專利名稱：一種微紫青霉菌的篩選方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及真菌的篩選方法及其應用，尤其涉及微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)的篩選方法及其應用。
背景技術：
砷是一種在自然界廣泛存在的有毒并且致癌的類金屬元素，砷污染已成為全球危害十分嚴重的環境問題之一。據報道，全球至少5000多萬人口正面臨著地方性砷中毒的威脅，其中大多數為亞洲國家。中國是受砷中毒危害最為嚴重的國家之一，在1956-1984年二十多年間，全國曾發生過30余起砷中毒事件。我國又是砷礦大國，砷礦廣泛分布在中南和西南部的湖南、云南、廣西、廣東等省區，砷礦開采或冶煉，含砷農藥、化肥等農資產品的過量投入等，可成土壤中砷的累積，進而影響著植物、動物的生長和發育，而且還可以通 過食物鏈進入人體，對人類的生存和健康構成威脅。目前常用的砷污染土壤修復方法包括土壤改良劑法、溶土法、排土法、化學沖洗法以及生物修復技術。生物修復技術是利用生物(主要是植物和微生物)作用來消減、凈化土壤中的砷或改變砷的形態，被普遍認為是砷污染治理中最具應用前景的技術。其中利用超積累植物去除土壤砷的植物修復技術在最近的幾年取得了突破性的進展，蜈蚣草(Brakefern，Pteris vitta)和大葉井口邊草(Pteris nervosa)等超積累砷的植物相繼被發現,并用于砷污染地區的土壤修復。在重金屬污染土壤的生物修復技術中，除了應用超積累植物吸收富集金屬外，利用植物、微生物將重金屬轉化為易揮發的有機化合物，使其逸散到大氣中，從而去除土壤中的重金屬，也逐漸引起了研究者的重視。如Terry等利用微生物和植物的作用，將環境中的硒(Se)轉化為生物毒性較低的氣態形式(二甲基硒和二甲基二硒)，直接或通過植物的組織使其揮發到大氣中。Meagher等將細菌體內的汞(Hg)還原酶基因轉入芥子科植物Arabidopsis后,得到的轉基因植物能耐受、吸收土壤環境中的Hg,并將Hg2+還原成Hgtl后揮發進入大氣。土壤中的砷化合物也可以轉變為氣態的甲基砷等物質，在多個圈層中遷移和轉化。因此，利用某些微生物的對砷的富集、利用和轉化、揮發等功能，將種累積到生物體內或將其形成易揮發態砷化合物，已成為潛在的土壤砷污染修復技術之一。目前國內報道的對砷具有揮發能力的真菌還沒有，國外報道也屈指可數，且大多還只是局限于理論上和實驗室的研究。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種微紫青霉菌的篩選方法，將微紫青霉菌應用于治理砷污染的土壤中以及減少砷在作物及農產品中的累積。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種微紫青霉菌的篩選方法，包括采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從該土壤樣品中分離出真菌，在固態PGP培養基上將分離出的真菌與浸有不同濃度砷的濾紙片作用，將該真菌純化培養后，進行顯微鏡鏡檢分析，觀察該真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況，由此篩選出微紫青霉菌。該微紫青霉菌Penicillium janthinillum已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址標注在后)保存，保存編號為CGMCC No. 3187，保存日期為2009年7
月9日。優選地，該方法具體包括將土壤樣品經梯度稀釋后涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養基上分離出真菌；將分離出的真菌經反復純化、培養后，取直徑為8 10_的圓形真菌菌塊或邊長為8 IOmm的方形真菌菌塊放于所述PGP培養基上，在距該菌塊為I 3cm處分別放置浸有不同濃度砷溶液的直徑為2 4mm的圓形濾紙片，砷濃度的范圍設置為1000 IOOOOmg/L ;將所述PGP培養基于24 26°C下培養5天后，通過觀察菌株的生長情況篩選出微紫青 霉菌。優選地，馬丁培養基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgSO4 · 7H20、瓊脂以及水，各成分的重量比為24 8 2 I 60 4000 ；PGP培養基的成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為60 8 I 400。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種微紫青霉菌對砷的抗性的鑒定方法，包括在室內培養條件下測定微紫青霉菌對砷的生物累積與揮發能力，以及在含有不同濃度砷的溶液的培養條件下微紫青霉菌生物量的變化，由此鑒定微紫青霉菌對砷的抗性。