專利名稱：肌醇多磷酸2-激酶基因及其用途的制作方法
技術領域：
本申請享有2004年9月9日申請的U.S.臨時申請N0.60/608, 244的權益。本發明涉及植物分子生物學領域。具體地，本發明涉及編碼酶肌醇多磷酸2-激酶(IPP2-K)基因的鑒定和用途，該酶涉及植物中的植酸生物合成途徑，并涉及這些基因及其突變體降低植物種子和含有該種子的食物或飼料中的植酸水平和/或提高含磷的非植酸(non-phytic acid phosphorous)水平的用途。
背景技術：
已經充分認識了磷(pho sphorOU s )在動物營養中的作用。在給動物提供結構的骨骼中發現了動物體內百分之八十的磷。動物百分之二十的磷發現于軟組織中，其中涉及無數的生化反應，包括DNA、RNA、磷脂和一些B族維生素的合成和活性。盡管磷對動物健康是關鍵的，但不是飼料中所有的磷是生物可利用的。myo-肌醇1，2，3，4，5，6-六-kis-磷酸鹽，通常稱為植酸，是許多植物種子和蔬菜組織如根和塊莖中存在的大量分子。 植酸鹽(或肌醇六磷酸鹽)是種子中磷的主要存儲形式，通常代表種子全部磷(P)的65%至80%。當非反芻動物食用基于種子的膳食時，所食用的植酸在消化道中形成幾種營養重要礦物質的鹽。這些鹽的排泄降低了磷和礦物質兩者的保留和利用(即，生物利用率)。因此，這導致食用種子的人和動物的礦物質缺乏。此外，動物廢料中結合植酸的磷引起了地表和地下水的污染。已經提出了幾種方法來降低種子中的植酸內含物對膳食、磷和礦物質保留和環境的負面影響。方法包括通過收集后干涉除去膳食植酸和遺傳上降低種子的植酸含量。US5, 689, 054 (玉米)和US6，111，168 (大豆)中提出了含降低植酸的種子的權利要求。WO00/73473、WO 99/05298、US 6，197，561 和 US 6，291，224 中討論了通過處理肌醇 1-磷酸合成酶(myo-1nositol 1-phosphate synthase)而改變肌醇六憐酸鹽的水平。W099/37786中討論了通過用肌醇甲基轉移酶分流4-0-甲基內消旋肌醇而改變肌醇六磷酸鹽的水平。US6, 197，561提出了通過改變其他酶的數量來改變肌醇六磷酸鹽的水平，這些酶包括磷脂酰肌醇-3-激酶、myo-肌醇1，3，4-三磷酸5/6-激酶、myo-肌醇單磷酸酶_3、肌醇多磷酸5-磷酸酶、D-myo-肌醇-3-磷酸合酶、D-myo-肌醇三磷酸鹽3-激酶、myo-肌醇轉運蛋白、玉米植酸酶、磷脂酰肌醇轉運蛋白、磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶、磷脂酰肌醇-特異性磷脂酶、myo-肌醇單磷酸酶-1、磷脂酰肌醇4-激酶、磷脂酰肌醇(4，5)雙-磷酸5-磷酸酶、磷脂酰肌醇合酶。US6, 399，861、US6, 303，766、US5, 994，628、US5, 714，474 和US5, 543，576中還公開了植酸酶的植物/種子表達，植酸酶是一種能夠降解肌醇六磷酸鹽的酶。US2003/0009011 (W002/059324)公開了肌醇多磷酸激酶基因和用于調節肌醇六磷酸鹽水平的用途，另外提出了鑒定其他肌醇多磷酸激酶基因的保守序列。US2003/0079247(W003/027243)公開了另外的肌醇多磷酸激酶基因，描述為肌醇1，3，4-三磷酸5/6-激酶基因家族。以上US5，689，054中描述的lpa2突變體含有多個該基因家族的突變(請參閱Plant Physiol.2003 年 2 月；131 (2):507_15)。盡管這些方法，仍然存在通過降低植酸水平和提高含磷的非植酸水平來提高植物特別是玉米營養成分的需要。IPP2-K酶催化多個導致植酸形成的步驟。它催化，例如:ATP+肌醇1，4，5，6_四kis 憐酸鹽(tetrakisphosphate)— ADP+ 肌醇五 kis 憐酸鹽(pentakisphosphate)和 ATP+肌醇 I, 3, 4，5，6 五 kis 磷酸鹽(pentakisphosphate)— ADP+肌醇 I, 2, 3, 4, 5, 6 六磷酸鹽的反應。此外，該酶催化ATP+肌醇1，4，6-三磷酸鹽一ADP+肌醇1，2，6-三磷酸鹽的反應。發育中植物種子中IPP2-K酶活性的降低將中斷植酸合成，因此降低種子中植酸的水平并使得飼喂種子的動物在代謝上更易于利用磷。本發明解決了通過提供編碼全部或部分IPP2-K酶的核酸序列和用于操縱植物細胞中植酸生物合成途徑的工具來提高磷酸鹽生物利用率的需要。

發明內容
根據本發明，提供了分離的植物多核苷酸，包括選自以下的成員:(a)包括SEQ IDNO:1的多核苷酸；(b)包括與SEQ ID NO:1至少65%的序列同一性的多核苷酸，其中％序列同一性是基于完整的編碼片段并通過使用默認參數的GAPlO分析測定；(c)包括與SEQID N0:1至少46%的序列同一性的多核苷酸，其中％序列同一性是基于完整的編碼片段并通過使用默認參數的GAPlO分析測定；(d)編碼包括SEQ ID NO:2多肽的多核苷酸；(e)包括使用基于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3的引物從植物核酸擴增的核酸序列的多核苷酸；(f)在嚴謹條件下與SEQ ID NO:1的多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸，其中雜交條件包括600C 0.1XSSC中的洗滌步驟；(g)編碼玉米肌醇多磷酸-2-激酶的多核苷酸；(h)編碼植物肌醇多磷酸-2-激酶的多核苷酸；(i)與(a)至(h)的多核苷酸互補的多核苷酸。本發明還涉及分離的蛋白質，包括選自以下的成員:(a)包括SEQ ID N0:2的至少25個連續氨基酸的多肽；(b)包括與全長SEQ ID N0:2相比至少45%序列同一性的多肽，其中百分比序列同一性是基于完整序列長并通過使用默認參數的GAPlO分析測定；(c)由權利要求I的核酸編碼的多肽；(d) SEQ ID NO:1編碼的多肽；和(0具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽。本發明再一方面是分離的植物多肽，包括具有SEQ ID NO:2至少65%的序列同一性的氨基酸序列，其中多肽具有肌醇多磷酸2-激酶活性。本發明的另一方面是破壞植物組織中肌醇多磷酸2-激酶活性水平的方法，包括:將植物組織接受誘變；從接受誘變的植物組織或其后代獲得DNA樣品；并測試DNA樣品編碼肌醇多磷酸2-激酶基因的損害。此外，本發明涉及含有人工誘導的編碼肌醇多磷酸2-激酶基因損害的玉米種子。此外，本發明涉及含有人工誘導的編碼肌醇多磷酸2-激酶基因損害的卡諾拉(canola)(油菜(Brassica napus))種子。再一實施方案中，本發明涉及降低動物飼料中植酸水平的方法，包括:從含有編碼肌醇多磷酸2-激酶基因損害的植物產生動物飼料， 其中動物飼料具有降低水平的可利用肌醇六磷酸鹽。本發明還涉及降低動物廢料中磷水平的方法:從包括編碼肌醇多磷酸2-激酶基因損害的植物提供動物飼料。此外，本發明包括特征在于相對于物種的親本種質具有低含量植酸的谷類植物物種的非致死突變種子，其中突變種子具有改變的肌醇多磷酸2-激酶活性。此外，本發明涉及通過將包括SEQ ID NO:2的多肽用作免疫原產生的純化抗體。此外，本發明涉及用于轉化植物細胞的載體，包括(a)與以下的基本上互補的反義核苷酸序列(I)編碼肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子的一條鏈的相應部分，其中編碼肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子在低嚴謹條件下與SEQ ID NO:1雜交或(2)由編碼肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子編碼的RNA序列的相應部分；和(b)可操作地將調節序列連接到反義核苷酸序列，使得反義序列在其轉化 進去的植物細胞中表達。必須提及的是本發明進一步涉及編碼RNA分子的反義寡核苷酸或多核苷酸，該RNA分子與植物肌醇多磷酸2-激酶基因的RNA轉錄本的相應部分基本上互補，其中所述植物基因在低嚴謹條件下與SEQ ID NO:1雜交。本發明的再一方面是產生具有與基因敲除相關的所需性狀的突變植物的方法，該方法包括:提供收集的植物種子；用如EMS的化學誘變劑或選自UV、Y -照射、X-射線或快中子的照射來處理所述的植物種子集合；和選擇具有所需性狀的突變植物。本發明的再一方面是分離的植物肌醇多磷酸2-激酶蛋白，包括至少一個選自以下的基序:DAXDWXYXXEGXXNLXLXYXGSSP、VEIKXKCGFLXXSXXIXXXNXXKXXXXRXXMXQXCKXXXXXISXXSEYXPLDLFSGSKXXXXXAIKXXXXTPQNXXXXXXGSLXXGG, ISXXSEYXPLDLFSGSK、LXXLLXXQKLDXXIEGXIHXYY 和 LIXXTAXDCSXMISF。


圖1A顯示了在此要求保護的玉米IPP2-K與其它玉米肌醇激酶的相似性。低水平的序列相似性表明玉米IPP2-K是新的肌醇磷酸激酶。圖1B顯示了玉米IPP2-K蛋白質序列和來自玉米和其他物種的肌醇磷酸激酶之間的系統發生關系。從不同范圍的物種(從人至擬南芥(Arabidopsis)推定的IPP2-K基因是密切相關的。相反，其他肌醇磷酸激酶被分到系統發生樹的不同分枝中。多重比對算法:使用 Clustal W 算法(Nucleic Acid Research, 22 (22):4673_4680，1994)形成比對。簡而言之，計算所有序列對之間的天然相似性，稱為“等價比對(Parities alignment)”。然后將這些分數用于計算“導向樹”或樹狀圖，這表明了多重比對階段，比對序列的次序用于最終的多重比對。擁有計算過的樹狀圖，可以在越來越大的組中比對序列直至最終的比對中引入了完整的序列。圖2顯示了來自推定的植物IPP2-K基因的預測氨基酸序列的比較。圖3顯示了來自玉米近交系DAS5XH751的968Ibp的IPP2-K的基因組結構。圖4顯示了使用32P- Y ATP的玉米IPP2-K的體外激酶活性，用放射性同位素標記的底物和TLC監測IP4和IP5底物。S卩，顯示了 IPP2-K酶對IP4和IP5底物的體外活性。IPP2-K將肌醇1，4，5，6-四kis磷酸鹽轉化成肌醇五kis磷酸鹽，和將肌醇1，3，4，5，6-五kis磷酸鹽轉化成肌醇六磷酸鹽(肌醇六kis磷酸鹽(hexakisphosphate))。泳道1:1PP2_K加肌醇1、4、5、6四kis磷酸底物；泳道2:IPP2-K加肌醇1、3、4、5、6五kis磷酸底物；泳道3:IPP2-K加肌醇1、4、5、6四kis磷酸底物；泳道4:1PP2_K加肌醇1、3、4、5、6五kis磷酸底物。圖5顯示了如通過1H-NMR檢測的在IPP2-K酶和AIP存在下，肌醇I，4，6_三磷酸鹽體外轉化成肌醇1，2，6-三磷酸鹽。即，顯示了含有ATP和DTT的D2O中的肌醇-1，4，6-三磷酸鹽溶液的δΟΟΜΗζ1!! NMR譜。(A)加入ΙΡΡ2-Κ酶之前不久。(B)加入ΙΡΡ2-Κ酶兩小時后。鑒定出對應于肌醇-1，4，6-三磷酸鹽和肌醇-1，2，6-三磷酸鹽的峰。區域3.5-3.Sppm中的未標記峰對應于DTT，而那些3.8-4.8ppm的由ATP和ADP產生。肌醇-1，2，6-三磷酸鹽的3’質子位于3.67ppm的DTT峰下面。圖6顯示了玉米近交系DAS5XH751的種子提取物的磷-NMR譜，表明肌醇磷酸鹽物質(species)存在。即，顯示了玉米近交系DAS5XH751的種子提取物的磷NMR譜。在裝備5-mmlH/13C/19F /31P探針的fcuker DRX-400NMR分光計上在400.13MHz獲得譜。將峰標記來表示產生信號的肌醇磷酸鹽物質。IP6:肌醇六磷酸鹽(肌醇六kis磷酸鹽)；IP5:肌醇五kis磷酸鹽；IP4:肌醇四kis磷酸鹽。SEQ ID勵:1是近交系0八55乂!1751種子中編碼玉米1 2-1(的00嫩的核苷酸序列。SEQ ID NO: 2是源自SEQ ID NO:1核苷酸序列的IPP2-K的推導氨基酸序列。SEQ ID NO: 3是玉米近交系5XH751的編碼IPP2-K的基因組DNA的核苷酸序列。
具體實施例方式在此提供定義來幫助理解本發明。單位、前綴和符號以SI公認的形式來表示。除非另外指出，核酸是以從左至右5’至3’方向來書寫；氨基酸序列是以從左至右氨基至羧基方向來書寫。說明書內引用的數值范圍包括限定范圍的數字并包括限定范圍內的每個整數。通過通常已知的三個字母符號或通過IUPAC-1UB Biochemical NomenclatureCommission (生化命名協會)推薦的一個字母符號來表示在此的氨基酸。同樣，可以通過通常公認的單字母編碼來表示核苷酸。除非另外提供，在此所用的軟件、電、電子術語和TheNew IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electrnics Terms (電和電子術語的新IEEE標準字典)(第5版，1993)中定義的一樣。以下限定的術語通過參照作為整體的說明書來更全面地限定。“反義RNA”指的是與全部或部分目標初級轉錄產物或mRNA互補并阻斷目標基因表達的RNA轉錄產物(U.S.專利N0.5，107，065，在此引入作為參考)。反義RNA的互補性可以是特定基因轉錄本的任何部分，即，在5’ -非編碼序列、3’ -非編碼序列、內含子或編碼序列。“功能RNA”指的是正義RNA、反義RNA、核酶RNA、RNAi或其他沒有得到翻譯但對細胞過程仍然具有影響的RNA。術語“互補DNA” (cDNA)指的是可以從mRNA模板通過酶逆轉錄形成的單鏈DNA分子。通常，將與部分mRNA互補的引物用于啟動逆轉錄。本領域技術人員還使用術語“cDNA”來表示源自mRNA分子的雙鏈DNA分子。術語“重疊群(contig)”指的是重疊核酸序列來形成一個連續的核苷酸序列的裝配。例如，將幾個DNA序列比較并比對來鑒定普通的或重疊的片段。然后將單獨的序列裝配成單個連續的核苷酸序列。
