所述的液相芯片,其特征在于,姆6.25X IO5個突光微球加入濃度為O.Inmol/μ L的探針2 μし
5.一種用于檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片檢測試劑盒，其特征在于，含有權利要求I所述的引物和權利要求3或4所述的液相芯片。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其中權利要求I所述的引物進行PCR擴增的25μ Lエ作體系為10 X buffer 2. 5 μ L, IOmmoI/L dNTP2. O μ L，taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，DNA 模板.2.O μ L, 10 μ mol/L 上游引物 ILTV-F O. 5 μ L, 10 μ mol/L 下游引物 ILTV-R l.OyL,不含 RNA酶的 ddH20 16. 5 μ L0
7.如權利要求5所述的試劑盒，其中權利要求I所述的引物進行PCR擴增的工作條件為95°C預變性5min ;94°C變性40s，58°C退火40s，72°C延伸40s，共35個循環;72°C延伸IOmin0
8.如權利要求5所述的試劑盒，其中權利要求I所述的引物的PCR擴增產物與液相芯片雜交的工作條件為95°C變性5min后，54°C雜交30min。
9.權利要求I所述的引物在制備傳染性喉氣管炎病毒液相芯片檢測試劑盒中的應用。
10.權利要求2所述的探針在制備傳染性喉氣管炎病毒液相芯片檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明提供了用于檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片方法，通過對傳染性喉氣管炎病毒的TK基因組序列的比對和分析，找出保守區域，設計了傳染性喉氣管炎病毒的特異性引物和探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。用上述引物對傳染性喉氣管炎病毒DNA進行PCR擴增，同時將探針與微球偶聯；PCR擴增產物和偶聯到熒光微球上的探針進行分子雜交，通過檢測熒光值，建立了檢測傳染性喉氣管炎病毒的液相芯片方法。本發明的檢測方法具有檢測準確，靈敏度高、特異性強，簡便快速的優點。
文檔編號C12N15/11GK102851395SQ20121033780
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者王慧煜, 韓雪清, 林祥梅, 梅琳, 李志輝 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院