優選地，在室內培養條件下測定微紫青霉菌對砷的生物累積與揮發能力，具體包括配制總砷含量為50mg/L的PGP培養基，在120 125°C下滅菌14 17分鐘后，接入O. Iml微紫青霉菌生物量為104cfu/ml的菌懸液，培養溫度為24 27°C，轉速為138 142rpm,培養5天后，以3800 4200rpm轉速進行離心處理8 12分鐘，用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基，將該菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后對所述菌質稱重，用11 13ml體積比為4 6 I的HN03、HClO4混合液在158 162°C條件下將該菌質消煮10小時，采用原子熒光測定該菌質中的總砷含量；將離心出的培養液及清洗該菌質的超純水混合后作為上清液采用原子熒光測定總砷含量；菌質中的總砷含量作為微紫青霉菌對砷的生物累積量，微紫青霉菌對砷的揮發量=配置的總砷含量-菌質中的總砷含量-上清液中的總砷含量。優選地，參照在總砷含量為50mg/L的PGP培養基中接入微紫青霉菌的處理，分別以在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養基中不接入微紫青霉菌處理以及在PGP培養基中接入微紫青霉菌而不配置砷含量的處理作為對照，對每項處理均重復多次。優選地，在室內條件下測定在含有不同濃度砷的溶液的培養條件下微紫青霉菌生物量的變化，具體包括配制總砷含量范圍為O 200mg/L的PGP培養基，在120 122°C溫度下滅菌14 16分鐘后，將生長速率相同的8 IOmm微紫青霉菌菌塊分別加入以上處理中，于搖床上溫度為23 27°C，轉速為138 142rpm振蕩培養；培養5天后，培養液以3800 4200rpm離心8 12分鐘，并采用稀釋梯度法計數菌懸液中的孢子數目，即表達微紫青霉菌生物量；用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基后，將該菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后稱量該菌質重量，即微紫青霉菌生物量重量。優選地，不同的總砷含量的相應的處理均重復多次。優選地，該方法還包括觀察隨著培養溶液中總砷含量的增加微紫青霉菌的生物量的變化趨勢，并觀察微紫青霉菌的生物量最高的總砷含量，由此確定所述微紫青霉菌表現出較強的對砷生物累積與揮發的總砷含量范圍。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種微紫青霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及農產品中累積方面的應用。通過本發明對微紫青霉菌的篩選，可以制成相應的微生物修復制劑，將制得的微 生物修復制劑應用在污染土壤或環境中后，通過該微紫青霉菌對砷的富集和揮發作用，在一定程度上降低土壤中砷的含量，特別是降低土壤中有效砷的含量，從而保證作物正常生長，并使作物及農產品中砷的含量達到無公害農產品要求。


圖I為用本發明的方法篩選和培養出的微紫青霉菌在浸有不同濃度砷的濾紙片作用下的菌落生長情況；圖2為微紫青霉菌在不同砷濃度水平下的生長曲線圖。
具體實施例方式本發明提供的微紫青霉菌的篩選和培養方法，包括從砷污染的土壤中分離真菌，經純化培養后，利用顯微鏡鏡檢。同時，觀察分離出的真菌在不同濃度砷脅迫下菌落的生長狀況，由此篩選出耐砷能力強的微紫青霉菌；在室內培養條件下觀察分離出的微紫青霉菌對砷的累積和揮發能力。對培養、篩選出的微紫青霉菌接種于不同濃度砷脅迫下的固態PGP平板中，觀察微紫青霉菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況。與其它真菌相比，微紫青霉菌在砷含量為10000mg/L的條件下仍然具有很好的生長狀況，表明該真菌對砷具有良好的耐性。隨后進行的微紫青霉菌對砷的揮發量測定實驗表明，當對該微紫青霉菌培養時間為5天，且在培養基中加入的砷濃度為50mg/L時，該微紫青霉菌對砷的生物揮發量達到142. 195 μ g。實驗說明該微紫青霉菌對砷具有較強的轉化與揮發能力，即能將砷酸鹽轉化為氣態的砷化物，能夠應用于砷污染土壤的生物修復過程中，從而減少砷在作物及農產品中的累積。以下結合附圖和優選實施例對本發明的技術方案進行詳細地闡述。以下實施例僅用于說明和解釋本發明，而不構成對本發明技術方案的限制。以下所有實施例中，砷均以Na3AsO4 · 12H20的形式加入培養基中。