術語“表達”指的是源自本發明核酸片段的正義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定累積。表達還可以指mRNA翻譯成多肽。“反義抑制”指的是反義RNA轉錄產物的產生能夠抑制目標蛋白質的表達。“過表達”指的是轉基因生物體中的基因產物的產生超過正常或非轉化生物體中的產生水平。“共抑制”指的是正義RNA轉錄產物的產生能夠抑制相同或實質上相似的外源或內源基因的表達(U.S.專利N0.5，231，020，在此引入作為參考)。可以將使用鋅指(ZF)識別基序的DNA-結合蛋白設計來識別和修飾特定的DNA序列或改變表達。當可操作地連接核酸酶時(ZFNs)，可以將這樣工程化的鋅指(ZFs)用于直接改變天然環境中的基因。通過ZF結合介導的位點擇優或位點特異性核酸酶剪切可以有效表改變達或活性。目標基因的改變可以包括用設計的DNA通過同源重組的替代和插入或刪除引起的基因破壞。可在Biol.Chem.1999七月-八月；380 (7-8):841-848 ;Molecularand Cellular Biology 21 (I):289-297,2001 ；Genetics 161:1169_1175，2002 中找到ZFN-介導的基因組改變的實例。相反，當設計作為與反式基因相互作用的轉錄因子時，ZF可以間接調節表達和活性。可以將這樣的ZFPs工程化來提高或降低轉錄(refs)。ZFP表達的調節可以是組成型、組織特異性、瞬間特異性或誘導型的。可在Proc.Nat.Acad.Sc1.99
(20):13290-13295,2002 ；Proc.Nat.Acad.Sc1.99 (20): 13296-13301，2002 ；Plant CellPhysiol.43 (12): 1465-1472，2002 ；Curr.0pin.Plant Biol.6:163-168,2003 中的綜述中找到ZFP介導的表達改變的實例。術語“基因”指的是表達特定蛋白的核酸片段，包括編碼序列之前(5’ -非編碼序列)和之后(3’ -非編碼序列)的調節序列。“天然基因”指的是天然發現的基因，具有其自身的調節序列。“嵌合基因”指的是不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起發現的調節序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括源自不同來源的調節序列和編碼序列，或調節序列和編碼序列源自相同來源，但以不同于天然發現的方式排列。“內源基因”指的是位于生物體基因組中天然位置的天然基因。可以將內源基因另外的一個拷貝或多個拷貝重新引入宿主生物體中不同的染色體位置，導致前后和表達水平的差異。“外源”基因指不是在宿主生物體中正常發現的但通 過基因轉移引入了宿主生物體中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物體中的天然基因，或嵌合基因。“轉基因”是通過轉化程序已經引入基因組中的基因。術語“基因組DNA”指的是染色體DNA并可以包括內含子。內含子是插入序列。它是基因內的非編碼DNA序列，轉錄成核內不均RNA (hnRNA)，但然后通過核中的RNA剪接除去，留下成熟的mRNA，然后在細胞質中將其翻譯。內含子末端的片段通常是自我互補的，允許在hnRNA中天然形成發夾結構。術語“肌醇多磷酸2-激酶多核苷酸”或“IPP2-K多核苷酸”指的是編碼具有至少肌醇多磷酸2-激酶活性的多肽的多核苷酸，或能夠調節宿主細胞中IPP2-KmRNA或蛋白質表達的多核苷酸。術語還包括具有上述任一種活性的片段、變體、同系物、等位基因或前體(例如，前蛋白(preprotein)或原蛋白(proprotein)。術語“ IPP2-K”指的是對于任何核酸或多肽的肌醇多磷酸2-激酶，或相關的功能活性。本發明的IPP2-K酶具有寬泛的底物特異性并可以使幾種肌醇磷酸鹽物質磷酸化，包括但不限于，肌醇三磷酸鹽、肌醇四kis磷酸鹽和肌醇五kis磷酸鹽，使用腺苷三磷酸鹽(ATP)作為磷酸鹽供體，形成產物腺苷二磷酸鹽(ADP)和磷酸化的肌醇磷酸鹽。
術語“分離的”指的是物質，如核酸或蛋白質，其是:(1)基本上或實質上無發現物質的天然產生環境中通常伴隨或相互作用的成分或(2)如果物質是在其天然環境中，已經通過故意的人干預將物質改變成組合物和/或置于物質在細胞中天然位置以外的位置。術語“損害”指的是核酸相對于野生型植物核酸的任何分子改變。例如，損害可以是核酸序列中的刪除、倒置、插入、重復、顛換、轉變或重排。術語“基序”指的是構成較長序列一部分的核酸或氨基酸保守序列的短片段。術語“非-反芻動物”意思是具有分成食道、賁門、基底和幽門部分的單胃的動物。非反芻動物另外表示沒有功能性瘤胃的動物物種。瘤胃是消化系統的一部分，在通過消化道之前飼料/食物在其中浸濕并接受微生物的消化。在非反芻動物中不產生這種現象。術語非反芻動物包括但不限于人、豬、家禽、貓和狗。術語“植酸”指的是myo-肌醇四磷酸、myo-肌醇五磷酸、myo-肌醇六磷酸及其衍生物如:5_焦磷酸-肌醇(1，3，4，6)-四kis磷酸鹽、5-焦磷酸-肌醇(1，2，3，4，6)-五kis磷酸鹽和5，6-雙-焦磷酸-肌醇(1，2，3，4)-四kis磷酸鹽。作為有陽離子的鹽，植酸為“肌醇六磷酸鹽”。術語“植物”包括植物和植物部分，包括但不限于，植物細胞和植物組織，如葉、莖、根、花、花粉和種子。可以用于本發明中的植物種類通常寬至順從誘變的高等和低等植物的種類，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物和多細胞藻類。術語“多核苷酸”指的是任何核酸并包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單-或多-鏈聚合物。核酸還可以包括片段和修飾的核苷酸。因此，如在此所用的，術語“核酸”和“多核苷酸” 可交替使用。術語“啟動子”通常指指導結構基因轉錄來產生RNA的DNA序列。通常，啟動子位于基因上游500個堿基對片段中，接近轉錄起始位點。如果啟動子是誘導型啟動子，那么轉錄的速率響應外源或內源誘導劑而提高或降低。相反，如果啟動子是組成型啟動子，通過誘導劑將轉錄速率調節至較低的程度。術語“轉錄調節片段”和“調節片段”指的是調節基因轉錄的DNA部分。調節片段可以包括各種順式-作用元件，包括但不限于，啟動子、增強子和激素應答部件。此外，因為已知內含子和5’ UTR影響轉錄，轉錄調節片段可以包括這樣的序列。術語“基本上相似”指的是其中一個和多個核苷酸堿基的改變導致一個或多個氨基酸取代但沒有影響DNA序列編碼的蛋白質的功能特性的核酸片段。“基本上相似”還指其中一個或多個核苷酸堿基通過反義或共抑制技術的改變沒有影響核酸片段介導的基因表達改變的核酸片段。“基本上相似”還指關于介導通過反義或共抑制技術的基因表達改變或所得到蛋白分子的功能特性改變的能力，本發明核酸片段的改變如一個或多個核苷酸的刪除或插入基本上沒有影響所得到的轉錄產物的功能特性。因此，理解本發明包括多于特定示范性的序列。例如，本領域共知可以使用表示少于基因完整編碼片段的核酸片段，或通過與待抑制的基因不具有100%序列同一性的核酸片段來實現基因表達的反義抑制和共抑制。此夕卜，導致在給定位點產生化學上等價的氨基酸但沒有影響所編碼蛋白功能特性的基因改變是本領域公知的。因此，用于氨基酸丙氨酸(一種疏水性氨基酸)的密碼子可以由編碼另一種疏水性較低的殘基如甘氨酸或疏水性較高的殘基如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的密碼子來取代。相似地，也可以預期導致一個負電荷殘基替代另一個如天冬氨酸替代谷氨酸，或一個正電荷殘基替代另一個如賴氨酸替代精氨酸的改變來產生功能上等價的產物。此外，導致蛋白質分子N-端和C-端部分改變的核苷酸改變也不期待來改變蛋白質的活性。所提出的每個改變都在本領域常規技術范圍內，所編碼產物生物活性保持的測定也是如此。

此外，還可以通過在嚴謹條件下(0.1 X SSC, 0.1%SDS，65°C)與在此公開的核酸片段的雜交能力來表征基本上相似的核酸片段。還可以通過它們編碼的氨基酸序列與在此公開的氨基酸序列的百分比相似性來表征本發明基本上相似的核酸片段，如通過本領域技術人員常用的算法來測定。優選的是其核苷酸序列編碼與在此報道的氨基酸序列80%相似的氨基酸序列的那些核酸片段。更優選的是編碼與在此報道的氨基酸序列90%相似的氨基酸序列的核酸片段。最優選的是編碼與在此報道的氨基酸序列95%相似的氨基酸序列的核酸片段。使用GCG程序包(GeneticsComputer Group, Madison, WI)進行序列比對和百分比相似性計算。使用具有默認參數(GAP PENALTY=10，GAP LENGTH Penalty=IO)的 Clustal 比對算法(Higgins，D.G.和 Sharp，P.M.(1989)CAB10S.5:151-153)進行序列的多重比對(此后，稱為Clustal算法)。使用Clustal 方法的成對比對的默認參數是 KTUPLE 1，GAP PENALTY=3, WIND0ff=5 和 DIAGONALSSAVED=50氨基酸或核苷酸序列的“實質性部分”指的是通過本領域技術人員的序列人工評價或使用算法如 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ；Altschul,S.F.等，(1993)J.Mol.Biol.215:403-410 ;請參閱 www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)通過計算機自動化序列比較和鑒定足以提供多肽或基因推定鑒定的多肽氨基酸序列或基因的核苷酸序列。通常，推定鑒定作為與已知蛋白或基因同源的多肽或核酸序列需要十個或更多個連續氨基酸或三十或更多個核苷酸的序列。此外，對于核苷酸序列，在基因鑒定(例如，SOUTHERN分析)和分離(例如，細菌菌落或噬菌斑的原位雜交)的序列依賴性方法中使用包括20-30個鄰接核苷酸的基因特異性寡核苷酸探針。此外，為了獲得包括引物的特定核酸片段，可以將12-15個堿基的短寡核苷酸用作PCR中的擴增引物。因此，核苷酸序列的“實質性部分”包括足以提供包括序列的核酸片段的特定鑒定和/或分離的序列。本說明書教導了部分或全部氨基酸和編碼一個或多個特定植物蛋白的核苷酸序列。本領域技術人員，具有在此報道的序列的益處，現在可以使用公開序列的全部或實質性部分，用于本領域技術人員已知的目的。因此，本發明包括附屬序列表中報道的完整序列，以及上述那些序列的實質性部分。術語“變體”指的是基本上相似的序列。通常，本發明的核酸序列變體具有與天然核苷酸序列至少 46%、48%、50%、52%、53%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，其中 ％序列同一性基于完整序列并通過使用默認參數的GAP 10分析來測定。通常，本發明的多肽序列具有與天然蛋白至少約 60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%序列同一性，其中 ％序列同一性基于完整序列并通過使用默認參數的GAP 10分析來測定。GAP使用Needleman和Wunsch (J.Mol.Biol.48 =443-453,1970)的算法來發現兩個完整序列的比對，其最大化相配的數量和最小化缺口的數量。術語“變體”還指含有與本發明內包含的和任意地本發明生物功能需要的基序高度相似的氨基酸序列的基本上相似的序列。通常，本發明的多肽序列變體具有與限定基序中保守氨基酸殘基至少85%、90%或95%序列同一性。在此使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域公知的且更全面地公開于Sambrook, J.&Russell, D.ff., Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊);Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor,NY 2001 (此后稱為 “Sambrook”)。本發明中包括的變體可以含有核酸或多肽序列的單個取代、刪除或添加，其改變、添加或刪除所編碼序列中的單個氨基酸或小比例的氨基酸。“保守修飾變體”是導致用化學上相似的氨基酸取代氨基酸的改變。當合成上制備或改變核酸時，可以利用確定宿主的已知密碼子偏好。本發明的核酸片段可以用于分離編碼相同或其他植物物種的同源蛋白的cDNA和基因。使用序列依賴性方案的同源基因的分離是本領域公知的。序列依賴性方案的實例包括但不限于，核酸雜交方法以及DNA和RNA擴增方法，如通過使用各種核酸擴增技術(例如，聚合酶鏈式反應、連接酶鏈式反應)擴增的。例如，可以直接分離編碼其他肌醇三磷酸激酶、肌醇四kis磷酸激酶、肌醇五kis磷酸激酶或肌醇多磷酸2-激酶的基因，作為cDNAs或基因組DNAs，使用全部或部分本發明的核酸片段作為DNA雜交探針使用本領域技術人員公知的方法，從任何所需的植物來篩選文庫。可以通過本領域已知的方法來設計和合成基于本發明核酸序列的特異性寡核苷酸探針(Sambrook)ο此外，完整序列可以用于直接合成DNA探針，通過本領域技術人員已知的方法如隨機引物DNA標記、缺口平移或末端標記技術，或用于直接合成RNA探針，使用體外可用的轉錄系統。此外，可以設計特異性引物并用于擴增本發明序列的部分或全部。可以在擴增反應過程中直接標記或擴增反應后標記所得到的擴增產物，并用作探針在合適嚴謹度的條件下分離全長cDNA或基因組片段。
此外，可以將本發明核酸片段的兩個短片段用于聚合酶鏈式反應方案中，來擴增編碼DNA或RNA同源基因的較長核酸片段。還可以在克隆的核酸片段的文庫上進行聚合酶鏈式反應，其中一個引物的序列源自本發明的核酸片段，而另一個引物的序列利用編碼植物基因的mRNA前體3’端的多腺苷酸區域存在。或者，第二個引物序列可以基于源自編碼載體的序列。例如，本領域技術人員可以按照RACE方案(Frohman等，(1988)PNAS USA 85:8998)來產生cDNA，使用PCR來擴增轉錄產物中單個點和3’或5’端之間片段的拷貝。可以從本發明的序列設計3’和5’方向定向的引物。使用可購得的3’ RACE或5’ RACE系統(Invitrogen, Carlsbad CA),可以分離特定的 3’ 或 5’ cDNA 片段(Ohara 等，(1989) PNASUSA 86:5673 ;Loh 等，(1989)Science 243:217)。可以將通過 3’和 5’RACE 程序產生的產物結合來產生全長 cDNA (Frohman, Μ.A.和 Martin, G.R.(1989) Techniques 1:165)。本發明的核苷酸以及推導的氨基酸序列的有效性促進了 cDNA表達文庫的免疫篩選。可以合成表示本發明氨基酸序列一部分的合成肽。可以將這些肽用于免疫動物來產生具有包括氨基酸序列的肽或蛋白質特異性的多克隆或單克隆抗體。然后可以將這些抗體用于篩選cDNA表達文庫來分離目標全長cDNA克隆(Lerner, R.A.(1984) Adv.1mmunol.36:I;Sambrook)ο
本發明的核酸片段可以用來建立轉基因植物，其中所公開的肌醇多磷酸2-激酶以低于正常的水平存在。對于一些應用，降低或消除植物中編碼肌醇多磷酸2-激酶基因的表達是有利的。為了實現這，可以通過將編碼肌醇多磷酸2-激酶的基因或基因片段連接植物啟動子序列來構建為共抑制本發明植酸生物合成酶而設計的嵌合基因。或者，通過將基因或基因片段以反方向可操作地連接植物啟動子序列來構建為表達本發明核酸片段全部或部分的反義RNA而設計的嵌合基因。可以通過轉化將共抑制或反義嵌合基因引入植物中，其中降低或消除相應內源基因的表達。獲得基因敲除的一種可替換方法涉及使用RNA干擾(RNAi)和轉錄后基因沉默(PTGS) [Fraser 等(2000)，Nature,408,325-330 ；Gonczy 等，(2000), Nature,408(331-336)]。將雙鏈RNA (dsRNA)引入這些生物體的細胞中導致同源基因轉錄本的序列特異性降解。通過內源核糖核酸酶Dicer的作用將長的雙鏈RNA分子減小至小的21-23個核苷酸的干擾 RNA (siRNA)。(Bernstein 等，(2001), Nature, 409, 363-366 ;Grishok 等，(2000)，Science,287 (5462)，2497-7 ;Zamore 等，(2000)，Cell,101 (I)，25-33 ;Knight，S.ff.和 B.L.Bass.(2001), Science, 293 (5538)，2269-2271)。可以在異種宿主細胞中特別是在微生物宿主的細胞中產生本發明的肌醇多磷酸2-激酶(或其部分)，并可以通過本領域技術人員公知的方法用于制備這些蛋白的抗體。抗體可用于在細胞內原位或細胞提取物體外檢測肌醇多磷酸2-激酶。用于生產本發明肌醇多磷酸2-激酶的優選異種宿主細胞是微生物宿主。含有指導外源蛋白高水平表達的調節序列的微生物表達系統和表達載體是本領域技術人員公知的。這些中的任何一個可以用來構建用于產生本發明肌醇多磷酸2-激酶的嵌合基因。然后通過轉化將該嵌合基因引入合適的微生物中來提供所編碼的植酸生物合成酶的高水平表達。可以使用(a)標準重組方法，(b)合成技術，或其組合來制得本發明的分離核酸。一些實施方案中，可以從單子葉植物 或雙子葉植物克隆、擴增或另外構建本發明的多核苷酸。單子葉植物的典型實例是玉米、高粱、大麥、小麥、黍米、大米或草坪草。典型的雙子葉植物包括大豆、紅花、向日葵、卡諾拉、苜蓿、馬鈴薯或木薯。可以使用在嚴謹條件下選擇性雜交的引物來獲得本發明中包括的功能性片段。引物通常為至少12個堿基長并可以高如200個堿基，但通常為15至75，或更可能為15至50個堿基。可以使用各種技術如限制性分析、Southern分析、引物延伸分析、PCR或DNA序列分析來鑒定功能性片段。本發明包括編碼相同氨基酸序列的多個多核苷酸。遺傳密碼的簡并性允許這樣的“沉默改變”，其可以用于例如選擇性雜交和檢測本發明多核苷酸的等位基因變體。此外，本發明包括含有等位基因變體的分離核酸。在此所用的術語“等位基因”指的是相同基因的相關核酸。例如，可以通過寡核苷酸定點誘變、連接物掃描誘變、使用聚合酶鏈式反應的誘變等來獲得本發明中包括的核酸的變體。參見，例如，Current Protocols in MolecularBiology (分子生物學中的通用方案)，Brent等編輯,Wiley和Sons, New York (2003)(此后稱為 fcent)。此外，通常參閱，McPherson (編輯)，DIRECTEDMUTAGENESIS:A PracticalApproach (定點誘變:一種實踐方法)，(IRL Press, 1991)0因此，本發明還包括DNA分子，該分子含有具有與本發明序列實質性序列相似性的核苷酸序列。對于特定的核酸序列，保守修飾變體指的是編碼相同氨基酸序列或其保守修飾變體的那些核酸。由于遺傳密碼的簡并性，很多功能上相同的核酸編碼任一個給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶全部編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定的丙氨酸的每個位置，可以將密碼子改變成所述相應密碼子中的任何一個而沒有改變所編碼的多肽。這樣的核酸變化是“沉默變化”并表示保守修飾變化中的一種形式。通過參照遺傳密碼，在此編碼多肽的每個核酸序列還描述了每個可能的核酸沉默變化。本領域技術人員將認識到可以改變核酸中的每個密碼子(除了 AUG，這是通常甲硫氨酸僅有的密碼子；和UGG，這是通常色氨酸僅有的密碼子)來產生功能上相同的分子。因此，每個所述的多肽序列中暗示著編碼本發明多肽的核酸的每個沉默變化并在所要求的本發明的范圍內。同樣對于氨基酸序列，本領域技術人員將認識到改變、添加或刪除所編碼序列中單個氨基酸序列或小比例氨基酸序列的核酸、肽、多肽或蛋白質序列的單個取代、刪除或添加是“保守修飾變體”，其中改變導致由化學上相似的氨基上替代氨基酸。因此，可以改變選自I至50整數的任何數量的氨基酸殘基。因此，例如，可以形成1、2、3、14、25、37、45或50個改變。保守修飾變體通常提供和產生其的未修飾多肽序列相似的生物活性。例如，底物特異性、酶活性或配體/受體結合通常是天然蛋白對其天然底物的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本領域公知的。
例如，以下六組各自包含對于另一個是保守置換的氨基酸:I)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。請參閱，(Creighton(1984)Protein ff.H.Freeman and Company),也可以使用本領域已知的其他可接受的保守置換模式，如序列比較程序的得分矩陣，如GCG程序包、BLAST或 CLUSTAL。所要求的本發明還包括通過本發明的多核苷酸序列改組產生的“shufflent”，來獲得所需的特征。序列改組描述于PCT申請N0.96/19256中。請參閱，Zhang，J.H.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 94:4504-4509 (1997)。本發明還包括5’和/或3’ UTR片段用于調節異種編碼序列的轉錄或翻譯的通途。正向序列基序包括翻譯啟動保守序列(Kozak, Nucleic Acids Res.15:8125 (1987))和7-甲基鳥苷帽子結構(Drummnd等,NucleicAcids Res.13:7375 (1985)。反向兀件包括穩定的分子內5’UTR莖-環結構(Muesing等，Cell 48:691 (1987))和AUG序列或5’UTR中前面為合適AUG的短開放閱讀框(Kozak，上文，Rao等，Mol.Cell.Biol.8:284 (1988))。此外，可以修飾本發明多核苷酸的多肽編碼片段來改變密碼子使用。改變的密碼子使用可以用來改變翻譯率。可以使用可購得的軟件包如從GCG, University ofWisconsin Genetics Computer Group 可獲得的 “Codon Preference” 來統計學分析本發明多核苷酸編碼片段中的密碼子使用(參見Devereaux等，NucleicAcids Res.12:387-395(1984)。例如，可以將本發明的核酸或其反義對應部分最佳化，用于提高在目標植物中的表達。參見，例如，Perlak 等(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:3324-3328 ;和 Murray等(1989)Nucleic Acid Res.17:477_498，其公開內容在此引入作為參考。如此，可以使用植物優選的密碼子來合成多核苷酸。本發明提供了包括分離核酸的子序列，該分離核酸含有所要求序列的至少20個鄰接堿基。例如，分離的核酸包括含有所要求序列至少25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1，000、1，500 或 2，000 個鄰接核苷酸的那些。通過引
入結合、插入、分裂和/或交聯核酸的子序列化合物，分離核酸的子序列可以用于調節或檢測基因表達。本發明所要求的核酸可以方便地包括多克隆位點，包括插入核酸中來幫助多核苷酸分離的一個或多個核酸內切酶的限制位點。此外，可以將可翻譯的序列插入來幫助本發明翻譯的多核苷酸的分離。例如，六-組氨酸標記序列或GST融合序列，提供了方便的純化本發明所要求蛋白質的方法。可以將本發明要求的多 核苷酸連接用于本發明多核苷酸克隆和/或表達的載體、適配子、啟動子、轉運肽或連接物。可以將另外的序列加入這樣的克隆和/或表達序列中來最佳化它們在克隆和/或表達中的功能、幫助多核苷酸的分離或提高多核苷酸進入細胞中的效率。克隆載體、表達載體、適配子和連接物的使用是本領域公知的并在本領域得到廣泛描述。對于這樣的核酸的描述，參見例如，Stratagene Cloning Systems, 2004目錄(LaJolla, Calif.);和 Amersham BioSciences, Inc, 2004 目錄(Piscataway, N.J.)。可以使用本領域技術人員已知的許多克隆方法從植物生物來源獲得本發明的分離核酸組合物，如RNA、cDNA、基因組DNA或其混合物。一些實施方案中，使用在嚴謹條件下與本發明的多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針來鑒定cDNA文庫或基因組DNA文庫中所需的序列。不范性總RNA 和 mRNA 分離方案描述于 Plant Molecular Biology: ALaboratoryManual (植物分子生物學:實驗室手冊)，Clark編輯，Springer-Verlag, Berlin (1997)和Brent0 從銷售商如 Stratagene (La Jolla, Calif.)、Clonetech (Palo Alto, Calif.)、Amersham BioSciences (Piscataway,N.J.)和 5，-3’ (Paoli’Pa.)可購得總 RNA 和 mRNA分離試劑盒。請參閱，U.S.專利N0.5，614，391 ;和5，459，253。典型的cDNA合成方案是本領域技術人員公知的并描述于這樣的標準參考文獻中如:Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual (植物分子生物學:實驗室手冊)，Clark 編輯，Springer-Verlag,Berlin (1997)和 Brent。從多個商業銷售商如 Stratagene和Pharmacia可購得cDNA合成試劑盒。Carninci 等，Genomics 37:327-336 (1996)描述了構建高于 95% 純的全長 cDNA文庫的示范性方法。用于產生全長文庫的其他方法是本領域已知的。參見，例如，Edery等，Mol.Cell Biol.15 (6):3363-3371 (1995)和 PCT 申請 W096/34981。通常方便地將cDNA文庫標準化來建立其中每個克隆得到更相等表示的文庫。很多標準化cDNA文庫的方法是本領域已知的。標準化文庫的構建描述于Ko，Nucl.Acids.Res.18 (19):5705-5711 (1990) ；Patanjali 等，Proc.Natl.Acad.U.S.A.88:1943-1947(1991) ；U.S.專利 N0.5, 482, 685 和 5, 637, 685 和 Soares 等，Proc.Natl.Acad.USA 91:9228-9232 (1994)。消減cDNA文庫是另一種提高較低豐度⑶NA物質比例的方法。參見，Foote等，Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual(植物分子生物學:實驗室手冊)，Clark編輯，Springer-Verlag, Berlin (1997)中；Kho 和 Zarbl, Technique 3 (2):58-63 (1991);Sive 和 St.John, Nucl.Acids Res.16 (22): 10937 (1988) ；Brent ;和 Swaroop 等,Nucl.Acids Res.19 (8):1954 (1991)。cDNA 消減試劑盒是可購得的。參見，例如，PCR-Select(Clontech)0為了構建基因組文庫，通過隨機片段化產生大片段的基因組DNA。可在Sambrook和 Methods in Enzymology (酶學中的方法)，Vol.152:Guide to Molecular CloningTechniques(分子克隆技術指導)，Berger 和 Kimmel 編輯，San Diego:Acadmic Press, Inc.(1987), Brent ；Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual (植物分子生物學:實驗室手冊)，Clark編輯，Springer-Verlag, Berlin (1997)中找到合適的分子生物技術和說明的實例。