實施例I微紫青霉菌的分離、篩選和培養從砷污染區采集污染土壤樣品，用塑料袋裝好并運回實驗室，在含砷的固態PGP培養基(土豆-葡萄糖-蛋白胨培養基)上從該土壤樣品中分離出真菌，經劃線法純化培養后，進行電子顯微鏡鏡檢分析，由此篩選出微紫青霉菌。具體包括步驟上述砷污染土壤樣品來自湖南石門地區雄黃礦附近的礦渣堆積處，將該土壤樣品運回實驗室后，經梯度稀釋并涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養基上分離出真菌，該馬丁培養基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4, MgSO4 · 7H20、瓊脂以及水，其重量比為24 8 2 I 60 4000。將分離出的真菌挑取少量菌絲，于不含砷的PGP培養基上利用連續劃線法純化培養3-5天，該過程重復2次。同時，制備顯微鏡檢樣品，利用電子顯微鏡觀察菌絲的體形態、分生以及厚垣孢子萌發，篩選出具有較高抗砷能力的微紫青霉菌菌株。該微紫青霉菌Penicillium janthinillum已在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心保存，保存編號為CGMCC No. 3187，保存日期為2009年7月9日。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101，電話為010-64807355，電子由[H牛為 cgmccisun. im. ac. cn。實施例2不同濃度砷脅迫下微紫青霉的菌落生長狀況將分離出的真菌經反復純化、培養后，取直徑為8 IOmm的圓形菌塊或邊長為8 IOmm的方形菌塊置于PGP培養基上，在距該菌塊為I 3cm處分別放置浸有不同濃度砷溶液的直徑為2 4mm的圓形濾紙片，砷濃度分別設置為1000、3000、5000、10000mg/L。將PGP培養基于24 26°C下培養5天后，觀察菌株的生長情況。PGP培養基成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為重量比為60 8 I 400。將微紫青霉菌與分離的其它真菌相比較，在砷含量為10000mg/L的條件下仍然具有很好的生長狀況。如圖I所示，在圖I中A為分離出的微紫青霉菌，其菌絲將浸有濃度為10000mg/L砷的濾紙片完全覆蓋；B、C、D分別為編號為SM-5F7、SM_5F9、SM_5F1的對照真菌在浸有不同濃度砷的濾紙片作用下的菌落生長狀況。實施例3微紫青霉菌對砷的揮發功能的測定實驗配制總砷含量為50mg/L的PGP培養基，在120 125°C下滅菌14 17分鐘后，接入0. Iml微紫青霉菌含量為104cfu/ml的菌懸液，培養溫度為24 27°C、轉速為138 142rpm條件下培養5天后，以3800 4200rpm的轉速進行離心處理8 12分鐘，用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基，將該菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后對該菌質稱重，用11 13ml體積比為4 6 I的HN03、HClO4混合液在158 162°C條件下將該菌質消煮10小時，采用原子熒光測定該菌質中的總砷含量；將離心出的培養液及清洗該菌質的超純水混合后作為上清液也采用原子熒光測定其內總砷含量。以菌質中的總砷含量作為微紫青霉菌對砷的生物累積量，用下述公式計算微紫青霉菌對砷的揮發量微紫青霉菌對砷的揮發量=配置的總砷含量-菌質中的總砷含量-上清液中總砷含量。本實驗以加入50mg/L砷不加微紫青霉菌,加微紫青霉菌不加砷的處理,對照上述加入50mg/L砷且加微紫青霉菌的處理，各處理均重復3次。該微紫青霉菌表現出了較強的抗砷性能，當培養時間為5天時，其對砷的生物揮發量為142. 195 μ g,如表I所示。表I微紫青霉菌對砷的生物揮發量(平均值土 S. D)

權利要求
1.一種微紫青霉菌的篩選方法，包括 采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從所述土壤樣品中分離出真菌，在固態PGP培養基上將分離出的真菌與浸有不同濃度砷的濾紙片作用，將所述真菌純化培養后，進行顯微鏡鏡檢分析，觀察所述真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況，由此篩選出微紫青霉菌。