用于構建基因組文庫的試劑盒也是可購得的。cDNA或基因組文庫可以使用本領域技術人員已知的方法使用PCR來直接篩選，或使用基于本發明的核酸序列如在此公開那些的探針來篩選。探針可以用于與基因組DNA或cDNA序列雜交來分離相同或不同植物物種中的同源多核苷酸。本領域技術人員將認識到可以在測試中使用各種程度的雜交嚴謹性；雜交或洗滌介質可以是嚴謹的。可以通過溫度、離子強度、PH和部分變性溶劑如甲酰胺的存在來控制嚴謹性的程度。通常，嚴謹雜交條件是那些:其中在pH7.0至8.3鹽濃度低于約1.5M Na離子，通常約0.01至1.0MNa離子濃度(或其他鹽)，對于短探針(例如，10至50個核苷酸)的溫度是至少約30°C，對于長探針(例如，高于50個核苷酸)的溫度是至少約60°C，還可以通過添加去穩定劑如甲酰胺來獲得嚴謹條件。`示范性的低嚴謹條件包括在37°C使用30至35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基硫酸鈉)緩沖溶液的雜交和在50°C IX至2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中的洗滌。示范性的中等的嚴謹條件包括在37 V使用40至45%甲酰胺、IMNaCl、1%SDS的溶液雜交和在55°C 0.5X至IXSSC中洗滌。示范性的高嚴謹條件包括在37°C在50%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS中的雜交和在60°C 0.1 X SSC中的洗滌。通常雜交時間為4至16小時。可在 Tssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic acid Probes(生物化學和分子生物學中的實驗室技術一用核酸探針的雜交)，第I部分，第2章“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probes assays”(雜交原理和核酸探針測試策略的綜述)，Elsevier, N.Y.1993)和Brent中發現核酸雜交的進一步的指導。通常,將cDNA文庫標準化來提高相對稀少的cDNAs的表示。可以使用擴增技術從核酸樣品如植物核酸樣品擴增本發明的核酸。例如，聚合酶鏈式反應(PCR)技術可以用來從基因組DNA文庫、cDNA文庫或通常從內含子加工的任何階段的核轉錄產物構建的文庫來直接擴增本發明的多核苷酸序列和相關的多核苷酸。可以從各種植物組織如穗、秧苗、葉、莖、根、花粉或種子形成文庫。PCR和其他體外擴增方法還可以用于例如克隆編碼待表達蛋白質的核酸序列、形成用作探針的核酸，用于檢測樣品中所需mRNA的存在、用于核酸測序或用于其他目的。用于體外擴增方法的技術實例可在Berger, Sambrook和Brent以及Mullis等，U.S.專利N0.4，683，202( 1987);和 PCR Protocols A Guide to Methods andApplications(PCR 方案:方法和應用指南)，Innis 等編輯，Academic Press Inc.San Diego, Calif.(1990)中找到。用于基因組PCR擴增的可購得試劑盒是本領域已知的。參見，例如，優勢-GC-基因組PCR試劑盒(Clontech)。T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可以用來提高長PCR產物的產量。基于PCR的篩選方法也已經得到了描述。Wilfinger等描述了一種基于PCR的方法，其中在第一個步驟中鑒定出最長的cDNA，使得可以從研究中消除不完整的克隆。Bio Techniques, 22 (3):481-486 (1997)。或者，本發明的序列可以用于分離其他生物體中的相應序列，特別是其他植物，更特別的是其他單子葉植物。如此，如PCR、雜交等的方法可以用來鑒定這樣與本發明序列具有實質性序列相似性的序列。參見，例如，Sambrook和Innis等(1990),PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (PCR 方案:方法和應用指南)(Academic Press,New York)。本發明包括基于與在此所示的完整本發明編碼序列或其部分的序列同一性的分離的編碼序列。還可以通過以下方法通過直接化學合成來制備本發明的分離核酸，如Narang等，Meth.Enzymol.68:90-99 (1979)的憐酸三酯法；Brown 等，Meth.Enzymol.68: 109-151(1979)的磷酸二酯法；Beaucage 等，Tetra.Lett.22:1859-1862 (1981)的二乙基磷酰胺法；Beaucage 和 Caruthers 所述的固相憐酸胺三酯法，Tetra.Lett.22(20):1859-1862( 1981),例如，使用自動化合成儀，例如Needham-VanDevanter等所述的,Nucleic Acids Res.12:6159-6168 (1984);和U.S.專利N0.4，458，066的固相支持法。化學合成通常產生單鏈寡核苷酸。可以通過與互補序列的雜交，或使用單鏈作為模板通過DNA聚合酶的聚合將這轉化成雙鏈DNA。本領域技術人員將認識到盡管化學合成的DNA限于約100個堿基的序列，但通過較短序列的連接可以獲得較長的序列。本發明核酸片段的全部或實質性部分還可以用作探針，用于遺傳上和物理上對其為部分的基因作圖，和用作用于與那些基因相關的性狀的標記。為了產生具有所需表型的系，這樣的信息可用于植物育種中。例如，本發明的核酸片段可以用作限制性片段長度多態性(RFLP)標記。可以用本發明的核酸片段來探測限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Sambrook)。然后將所得到的條帶模式接受遺傳分析，使用計算機程序如MapMaker(Lander等，(1987)Genomics 1:174-181)來構建遺傳圖譜。此外,本發明的核酸片段可以用于探測含有一組表示限定遺傳交叉的親本和后代的限制性核酸內切酶處理的基因組DNA的Southern印跡。注意DNA多態性的分離并用于計算本發明的核酸序列在之前使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein，D.等(1980) Am.J.Hum.Genet.32:314-331 )。R.Bernatzky, R.和 Tanksley, S.D.(1986) Plant Mol.Biol.Reporter 4 (I):37-41中描述了遺傳作圖中所用的植物基因衍生的探針的產生和使用。多種出版物描述了使用上述方法或其改進的特定cDNA克隆的遺傳作圖。例如，F2雜交群、回交群、隨機配對群、近等基因系和其他系列的個體可以用于作圖。這樣的方法是本領域技術人員公知的。源自本發明核酸序列的核酸探針還可以用于物理作圖(B卩，序列在物理圖上的安置；參見 Hoheisel, J.D.等， 在:NonmammaIian Genomic Analysis:A Practical Guide(非哺乳動物基因組分析:實踐指導)，Academic Press 1996，pp.319-346，且在此引為參考)。另一個實施方案中，源自本發明核酸序列的核酸探針可以用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖中(Trask，B.J.(1991) Trends Genet.7:149-154)。盡管 FISH 作圖的通用方法偏愛使用大的克隆(幾至幾百KB ;參見Laan，M.等(1995)Genome Research 5:13-20),靈敏度的提高可以允許使用較短的探針來進行FISH作圖。可以使用本發明的核酸序列進行各種基于核酸擴增的遺傳和物理作圖方法。實例包括等位基因特異性擴增(Kazazian，H.H.(1989) J.Lab.Clin.Med.114 (2):95-96), PCR擴增片段的多態性(CAPS !Sheffield，V.C.等(1993) Genomics 16:325_332)，等位基因特異性連接(Landegren, U 等(1988) Science 241:1077-1080),核苷酸延伸反應(Sokolov,B.P.(1990) Nucleic Acid Res.18:3671)，照射雜交作圖(Walter，Μ.Α.等(1997) NatureGenetics 7:22-28)和快樂作圖(Dear，P.H.和 Cook，P.R.(1989) Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。對于這些方法，將核酸片段的序列用于設計和產生擴增反應或引物延伸反應中所用的引物對。這樣引物的設計是本領域技術人員公知的。使用基于PCR的遺傳作圖方法中，必需鑒定對應于本發明核酸序列的片段中作圖交叉親本之間的DNA序列差異。然而，這對于作圖方法通常是不需要的。對于本發明的cDNA克隆可以鑒定功能突變表型的丟失，通過靶向基因破壞方案或通過鑒定攜帶所有可能基因突變的群體中所含這些基因的特定突變(Ballinger和Benzer, (1989) Pr oc.Natl.Acad.Sci USA 86:9402 ；Koes 等(1995) Proc.Natl.Acad.SciUSA 92:8149 ;Bensen等，(1995) Plant Cell 7:75)。可以以幾種方式來完成后一種方法。首先，將本發明核酸片段的短片段用于從植物群制得的DNA的聚合酶鏈式反應中，結合突變標記物序列引物，植物中已經引入了增變基因轉座子或一些其他引起突變的DNA元件(參見Bensen，上文)。用這些引物的特定DNA片段的擴增顯示出突變標記物元件插入編碼肌醇多磷酸2-激酶的植物基因中或附近。或者，本發明的核酸片段可以用作從突變群產生的使用突變標記物序列引物，結合隨機基因組位點引物，如用于限制酶位點錨定的合成適配子PCR擴增產物的雜交探針，。第三，可以將突變作圖于特定基因內，使用能夠在錯配處切斷的單鏈核酸內切酶(Till等，(2004)，Nucleic Acids Res.32:2632-41 )，一種稱為TILLING的方法。最后，使用本領域技術人員已知的PCR方法來鑒定刪除，如US專利申請20050053975和如下本發明的實施例中所述的。使用每種方法，可以鑒定和獲得含有編碼肌醇多磷酸2-激酶內源基因突變的植物。然后可以將該突變植物用于測定或證實基因產物的天然功能。本發明的蛋白質包括具有公開序列的蛋白質以及由公開的多核苷酸編碼的蛋白質。此外，本發明的蛋白質包括通過在天然蛋白質的一個或多個位點刪除、添加或置換一個或多個氨基酸而源自天然蛋白質的蛋白質。這樣的變體可以由例如遺傳多態性或人工操縱獲得。這樣的操縱方法通常是本領域已知的。例如，可以通過克隆的編碼目標天然蛋白的DNA序列中的突變來制得多肽的氨基酸序列變體。用于誘變和核苷酸序列改變的方法是本領域公知的。參見，例如，Walker和Gaastra 編輯，(1983)Techniques in Molecular Biology (分子生物學技術)(MacMillanPublishing Company,New York)；Kunkel (1985) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:488-492;Kunkel 等(1987) Methods Enzymo1.154:367-382 ；Sambrook ；U.S.專利 N0.4, 873, 192 ;和在此引用的參考文獻；在此引入作為參考。本領域技術人員將容易理解關于沒有影響本發明蛋白質生物活性的合適氨基酸置換的指導。保守置換，如將一個氨基酸與另一個具有相似特性的交換，是優選的。在構建目標蛋白變體中，通常進行編碼變體的核苷酸序列的修飾，使得變體繼續具有所需的活性。本發明的分離蛋白質包括含有由本發明任一核酸編碼的至少25個鄰接氨基酸的多肽，或其保守修飾變體的多肽。本發明的蛋白或其變體可以包括任何數量的來自本發明多肽的鄰接氨基酸殘基，其中數目選自25至本發明全長多肽殘基數目的整數。任意地，這種鄰接氨基酸的序列是至少25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350,400,450或500個氨基酸長。本發明包括催化上活性的多肽(B卩，酶)。催化上活性的多肽通常具有天然(非合成)內源多肽的至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的特異性活性。此外，對于每種活性，底物特異性可以任意地與天然(非合成的)內源多肽基本上相似。通常，對于任何給定的底物，Km將至少是天然(非合成)內源多肽的約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。測定和定量測量酶活性和底物特異性(Keat/Km)的方法是本領域技術人員公知的。參見,例如，Segel,Biochemical Calculation (生物化學計算),第 2 版,John Wileyand Sons, New York (1976)。本發明包括對本發明蛋白質形成的修飾。特別地，所希望的是減少基因的活性。可以形成其他修飾來促進克隆、表達或將靶向分子引入融合蛋白質中。這樣的修飾是本領域技術人員公知的并包括，例如，在氨基末端添加甲硫氨酸來提供啟動位點，或將另外的氨基酸或肽(例如，多His、GST等)置于任一個末端來形成方便定位的限制性位點或終止密碼子或純化。本發明的蛋白質，一旦得到表達，可以從細胞中分離出來，通過裂解細胞并對裂解物應用標準分離技術。通過使用Western印跡技術或放射性免疫測定或其他標準免疫測定技術來完成純化過程的監控。還可以利用指導表達的蛋白質從細胞分泌至培養基中的表達盒。在這些情況中，可以使用標準蛋白純化技術從細胞生長培養基中純化表達的蛋白。還可以使用非細胞合成方法來構建本發明的蛋白質。通過將序列的C-端氨基酸連接不溶的支持物接著順次添加序列中剩余的氨基酸來完成低于約50個氨基酸長的蛋白質固相合成。用于固相合成的技術描述于Barany和Merrifield, Solid-Phase PeptideSynthesis (固相妝合成)，pp.3-284,在 The Peptides:Analysis, Synthesis,Biology (肽:分析、合成、生物學)中，Vol.2:Special Methods in Peptide Synthesis (妝合成的特定方法)，A 部分；Merrifield 等，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156 (1963),和 Stewart 等，Solid-Phase Peptide Synthesis(固相妝合成),第 2 版,Pierce Chem.C0., Rockfrd, II1.(1984)。可以通過較短片段的氨基和羧基端的縮合來合成更長的蛋白質。通過羧基端的激活(例如，通過使用耦合劑N，N’ - 二環己基碳化二亞胺)形成肽鍵的方法是本領域技術人員已知的。 可以通過本領域公知的標準技術將本發明的蛋白質(重組或合成)純化至實質性的純度，這些技術包括去污劑溶解、用如硫酸銨這樣物質的選擇性沉淀、柱色譜、免疫純化方法等等。參見，例如，R.Scpoes,Protein Purification:Principles and Practice(蛋白質純化:原理和實踐)，Springer-Verlag:New York (1982) ；Deutscher, Guide to ProteinPurification (蛋白質純化的指導),Academic Press (1990)。例如,可以制備在此所述蛋白的抗體。按照U.S.專利N0.4，511，503中所述的方法可以獲得從大腸桿菌(E.coli)的純化。檢測本發明蛋白的方法不是本發明的關鍵方面。可以使用許多公知的免疫結合測定來檢測和/或定量蛋白質(參見，例如，U.S.專利N0.4，366，241 ;4，376，110 ;4，517，288 ；和4，837，168)。對于一般免疫測定的綜述，請參閱Methods in Cell Biology (細胞生物學中的方法)，Vol.37:Antibodies in Cell Biology (細胞生物學中的抗體)，Asai編輯,Academic Press, Inc.New York (1993) ；Basic and Clinical Immunology (基石出和臨床免疫學)，第7版，Stites&Terr編輯(1991)。此外，可以在幾種構造中的任何一種進行本發明的免疫測定，例如Enzyme Immunoassay (酶免疫測定)中綜述的那些，Maggio編輯，CRCPress,Boca Raton, Fla.(1980)；Tijan,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(酶免疫測定的實踐和理論)，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology (生物化學和分子生物學中的實驗室技術)，Elsevier Science Pulishers B.V.,Amsterdam (1985);Harlow 和 Lane,上文；Immunoassay: A Practical Guide (免疫測定:實踐指導)，Chan 編輯，Academic Press, Orlando, Fla.(1987) ；Principles and Practiceof Immunoassays (免疫測定的原理和實踐)，Price 和 Newman 編輯，Stockton Press, NY(1991)和 Non-1sotopic Immunoassays (非同位素免疫測定)，Ngo 編輯，Plenum Press, NY
(1988)。常用的方法包括Western印跡(免疫印跡)分析、分析生物化學方法如電泳、毛細管電泳、高性能液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、超擴散色譜等，和各種免疫方法如流體或凝膠沉淀素反應、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、放射性免疫測定(RIAs)、酶聯免疫吸附測定(ELISAs)、免疫熒光測定等。

通常通過間接方法來連接非放射性標記。通常，將配體分子(例如，生物素)共價連接分子。配體然后結合抗配體分子(例如，抗生蛋白鏈菌素)，該分子本身是可檢測的或共價結合信號系統如可檢測的酶、熒光化合物或化學發光化合物。可以使用多種配體和抗配體。在配體具有天然抗配體的情況中，例如，生物素、甲狀腺素和氫化可的松，可以結合標記的天然產生的抗配體使用。或者，任何半抗原或抗原化合物可以結合抗體使用。還可以將分子直接綴合產生信號的化合物，例如，綴合酶或熒光團。作為標記的目標酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、傘形酮等。化學發光化合物包括蟲螢光素和0.2, 3- 二氫酞嗪二酮(0.2, 3-dihydrophthalazinediones),例如，發光氮(luminol)。對于各種可以使用的標記或產生信號系統的綜述，參見，U.S.專利N0.4，391，904，在此將其引入作為參考。一些測定形式不需要使用標記的化合物。例如，凝集試驗可以用于檢測目標抗體的存在。在這種情況中，通過含有目標抗體的樣品使涂覆抗原的顆粒凝聚。在這種形式中，任何一種成分都不需要標記，通過簡單目測來檢測目標抗體的存在。本發明的蛋白可以用于鑒定結合(例如，底物)，和/或提高或降低(B卩，調節)本發明催化活性多肽的酶活性的化合物。該方法包括將本發明的多肽接觸待測定其結合或調節酶活性能力的化合物。所用的多肽具有至少本發明天然全長多肽(例如，酶)特定活性的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。測量酶動力學的方法是本領域公知的。參見，例如，Segel, Biochemical Calculation (生物化學計算)，第 2 版，John Wiley and Sons,New York (1976)0可以制備本發明蛋白的抗體，蛋白包括單個的、等位基因的、菌株或物種變體或其片段，以天然產生(全長)形式或重組或合成形式。此外，可以制備這些蛋白天然構型或非天然構型的抗體。還可以產生抗獨特型抗體。制造抗體的許多方法是本領域技術人員已知的。在一些情況中，所希望的是從各種哺乳動物宿主如小鼠、嚙齒動物、靈長類、人等制備單克隆抗體。用于這樣單克隆抗體的技術描述可在例如Basic and ClinicalImmunology (基礎和臨床免疫學)，第 4 版，Stites 等編輯，Lange Medical Publications,Los Altos, Calif.，和其中引用的參考文獻；Harlow 和 Lane,上文；Goding, MonoclonalAntibodies !Principles and Practice (單克隆抗體:原理和實踐)，第 2 版，AcademicPress, New York，N.Y.(1986);和 Kohler 和 Milstein，Nature 256:495-497 (1975)。其他合適的技術涉及噬菌體或相似載體中重組抗體文庫的選擇(參見，例如，Huse 等，Science 246:1275-1281 (1989);和 Ward 等，Nature 341:544-546 (1989);和Vaughan 等，Nature Biotechnology 14:309-314 (1996))。或者，從含有未重排人重鏈和輕鏈Ig基因座片段的轉基因小鼠(即，微小基因座轉基因小鼠)獲得高親和力的人單克隆抗體。Fishwild等，Nature Biotech.14:845-851 (1996)。此外，可以產生重組免疫球蛋白 ο 參見，Cabilly, U.S.專利 N0.4, 816, 567 和 Queen 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.86:10029-10033 (1989)。本發明的抗體可以用于分離本發明蛋白的親和性色譜中、用于篩選特定表達產物如正常或異常蛋白的表達文庫或用于制備用于檢測或診斷與各自抗原存在相關的各種病理狀況的抗獨特型抗體。

通常，可以通過結合(共價或非共價)提供可檢測信號的物質來標記本發明的蛋白和抗體。多種標記和綴合技術是已知的且在科學和專利文獻中有大量報道。合適的標記包括放射性核苷酸、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、化學發光部分、磁性顆粒等。本發明進一步提供了調節(S卩，降低)植物或其部分中本發明要求的多肽的濃度或組成的方法。可以通過提高或降低植物中的濃度和/或組成(即，本發明要求的多肽的比例)來實現調節。該方法包括用包括反義核苷酸序列的表達盒轉化植物細胞，該反義核苷酸序列與以下的序列基本上互補:(I)編碼肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子的一條鏈的對應部分，其中編碼肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子在低嚴謹條件下與SEQ ID NO:1雜交或(2)由編碼肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子編碼的RNA序列的對應部分；和(b)可操作地連接反義核苷酸序列的調節序列，使得反義核苷酸序列在其轉化進入的植物細胞中表達。一些實施方案中，通過改變(體內或體外)本發明非分離基因的啟動子來下調基因表達可以降低植物中本發明多肽的含量和/或組成。一些實施方案中，通過置換、添加、插入或刪除來降低所編碼酶的活性可以改變本發明天然基因的編碼片段。參見，例如，Kmiec，U.S.專利N0.5，565，350 ；Zarling等，PCT/US93/03868。下調蛋白的一種方法涉及使用提供蛋白降解目標的PEST序列。
一些實施方案中，將含有啟動子序列的分離核酸(例如，載體)轉染至植物細胞中。隨后，通過本領域技術人員已知的方法來選擇包括可操作地連接本發明多核苷酸的啟動子的植物細胞，這些方法如但不限于，Southern印跡、DNA測序或使用啟動子以及特異性引物檢測基因和從其產生的基因和擴增子的PCR分析。將通過上述實施方案改變或修飾的植物或植物部分在植物形成條件下種植足以降低植物中本發明多肽濃度和/或組成的時間。植物形成條件是本領域公知的。通常，相對于缺少上述表達盒的天然對照植物、植物部分或細胞，多肽含量提高或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。本發明中的調節可以發生在植物生長至所需發育階段的過程之中和/或之后。通過使用可操作地連接的本發明多肽的合適啟動子來暫時控制調節核酸表達和/或特別在組織中，如上文更詳細地討論的例如反義方向。還可以通過外部給予有效量的誘導化合物來控制本發明多核苷酸表達的誘導。誘導型啟動子和激活這些啟動子表達的誘導化合物是本領域公知的。特定實施方案中，在單子葉植物或雙子葉植物例如玉米、大豆、向日葵、紅花、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、大米、大麥和黍米中調節本發明的多肽。轉化方法對于本發明不是關鍵的；各種轉化方法是目前可用的。因為較新的方法可用于轉化可以直接應用的作物或其他宿主細胞。因此，已經產生了多種方法將DNA序列插入宿主細胞的基因組中來獲得序列的轉錄和/或翻譯來實現生物體中的表性改變。因此，可以使用提供有效轉化/轉染的任何方法 。編碼本發明所需多核苷酸的DNA序列，例如編碼全長蛋白的cDNA或基因組序列，可以用于構建引入所需植物中的表達盒。可以根據本領域的已知技術將本發明的分離核酸引入植物中。通常，制備如上所述的且適用于轉化植物細胞的表達盒。用于轉化多種高等植物物種的技術是公知的并描述于技術、科學和專利文獻中。參見，例如，Weising 等，Ann.Rev.Genet.22:421-477 (1988)。例如，可以將 DNA 構建體直接引入植物細胞中的基因組DNA中，使用如電穿孔、PEG穿孔、基因槍轟擊、硅纖維傳送或植物細胞原生質體或胚性愈傷組織的微注射的技術。參見，例如，Tomes等，Direct DNATransfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment(通過微注身寸轟擊指導DNA轉移至完整植物細胞中),pp.197-213在Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Fundamental Methods (植物細胞、組織和器官培養，基礎方法)中，編輯0.L.Gamborg和 G.C.Phillips, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995。或者，可以將DNA構建體結合合適的T-DNA側翼片段并引入常規的根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefacients)宿主載體中。當細菌感染細胞時，根癌農桿菌宿主的侵入性功能將指導構建體和鄰接的標記插入植物細胞DNA中。參見，U.S.專利N0.5，591，616。使用聚乙二醇沉淀的DNA構建體引入描述于Paszkowski等，Embo J.3 =2717-2722(1984)中 ο 電穿孔技術描述于 Fromm 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.82:5824 (1985)中。彈道轉化技術(Ballistic transformation)描述于 Klein 等,Nature327:70-73 (1987)。根癌農桿菌介導的轉化技術充分描述于科學文獻中。參見，例如Horsch等，Science 233:496-498( 1984)，和 Fraley 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.80:4803( 1983)。例如，玉米的根癌農桿菌描述于U.S.專利N0.5，981，840中。大豆的根癌農桿菌描述于U.S.專利 N0.5，563，055 中。
其他的轉化方法包括(I)發根農桿菌(Agobacterium rhizognes)介導的轉化(參見，例如，Lichtenstein 和 Fuller,在:Genetic Rngineering (遺傳工程)中，Vol.6,P.W.J.Rigby 編輯，London, Academic Press, 1987 和 Lichtenstein, C.P.和 Draper, J.,在DNA Cloning(DNA 克隆)中，Vol.11，D.M.Glover 編輯，Oxford，IRI Press, 1985),申請 PCT/US87/02512 (W088/02405，1988年4月7日公開)描述了使用發根農桿菌菌株A4及其Ri質粒和根癌農桿菌載體PARC8或pARC16，(2)脂質體介導的DNA吸收(參見，例如，Freeman等，Plant Cell Physiol.25:1353 (1984))，和(3)渦旋法(參見，例如，Kindle，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 87:1228 (1990))。還可以通過指導DNA轉移至花粉中來將DNA引入植物中，如Zhou等所述的，Methods in Enzymology 101:433 (1983) ；D.Hess,Intern Rev.Cytol.,107:367 (1987);Luo等，Plant Mol.Biol.Reporter 6:165 (1988)。可以通過將DNA注射至植物的生殖器官中來獲得編碼多肽的多核苷酸表達，如Pena等所述的，Nature 325:274 (1987)。還可以將DNA直接注射至未成熟胚中并使干燥的胚復水，如Neuhaus等所述的，Theor.Appl.Genet.75:30 (1987)和 Benbrook 等，在 Proceedings Bio Expo 1986 中，Butterworth,Stoneham, Mass., pp.27-54 (1986)。對于通過各種方法的轉化，動物和低等真核生物(例如，酵母)宿主細胞是能勝任的或給予能力的。存在幾種公知的將DNA引入動物細胞中的方法。這些包括:磷酸鈣沉淀、受體細胞與含有DNA的細菌原生質體 的融合、用含有DNA的脂質體處理受體細胞、DEAE葡聚糖、電穿孔、基因槍(Biolistics)和將DNA直接微注射至細胞中。通過本領域公知的方法培養轉染的細胞。Kuchler, R.J.，Biochemical Methods in Cell Culture and Virology(細胞培養和病毒學中的生物化學方法)，Dowden, Hutchinson and Ross, Inc.(1977)。可以培養通過上述任一種轉化技術產生的轉化植物細胞來再生具有轉化基因型的完整植物。這樣的再生技術通常依賴于組織培養生長培養基中特定植物激素的操縱，通常依賴于已經和本發明的多核苷酸一起引入的殺菌劑和/或除草劑標記。對于玉米的轉化和再生，參見 Gordon-Kamm 等，The Plant Cell 2:603-618 (1990)。可以根據標準植物組織培養技術例如從單個細胞、愈傷組織或葉圓片再生用植物表達載體轉化的植物細胞。本領域公知幾乎任何植物的各種細胞、組織和器官可以成功地培養來再生完整的植物。從培養的原生質體的植物再生描述于Evans等，ProtoplastsIsolation and Culture,Handbook of Plant Cell Culture(原生質體分離和培養,植物細胞培養手冊)，MacmiIIan Publishing Company,New York,pp.124-176 (1983)和 Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts(植物再生，植物原生質體)，CRC Press,BocaRaton,pp.21-73 (1985)。可以實現含有通過農桿菌引入的外源基因的植物再生,如Horsch等，Science,227:1229-1231 (1985)和 Fraley 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.80:4803 (1983)。這種方法通常在兩至四周內產生幼芽，然后將這些轉化子幼芽轉移至合適的誘導根的培養基中，培養基含有選擇性試劑和防止細菌生長的抗生素。本發明的轉基因植物可以是能繁殖的或不能繁殖的。還可以從植物愈傷組織、外植體、器官或其部分實現再生。這樣的再生技術概括地描述于Klee等,Ann.Rev.Plant Phys.38:467-486(1987)。從單個植物原生質體或各種外植體的植物再生是本領域公知的。參見,例如,Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物學方法)，A.Weissbach和H.Weissbach編輯,Academic Press, Inc., San Diego,Calif.(1988)。對于玉米細胞培養和再生一般參見The Maize Handbook (玉米手冊)，Freeling 和 Walbot 編輯，Springer, New York (1994)；Corn and Corn Improvement (玉米和玉米改良)，第 3 版，Sprague 和 Dudley 編輯，American Society of Agronomy, Madison,ffis.(1988)。本領域技術人員將認識到將表達盒穩定地引入轉基因植物中并證實是可操作的之后，可以通過性交將其引入其他植物中。根據待雜交的物種，可以使用許多標準育種技術。在生長繁殖的作物中，可以通過插枝、通過單性生殖種子的產生或通過組織培養技術使成熟轉基因植物繁殖來產生多個相同的植物。進行所需轉基因的選擇并獲得新的品種并生長繁殖用于商業用途。在種子繁殖的作物中，可以將成熟轉基因植物自交來產生純合近親繁殖植物。近親繁殖植物產生含有新引入的異種核酸的種子。使這些種子生長來產生將產生選定表型的植物。本發明包括從再生植物獲得的部分，如花、種子、葉、枝條、果實等，只要這些部分包括含有本發明分離核酸的細胞。再生植物的后代和變體以及突變體也包括于本發明的范圍內，只要這些部分包括引入的核酸序列。可以通過例如標準免疫印跡和DNA檢測技術篩選表達選擇標記的轉基因植物來用于本發明核酸的傳播。還通常評價轉基因系的異種核酸的表達水平。最初測定RNA水平的表達來鑒定和定量表達陽性的植物。使用RNA分析的標準技術，包括使用設計的只擴增異種RNA模板的寡核苷酸引物的PCR擴增測試和使用異種核酸特異性探針的溶液雜交測試。然后通過Weste rn免疫印跡分析使用本發明的特定反應性抗體來分析RNA-陽性植物的蛋白質表達。此外，根據標準方案進行原位雜交和免疫細胞化學，使用異種核酸特異性多核苷酸探針和抗體各自來定位轉基因組織內的表達位點。通常，為了引入的核酸通常篩選許多轉基因系來鑒定和選擇具有最合適表達特征的植物。本發明的轉基因植物對于添加的異種核酸可以是純合的；即，轉基因植物含有兩個添加的核酸序列，一個基因位于染色體對的每條染色體上的相同基因座。通過將含有單個添加的異種核酸的異種轉基因植物性交(自體受精)來獲得純合轉基因植物，使一些所產生的種子萌芽并分析所產生植物的本發明多核苷酸相對于對照植物(即，天然的、非轉基因的)改變的表達。還計劃了與親本植物的回交以及與非轉基因植物的異交。或者，通過無融合生殖來完成異種轉基因植物的繁殖。本發明提供了含有本發明多核苷酸植物的基因型測定方法。基因型測定提供了辨別染色體對同系物的方法并可以用于區分植物群體中的分離。分子標記方法可以用于系統產生研究、表征作物品種的遺傳關系、鑒定雜交或體細胞雜種、定位影響單基因性狀的染色體片段、基于圖譜的克隆和定量遺傳的研究。參見，例如，Plant MolecularBiology:A Laboratory Manual (植物分子生物學:實驗室手冊)，第7章，Clark編輯，Springer-Verlag,Berlin( 1997)。對于分子標記方法，一般參見，Andrew H.Paterson 1996的 The DNARevolution (DNA 革命)(第 2 章)，在:Genome Mapping in Plants (植物的基因組作圖)(編輯，Andrew H.Paterson), Academic Press/R.G.Landis Company, Austin,Tex.，pp.7-21。本發明中的特定基因性測定方法可以使用多種分子標記分析技術，如但不限于，擴增片段長度多態性(AFLPs)。AFLP是由核苷酸序列可變性引起的DNAPCR擴增片段之間的等位基因差異的產物。因此，本發明進一步提供了一種方法來進行本發明的基因或核酸以及遺傳上連接這些基因或核酸的染色體序列的分離，使用如AFLP分析這樣的技術。可以用于本發明中的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。優選的植物包括玉米、小麥、大米、大麥、燕麥、高粱、黍米、黑麥、大豆、向日葵、紅花、苜蓿、卡諾拉油菜、棉花或草坪草。從轉化植物細胞、植物部分或植物組織再生的植物產生的種子，或源自再生轉化植物的后代，可以直接用作飼料或食物，或可以進行進一步的加工。本發明通過參照以下詳細的實施例將得到進一步的描述。然而，可以理解存在除實施例和描述中所示以外的對本發明基本主題的許多延伸、改變和修飾，這些在本發明的精神和范圍內。實施例在以下實施例中進一步限定本發明，其中所有份數和百分比是以重量計的，且是攝氏溫度，除非另外指出。應當理解這些實施例，盡管表示本發明的優選實施方案，但只是以說明的方式給出。從以上的討論和這些實施例，本領域技術人員將認識到本發明的實質性特征，且沒有脫離其精神和范圍，可以形成本發明的改變和修飾來使其適于各種用法和條件。實施例1.候選IPP2-K基因的鑒定來自人和酵母的用于預測的肌醇五kis磷酸-激酶(In5_K)基因的DNA序列描述于 Verbsky, J.W.等(2002) J.Biol.Chem.277:31857-31862 (此后稱為:“Verbsky”)。在公眾數據庫包括GenBank (http://www.ncb1.nlm.nih.gov./)中鑒定出相似的、推定的玉米IPP2-K基因序列的片段。將玉米序列片段與人和酵母序列比對，也根據BLAST算法用于 NCBI 數據庫篩選(Altschul，S.F.等，(1991) J.Mol.Biol.215:403_10)。在公眾結構域包括但不限于 BM520171、BE556094、BG882429 (大豆(Glycine max)) ;C73039、AA750614、AL606608.3、AAAA01003483、AP008210、AK102842、XM474214 (水稻(Oryza sativa))；BH647760、BH724856 (甘藍(Brasica oleracea)) ；TC238218 (包括來自小麥(Triticumaestivum)ESTsCA732984、BQ579364、BE430881、CD876080、BE498028、CA714664、BE498127、BJ233635、BE496998、CA604588、BJ212905, BJ22038U BE445478、CA700172、CA613702 的TIGR 重疊群)、TC97085(包括來自高粱(Sorghum bicolor )CD233879、BG054179、BE594569、CD207152 的 TIGR 重疊群)、BN45053K04、BN25068E01、Brassica napustuc04-02_052912，TC1941 (包括來自油菜(Brasica napus) CD832483、CD827663、CD837809 和 CD832284 的TIGR 重疊群)中鑒定出來自擬南芥(Arabidopsis thaliana) (AT5g42810、ATlg22100、ATlg58936)和其他物種的幾個序列。此外，在公眾數據庫和公開的專利申請(Shi，J.等，W02003027423)中鑒定出具有低水平序列相似性并預測在功能上不同的序列。基于相似性的程度可以將這些序列從與在此要求的IPP2-K相似的那些 中區分出來。這些序列之間的相似性百分比和系統生成關系顯示于圖1A和IB中。
此外，將載體NTI的多序列比對應用用來形成來自玉米、擬南芥和大米的推定IPP2-K基因的預測氨基酸序列的比對。基于氨基酸序列同一性，那些比對結果限定了稱為共有序列的保守片段，作圖于圖2中。鑒定了五個共有序列來限定IPP2-K基因特征性的基序。使用這些基序來探尋數據庫(例如，GeneBank)，本領域技術人員可以從各種植物物種中鑒定出其他的推定IPP2-K基因:1.DAXDWXYXXEGXXNLXLXYXGSSP2.VEIKXKCGFLXXSXXIXXXNXXKXXXXRXXMXQXCKXXXXXISXXSEYXPLDLFSGSKXXXXXAIKXXXXTPQNXXXXXXGSLXXGG3.1SXXSEYXPLDLFSGSK4.LXXLLXXQKLDXXIEGXIHXYY5.LIXXTAXDCSXMISF實施例2:全長cDNA序列的分離公眾玉米序列數 據庫(www.maizegdb.0rg)的探詢鑒定出表達的序列標記物(ESTs)BG842305、AW066374 和 BE639260，作為鄰接序列(contig)ZMtuc02-12_23.4536 的片段。該重疊群為1.7kb長。該重疊群的翻譯蛋白序列含有與人肌醇五kis磷酸激酶(In5-K)基因中鑒定的保守A、B、C和D盒高度相似的序列，如Verbsky所述的。可以使用RT-PCR方法來獲得玉米IPP2-K cDNA克隆，如該實施例中所述的。在授粉后(DAP)9 天使用 TRIzol 試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 MACS 試劑盒(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)的組合從玉米(DAS 5XH751)種子中分離出多(A)+-尾mRNAo 使用源自 ZMtuc02-12-03.4536 (5，-TCG GAA ATT ACT GTG ACA AGC-3，)的基因特異性引物和Superscriptase II酶(Invitrogen)如制造商所建議的對該mRNA進行逆轉錄反應來產生 cDNA。通過使用源自 ZMtuc02-12-23.4536 (5，-GAA TCG GCA CGA GGC AGCAGC GGC AGC-3，和5，-TGA CAA GCC ACG GTG TAT GCA-3’)的不同基因特異性引物來完成IPP2-KcDNA的擴增。使用TA克隆試劑盒按照制造商的推薦(Invitrogen)將擴增的cDNA克隆至載體質粒載體PCR2.1中。將該玉米IPP2-K cDNA克隆(1.6kb長)命名為zmIP5K_l。為了獲得對應于IPP2-K cDNA的5’ -和3’ -未翻譯片段(UTR)的序列，使用來自Invitrogen的GeneRacer 試劑盒進行cDNA末端快速擴增(RACE)實驗。對于5’ -RACE,用小牛腸磷酸酶和煙草酸性焦磷酸酶如制造商所述的處理來自9DAP種子的mRNA。按照試劑盒的說明將試劑盒提供的RNA寡核苷酸(RNA錨)連接上述的mRNA。通過另一個IPP2-K基因特異性引物(5，-GCA ATA GCA AATTGA GAT ACA TTC ATA C-3’)來指導逆轉錄。隨后使用源自RNA錨序列的引物和不同的基因特異性引物(5’-TTC CAG GCG TTA AGG GTC GAGCCT-3’)來擴增推定的玉米IPP2-K激酶cDNA的5’ -端。將所得到的擴增產物克隆至質粒載體pCR2.1中并測序。為了獲得3’ -UTR序列，用寡-cKT)引物和源自在3’ -端的RNA錨引物按照GeneRacer 試劑盒來指導來自9DAP種子的mRNA的逆轉錄。然后用源自zmIP5K-l(5’-CGTGTT TCT AGG GAT TTT CTG GAG CTT-3’)的基因特異性引物和3’-RNA錨序列側翼寡_d(T)引物擴增推定的IPP2-K轉錄產物的3’-端。將PCR產物克隆至pCR2.1中并測序。隨后，將源自5’-和3’-RACE實驗的克隆序列數據用于設計對應于UTR (5’ -CTT CAG TCCCTT TCC CCG GGCT-3’ 和 5’ -TTT TTT TTT TTT GGA GGA TGA AAG TTT CAC CAA ACA TTTCT-3’)的IPP2-K特異性PCR引物。使用那些引物，使用高保真度Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)進行來自9DAP種子的mRNA的RT-PCR擴增來產生推定的全長IPP2-KcDNA。然后將所得到的PCR產物克隆至pCR2.1中并將四個獨立的克隆進行測序。將表示全長IPP2-K cDNA的克隆的核苷酸序列命名為(SEQ ID NO:1)并將該cDNA編碼的蛋白質的預測氨基酸序列命名為(SEQ ID NO: 2)。實施例3:基因組DNA序列的鑒定使用分離的推定玉米IPP2-K cDNA作為詢問序列，根據BLAST搜尋玉米基因組數據庫(WWW.maizegdb.0rg)并鑒定出其他未知功能的重疊、相似序列片段。將這些序列裝配成重疊群 / 單線態(contig/singlet)，包括 ZMGSStuc28403.1，ZMGSStuc03-04-29.4761。使用標準方案(Sambrook)進行基因組Southern印跡。分析玉米(DAS 5XH751)未消化或用BamH 1、EcoR 1、Hind III和Not I酶單一消化的基因組DNA，。通過0.8%瓊脂糖中的電泳來分離gDNA片段，轉移至尼龍膜上并在嚴謹條件下(0.2XSSC，60°C)與25ng用32P-dCTP (Prime-1t II 標記試劑盒，Stratagene, La Jolla, CA)標記的 1.6kb 玉米 IPP2-KcDNA (zmIP5K-l)探針雜交。將對應于2或3個基因的條帶鑒定為可能的IPP2-K候選者，表示基因作為小基因家族存在。實施例4 從λ噬菌體文庫分離ΙΡΡ2-Κ基因組克隆從已經在液氮中研磨成細粉的3周大的葉片組織分離玉米(DAS5XH751)的基因組DNA。如Sambrook中所述的使用基于十六燒基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium)的標準方法(CTAB)在包括 IOOmM Tris ρΗ7.5、0.7MNaCl、10mM EDTA、1%CTAB、1%β -巰基乙醇的緩沖液中提取gDNA。用BamH I限制酶消化所得到的DNA并按照制造商的推薦使用Klenow酶(Stratagene, La Jolla, CA)將末端接受填補反應。填補反應后,提取DNA,沉淀并根據制造商所述的方案連接用Xho I預消化的λ卩遼菌體載體(λ FixII, Stratagene),除了連接緩沖液和連接酶是由Promega提供的(M`adison, WI)。使用來自Stratagene的Gigapack試劑盒,按照制造商的推薦將連接混合物加入Gigapack III XL包裝提取物中并使用Samtoook所述的標準方法將包裝的文庫涂布于LB培養基上。所得到的玉米基因組文庫具有3.6 X IO6PFUs,經過常規擴增，文庫最終的滴定度是3.6X 101QPFU/ml。λ文庫篩選方法源自Sambrook。以高密度涂布玉米DAS5XH751基因組文庫并轉移至尼龍膜。將膜在嚴謹條件下(I X SSC的2次洗滌，0.2 X SSC的2次洗滌，65 °C )與探針雜交，探針由如上所述標記的1.6kb IPP2-K cDNA克隆(zmIP5K-l)片段構成。分離陽性斑并接受2輪另外的篩選，得到幾個推定的陽性λ克隆。克隆片段的DNA測序證實了這些序列的同一性和源自基因組ΙΡΡ2-Κ基因的一樣。將這些序列和以下描述的BAC克隆一起用于產生命名為(SEQ ID Ν0:3)的鄰接基因組序列。實施例5:含有ΙΡΡ2-Κ基因的BAC克隆的分離和表征根據Zhang (2002)所述的方法制備玉米(DAS近交5ΧΗ751)的基因組DNA的細菌人造染色體(BAC)文庫。從2周大的秧苗組織收集葉片組織并冷凍于液氮中。將冷凍組織在液氮中研磨成細粉，轉移至 IXHB (IOX 儲液:0.1M Trizma 堿、0.8M KCl、0.1M EDTA、IOmM 亞精胺、IOmM 精胺，pH9.4-9.5)加0.15%β -巰基乙醇和0.5%曲通Χ-100，在冰上渦旋10分鐘并通過兩層粗棉布和一層Miracloth過濾。將勻漿沉淀并用冰冷洗滌緩沖液(0.0lM Trizma堿、0.08ΜKC1、0.01M EDTA、ImM 亞精胺、ImM 精胺、2% 曲通 Χ_100、0.015%β -巰基乙醇，pH9.4-9.5)洗滌。將核沉淀物重懸浮于洗滌緩沖液中并通過1，800Xg,4°C 15分鐘離心3次來再次沉淀。將沉淀的核重懸浮于ImllXHB中并計數。用IXHB將核濃度調節至5X IO7個核/ml。如Zhang (2002)所述的將完整的核包埋于瓊脂糖填料中，在0.5M EDTA, pH9.0-9.3, 50°C洗滌一小時，在0.05M EDTA, ρΗ8.0，冰上洗滌一小時，并存儲于0.05Μ EDTA, ρΗ8.0，4°C中。通過在 10-20 體積的冰冷 TE (IOmM Tris-HCl，ρΗ8.0, ImM EDTApH8.0)力卩 0.1mM 苯甲基磺酰氟化物(PMSF)中洗滌核-填料三次一小時來進行填料中巨大堿基(megabase) DNA的進一步純化。將DNA在10-20體積冰冷TE中另外洗滌三次一小時。如Zhang (2002)所述的在瓊脂糖填料中直接用限制酶EcoRI消化包埋于核中的基因組DNA。消化后，用1/10體積的0.5M EDTA, pH8.0停止反應。根據Zhang (2002)在連接BAC載體之前對消化的DNA進行脈沖 場凝膠電泳接著瓊脂糖填料中的大小選擇。如Zhang (2002)中所述的，用限制酶EcoRI消化BAC載體pECBAClDNA。用CIAP酶(Invitrogen)將線性化的載體DNA去磷酸并用冷TE中的4μ I 0.5Μ EDTA, pH8.0,2(^1109^5和4(^1111^/1111蛋白酶1(來停止40(^1的反應。通過加入1/10體積3皿NaAC,pH7.0和2體積100%乙醇，在-80°C孵育10分鐘，接著在10，OOOrpm離心15分鐘來沉淀DNA。洗滌和重懸浮后，將DNA濃度調節至IOng/ μ I并將載體存儲于_20°C。如下進行巨大堿基基因組DNA進入BAC載體pECBACl中的連接:將從瓊脂糖填料中洗脫出來的基因組DNA對一升冰冷0.5 X TE在冰上透析2次I小時。在1%瓊脂糖凝膠上估算收集的DNA的濃度。以載體:DNA1:4的分子量比使用T4DNA連接酶根據Zhang(2002)所述的標準方法來進行連接反應。將連接反應在16°C孵育8-12小時。使用具有增壓器和0.15cm間隙的Cell Porator比色皿的Cell Porator System(Labrepco, Horsham PA)通過電穿孔來進行連接混合進入感受態大腸桿菌細胞(DHB10B,Invitrogen)中的轉化。電穿孔設置為330uF電容、4Kohm電阻。電穿孔后，將細胞在37°C在大約Iml SOC培養基中振蕩恢復，離心沉淀并存儲于冷凍培養基中(2.5w/v顆粒狀LB肉湯、13禮 KH2PO4,36mM Κ2ΗΡ04、1.7禮檸檬酸鈉、6.8mM(NH4)2S04、4.4%w/v 甘油)直至涂布。將培養物以形成離散細菌菌落的密度涂布在加了 LSQ/obactoagardOyg/ml X-gal,90yg/mlIPTG和12.5μ g/ml氯霉素的LB培養基上。使用Q-bot自動儀(Genetix，Boston MA)挑選程序來挑選單個的菌落并排列至300個384-孔平板中。源自近交品種DAS 5XH751的這種玉米BAC文庫的滴定測試表明文庫含有大約115，000個克隆，具有平均130k b插入大小的基因組片段。使用Q-bot自動儀(Genetix, Boston MA)點程序將排列的玉米5XH751BAC文庫以4X4格子點在22cm2尼龍膜上。除了在雜交之前增加了另外的裂解步驟，按照Sambrook將濾紙(filter)在LB瓊脂糖上37°C生長過夜，然后變性、固定和干燥。然后將濾紙器在嚴謹條件下(I XSSC 0.1%SDS 2 次洗滌，0.2 X SSC, 0.1%SDS 2 次洗滌，65 °C)與 916bpIPP2-K片段(zmIP5K-l)構成的探針雜交，該探針是使用IPP2-K特異性引物(IP5K-PF3:5’ -AGTCCCTTTCCCCGGGCTGTGGTAC-3’ 和 IP5K-PR1:5’ -TTAAGTTGTTCTGAGGAGTTGAGAAAAGGGA-3’)通過cDNA克隆(zmIP5K-l)的PCR產生的。使用Invitrogen的隨機引物標記盒用Y32-P dCTP將探針放射性標記。通過用存儲的磷屏篩選,接著運行Incogen(WiIIiamburg,VA)高密度濾紙閱讀軟件的 Storm phsphorimager (Molecular Dynamics, Mountain ViewCA)分析,通過暴露16小時的磷顯影(phosphorimaging)來進行陽性克隆的觀察。從文庫平板陣列回收陽性克隆培養物并在LB培養基中37°C生長過夜。按照制造商的說明使用Qiagen (Valencia CA)大構建試劑盒從分離的克隆中提取BAC DNA。將IPP2-K編碼片段的特異性 PCR 引物(IP5-1PF:5’ -CGCGGATGCCAAGGACTGGGTTTACAAGGG-3’ 和 IP5-1PR:5’ -TTACAACAGCAGCACCAAGCAGCAGGAAC-3’ )用于擴增推定的陽性克隆并證實BAC上IPP2-K基因的存在。用NotI限制酶切含有IPP2-K基因的BAC，接受脈沖場凝膠電泳和分析。估算插入片段大小大約為180kb長，對應于含有IPP2-K基因的玉米染色體的基因組片段。進行含有IPP2-K的BAC克隆的測序，通過BAC DNA的直接測序或通過BAC的獵槍-亞克隆接著質粒測序和重疊群裝配(Lark Technologies,Houston TX)。產生多個BAC序列運行并與上述的λ噬菌體克隆比對來產生命名為(SEQ ID N0:3)的鄰接基因組序列。圖3中顯示了含有玉米DAS5XH751的IPP2-K基因的基因組基因座的結構。實施例6:體外表征的IPP2-K活件

按照制造商的推薦將對應于預測的1.32kb開放閱讀框(ORF)的玉米IPP2_KcDNA克隆的片段克隆至pGEX_2T質粒表達載體(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)中并在大腸桿菌細胞(BL21 (DE3)pLysS)中表達。設計該載體來產生GST (谷胱甘肽-S-轉移酶)肽按讀碼框融合至表達蛋白N-端上。從標準提取裂解緩沖液(50mMTris-HCl pH7.5,150mM NaCl, IOmM EDTA, ImM DTT,ImM PMSF, lmg/ml溶菌酶接著加入0.4%曲通X-100)中的大腸桿菌細胞提取總蛋白。使用Branson Sonifier 450 (Branson Ultrasonic Corporation,Danbury CT)將所得至Ij的大腸桿菌裂解物在冰上超聲波處理30秒的四個循環，每次20%輸出設置和50%工作循環。將細菌表達的蛋白通過谷胱甘肽-瓊脂糖柱，用緩沖液A (50mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl、IOmM EDTAUmM DTT、ImMPMSF 和 0.4% 曲通 X-100)洗滌 3 X，用緩沖液 B (50mM Tris-HCl,pH8.0)洗滌3次，并用50mM Tris-HCl中的IOmM谷胱甘肽洗脫。將通過Bio-RacKHerculesCA)蛋白測定試劑測定的0.5ml含蛋白流分集合并通過SDS-PAGE分析(Sambrook)。使用Shevchenko, A等(1996) Anal.Chem.68:850-858所述的肽片段指印方法證實了異種表達的、純化蛋白的鑒定是玉米IPP2-K。用常規薄層色譜分離32_P標記的肌醇磷酸鹽后，通過放射自顯影法證實了異種表達的玉米IPP2-K蛋白磷酸化多種肌醇磷酸鹽物質的能力，包括肌醇四kis磷酸鹽(IP4)和肌醇五 kis 磷酸鹽(IP5)(圖 4)。在含有 20mM HEPES (ρΗ7.5)、6mMMgCl2、IOmM LiCl、ImMDTT、40ng/ μ I 肌醇磷酸鹽底物、40 μ M ATP 和 5 μ Ci Y -32P 標記的 ATP (3000Ci/mmol)的反應緩沖液中進行純化蛋白的玉米IPP2-K活性測定。將反應混合物點在PEI纖維素TLC板上并在1.0N HCl中展開。這些激酶活性測試的結果表明了玉米IPP2-K酶能夠催化肌醇I，3，4，5，6五kis磷酸鹽(IP5)通過肌醇環2-位的磷酸化反應轉化產生肌醇1,2, 3, 4，5，6六kis磷酸鹽(植酸)(圖4)。此外，該玉米酶能夠磷酸化肌醇1，4，5，6四磷酸鹽(IP4)來產生IP5。另外觀察到的酶活性包括將肌醇1，4，6-三磷酸鹽(IP3)轉化成放射性標記的IP3產物的能力。基于這些結果，玉米酶是肌醇磷酸激酶。為了進一步表征上述TLC測試中觀察到的IPP2-K的肌醇1，4，6_三磷酸激酶活性的異構特異性，使用基于NMR的方法來檢測底物轉化。在該實施例中，將含有600 μ ID2O中 50mM Tris DC1，ρΗ7.5、IOmM LiCl、6mM MgCl2UmM DTT、ImM 肌醇 1，4，6-三磷酸鹽和ImM ATP的溶液置于5-mm NMR管中，并在fcuker DRX-600NMR上通過質子NMR分析。根據Liu等(2001)的方法，為了消除4.8ppm處大的殘余水峰同時保留下面的底物峰，使用RE⑶R-TOCSY脈沖程序收集數據。原料表征后，將45 μ g純化的異種表達的玉米IPP2-K酶加入管中，并在使用質子NMR之前監控反應。在600MHz的質子共振頻率在室溫獲得所有譜。使用了總共128個掃描，32K數據點，30度脈沖寬度和2秒馳豫延遲。使用標準Bruker軟件XWIN-NMR進行數據收集和處理。圖5中顯示了表示在酶存在下在37°C O和120分鐘孵育時間點的譜。開始和結束時間點的譜比較顯示了在IPP2-K酶存在下，肌醇1，4，6-三磷酸鹽轉化成1，2，6-三磷酸鹽(圖5)。該結果清楚地證明了 IPP2-K可以催化肌醇1，4，6-三磷酸鹽的去磷酸化和磷酸化,如TLC測試中所觀察到的；此外，IPP2-K的激酶活性對于肌醇-2位的磷酸化是特異性的，證實了 IPP2-K基因編碼的酶是肌醇多磷酸-2激酶。實施例7:體內表征的IPP2-K活件通過遺傳互補實驗來測試從玉米DAS 5XH751分離的IPP2-K cDNA編碼的蛋白的功能性。在一個實施例中，含有IPP2-K基因改變的雙子葉植物擬南芥的突變體可以呈現降低的植酸累積表型。例如，本領域技術人員可以通過使用玉米IPP2-KcDNA序列作為詢問序列搜尋TAIR數據庫(www.arabidopsis.0rg)鑒定出公眾可獲得的描述為在預測的IPP2-K基因中含有T-DNA插入的擬南芥系。含有這樣T-DNA插入的系可以呈現出中斷的IPP2-K基因表達的降低或敲除，導致酶活性降低或丟失。使用Raboy在美國專利號006111168A中所述的螯合測試，將來自那些系自體授粉后代的種子接受肌醇六磷酸鹽含量的分析。預測與玉米IPP2-K基因同源的擬南芥IPP2-K基因的破壞，以及引起的IPP2-K活性的消除，將導致肌醇六磷酸鹽累積的降低。預測通過如Weigel,D.&Glazebrook, J.(2002)ArabidopsisA Laboratory Maua l (擬南芥實驗室手冊)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, NY)中所述的遺傳轉化將這樣的植物工程化來表達功能性玉米IPP2-K基因時，這些突變系恢復正常的、接近正常的或提高水平的植酸累積。在另一個與上述擬南芥實驗相似的實施例中，本領域技術人員可以從公眾可獲得的遺傳收集如(http: //www.uniformmu.0rg ；或 hhtp: //w3.aces, uiuc.edu/maize-coop/)鑒定出IPP2-K基因破壞的玉米突變株。例如，由于插入基因中的Mu可換位元件的存在，一些玉米突變株的PP2-K基因受到破壞。預測這些突變株可以呈現降低水平的植酸累積。通過遺傳轉化通過表達功能性玉米基因來補充這樣的突變體。通過遺傳轉化將這樣的植物工程化來表達玉米IPP2-K基因時，預測這些突變系將恢復正常或接近正常水平的植酸累積。在上述的實施例中，本領域技術人員可以利用NMR分析來測定遺傳上改變的植物中肌醇磷酸鹽代謝物的特定含量和種類。預測由于IPP2-K基因表達的改變而呈現植酸降低累積的植物也具有改變的肌醇六磷酸鹽前體含量和/或種類，如IP5、IP4等。例如，可以使用磷NMR分析這樣突變體的植物提取物來測定肌醇六磷酸鹽降低對肌醇六磷酸鹽前體累積的作用。為了說明該實施例，進行了近交系DAS5XH751的成熟玉米種子中存在的肌醇磷酸鹽分子的測定。該實施例中，將IOg干燥成熟玉米種子的玉米粉在0.5N HCl中提取、過濾、濃縮至干并用80%甲醇洗滌。將甲醇漿液濃縮成黑色焦油并溶解于含有30mg/ml EDTA的D2O溶液中。用NaOH將溶液pH調節至>12。隨后進行沒有過濾的磷NMR分析。在配備5-mmlH/13C/19F/31P 探針的 fcuker DRX-400NMR 分光計上在 400.13MHz 獲得磷 NMR 譜。在室溫用質子去耦獲得所有譜。使用64K數據點、30度脈沖寬度和2.0秒馳豫延遲獲得總共23K過渡現象(transient)，使得總獲取時間為16小時。將原始數據補零至32K點譜并使用1.0Hz指數加權函數來處理。圖6中顯示了所得到的譜。在非突變的玉米中，預測肌醇六kis磷酸鹽(肌醇六磷酸鹽)是主要的肌醇磷酸鹽物質，存在少量肌醇五-和四-kis磷酸鹽,如圖6中觀察到的。實施例8:使用快中子(FN)照射的玉米種子誘變Van Harten (1998)充分描述了細胞FN轟擊的方法和一般的遺傳結果，且這種方法已經成功地用于如Li，X.等描述的擬南芥植物，，(2001)Plant J.27:235_242。通常可以期待FN產生大約幾百個堿基對至幾千個堿基對或更多的大小范圍的刪除。FN照射的效率取決于待處理生物材料的種類和性質。在該實施例中，在匈牙利布達佩斯的Atomic EnergyResearch Institute (原子能研究所)使用快中子束源進行照射。在誘變玉米種子樣品的一個實驗中，在照射之前通過測量在實驗室干燥箱中80°C處理14h之前和之后的質量來測試采收后已經干燥至大約40%水分的大量種子的含水量。基于樣品％水w/w，根據工具束校準將調節實際計算的束暴露時間。對于這些實施例，使用2Y/Cd旋轉幾何形狀的BRR的BIF的照射幾何形狀。通過U-235、Th-232裂變室和GM計數器來監控暴露。對單袋種子進行照射暴露1145秒，每次對于2Y/Cd產生實際平均12.71mGy/s+3%的柯瑪量率(kerma doserate)。用快中子ll_20Gy (11、13、15、17、20Gy)的目標劑量范圍處理多個玉米種子樣品。將所得到的Ml種子在標準中西部農場條件下種植并生長，自由授粉并單獨收集每個Ml穗來產生M2家族。收集單個成熟穗、干燥、脫殼并裝入用M2家族特異性標識標記的單個信封中。實施例9:從誘變的種子分離基因組DNA使用Invitrogen 的 Charge-Switch 技術(CST)方法(Carlsbad, CA)以 96-孔形式從完整的、干燥的玉米種子分離的基因組DNA，使用以下的改進。從信封中單個取出每個M2家族的種子樣品用 于基因組DNA提取。將每個家族的6粒種子置于24孔-深孔平板的(CoStar Scientific, Cambridge MA)每個孔中(每個孔I個家族),吸水過夜,隨后在凍干室中(Virtis, Gardiner NY)在真空下凍干最少 48 小時。使用 Genogrinder(Spex Certiprep,Metuchen NJ)的最大設置結合碳化鶴珠子(Small Part, Inc., Miami Lakes FL)將干燥的種子研磨成粉末并重懸浮于包括0.25%SDS、IOmM EDTApH8.0、50mM Tris pH8.0的含水緩沖劑中。離心后，將提取物上清液轉移至新的平板并集合成每個孔6個樣品(M2家族)的組合。通過在冰上加入NaCl至750mM和KOAc至1.2M終濃度從溶液中沉淀出蛋白質，接著簡短的離心。將PEG8000加入上清液中至8%的終濃度、混合并離心來沉淀gDNA。將沉淀物重懸浮于CST (Invitrogen)消化混合物中并按照制造商的方案使用Biomek FX自動操控的液體處理系統(Beckman-Couter, Inc., Fullerton CA)來提取gDNA。洗脫后，將DNA樣品等分成多個密封的平板中并存儲于_80°C或4°C的潮濕容器中。實施例10:某于PCR篩詵刪除突奪體為了篩選目標基因中的刪除，可以使用基于PCR的方法。US專利申請20050053975中描述了幾種這樣方法的實例。例如，基于基因座的序列數據來設計對應于目標基因兩側的基因組序列的寡核苷酸引物。使用可購得的對于長PCR最佳化的方法和酶(LA-Taq)按照制造商的推薦(Takara-Bio, Inc., Shiga, Japan)將DNA樣品進行PCR擴增。進行刪除的檢測，通過常規瓊脂糖凝膠電泳(Sambrook)來觀察PCR產物條帶。為了說明這種方法的實用性，設計基于公開的信息將對應于玉米Adh-1基因座兩側的基因組DNA序列的寡核苷酸的引物。將這些引物用于在以下條件下擴增玉米基因組DNA:將含有IX LA-Taq緩沖劑、
1.6mM dNTPs、0.5mM MgCl2,2%DMS0 和 LA-Taq 酶的反應混合物加入 gDNA 模板(l_30ng)和
0.4 μ M 寡核苷酸引物中(引物 Adhl6s:5’ -GTCTGACAACGCCTGAGATTGAATCGAA GACC-3’，引物Adh21a:5’-CAGCTACCACTTGCGCTTGAGGGATT TGAA-3’)。在以下溫度體系下在自動化熱循環儀中擴增 PCR 反應(MJ Research, Waltham, MA):步驟1:94°C I分鐘；步驟2:98°C 10秒鐘；步驟3:70°C 15分鐘；步驟4:重復步驟2&3另外31個循環；步驟5:72°C 10分鐘；和步驟6:保持4°C存儲。使用常規瓊脂糖凝膠電泳分析所得到的PCR產物。因此產生的擴增子包括完整的Adh-1基因加上幾kb的側翼序列，總共12.3kb的DNA序列。在該反應中使用的模板gDNA在12.3kb的范圍內含有刪除的情況中，本領域技術人員可以檢測較小的PCR產物，其表示來源種質的突變。我們已經對幾個其他的目標基因使用了該方法。如這些實施例中所示的，本領域技術人員可以檢測顯示出相對于對照擴增子大小減小的PCR反應。可以將這些反應中所用DNA模板的種子來源指定為推定的刪除突變體并接受重復的分析。一旦證實了刪除，可以使來自該家族的突變玉米生長并自體授粉來產生純合的種質。可以使用如Raboy上文所述的植酸檢測的常規測定來測量10至20粒M3種子中來自這樣種質的種子中的肌醇六磷酸鹽含量。可以使含有降低肌醇六磷酸鹽的種子再次生長并在動物飼養測試或其它用途中測試提高的營養價值。參考文獻:Altschul, S.F.等(1991) J.M0.1 Biol.215:403-10Guthrie, C.&Fink, G.(1991)Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(酵母遺傳學和分子生物學指南).Meth.Enzymol.vl94.Academic Press, Inc., SanDiego, CA.
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權利要求
1.一種分離的植物肌醇多磷酸2-激酶蛋白，包括至少一種選自以下的基序: DAXDWXYXXEGXXNLXLXYXGS SP,VEIKXKCGFLXXSXXIXXXNXXKXXXXRXXMXQXCKXXXXXISXXSEYXPLDLFSGSKXXXXXAIKXXXXTPQNXXXXXXGSLXXGG,ISXXSEYXPLDLFSGSK, LXXLLXXQKLDXXIEGXIHXYY,和 LIXXTAXDCSXMISF。
2.根據權利要求1所述的分離的植物肌醇多磷酸2-激酶蛋白，包括至少兩個基序。
3.根據權利要求1所述的分離的植物肌醇多磷酸2-激酶蛋白，其中植物選自玉米、擬南芥和稻。
4.根據權利要求1所述的分離的植物肌醇多磷酸2-激酶蛋白，其中蛋白在異源宿主細胞中生產。
5.根據權利要求4所述的分離的植物肌醇多磷酸2-激酶蛋白，其中異源宿主細胞是微生物宿主細胞。
全文摘要
本發明涉及肌醇多磷酸2-激酶基因及其用途，具體而言，本發明涉及植酸生物合成途徑中新鑒定的多核苷酸和多肽，及其變體和衍生物；制備多核苷酸、多肽、變體、衍生物和拮抗劑的方法。特別地，本發明涉及編碼肌醇多磷酸2-激酶(IPP2-K)的多核苷酸和呈現這樣的活性以降低植酸和/或提高非植酸磷的方式來調節植酸生物合成的多肽，尤其是在玉米或大豆動物飼料中。
文檔編號C12N9/12GK103184199SQ20121033788
公開日2013年7月3日 申請日期2005年9月9日 優先權日2004年9月9日
發明者M·A·湯普森, H·J·布特勒, Y·孫, V·K·舒克拉 申請人:美國陶氏益農公司