2.按照權利要求I所述的方法，其特征在于，具體包括 將所述土壤樣品經梯度稀釋后涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養基上分離出真菌； 將分離出的真菌經反復純化后，挑取少量真菌的菌絲，于不含砷的PGP培養基上利用連續劃線法純化培養3-5天，該過程重復2次；同時，制備顯微鏡鏡檢樣品，利用電子顯微鏡觀察所述菌絲的體形態以及分生及厚垣孢子萌發，篩選出具有較高抗砷能力的微紫青霉菌的菌株。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，所述馬丁培養基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04 · 7H20、瓊脂以及水，各成分的重量比為24 8 2 I 60 4000 ； 所述PGP培養基的成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為60 8 I 400。
4.一種微紫青霉菌對砷的抗性的鑒定方法，包括 在室內培養條件下測定微紫青霉菌對砷的生物累積與揮發能力，以及在含有不同濃度砷的溶液的培養條件下微紫青霉菌生物量的變化，由此鑒定所述微紫青霉菌對砷的抗性。
5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室內培養條件下測定微紫青霉菌對砷的生物累積與揮發能力，具體包括 配制總砷含量為50mg/L的PGP培養基，在120 125 °C下滅菌14 17分鐘后，接入O. Iml微紫青霉菌生物量為104cfu/ml的菌懸液，培養溫度為24 27°C，轉速為138 142rpm,培養5天后，以3800 4200rpm轉速進行離心處理8 12分鐘，用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基，將所述菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后對所述菌質稱重，用11 13ml體積比為4 6 I的HN03、HClO4混合液在158 162°C條件下將所述菌質消煮10小時，采用原子熒光測定所述菌質中的總砷含量；將離心出的培養液及清洗所述菌質的超純水混合后作為上清液采用所述原子熒光測定總砷含量； 以所述菌質中的總砷含量作為微紫青霉菌對砷的生物累積量，用下述公式計算微紫青霉菌對砷的揮發量微紫青霉菌對砷的揮發量=配置的總砷含量-所述菌質中的總砷含量-所述上清液中的總砷含量。
6.按照權利要求5所述的方法，其特征在于， 參照在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養基中接入微紫青霉菌的處理，分別以在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養基中不接入微紫青霉菌處理以及在PGP培養基中接入微紫青霉菌而不配置砷含量的處理作為對照，對每項處理均重復多次。
7.按照權利要求4所述的方法，其特征在于，在室內條件下測定在含有不同濃度砷的溶液的培養條件下微紫青霉菌生物量的變化，具體包括 配制總砷含量范圍為O 200mg/L的PGP培養基，在120 122°C溫度下滅菌14 16分鐘后，將生長速率相同的8 IOmm微紫青霉菌菌塊分別加入以上處理中，于搖床上溫度為23 27°C，轉速為138 142rpm振蕩培養；培養5天后，培養液以3800 4200rpm離心8 12分鐘，并采用稀釋梯度法計數菌懸液中的孢子數目，即表達所述微紫青霉菌生物量; 用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基后，將所述菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后稱量所述菌質重量，即所述微紫青霉菌生物量重量。
8.按照權利要求7所述的方法，其特征在于， 不同的總砷含量的相應的處理均重復多次。
9.按照權利要求8所述的方法，其特征在于，還包括 觀察隨著培養溶液中總砷含量的增加所述微紫青霉菌的生物量的變化趨勢，并觀察所述微紫青霉菌的生物量最高時的總砷含量，由此確定所述微紫青霉菌表現出較強的對砷生物累積與揮發的總砷含量范圍。
10.一種微紫青霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及農產品中累積方面的應用。
全文摘要
本發明提供了一種微紫青霉菌的篩選方法及其應用，其中方法包括采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從該土壤樣品中分離出真菌，在固態PGP培養基上將分離出的真菌與浸有不同濃度砷的濾紙片作用，將該真菌純化培養后，進行顯微鏡鏡檢分析，觀察該真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況，由此篩選出微紫青霉菌。
文檔編號C12N1/14GK102925363SQ201210342620
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者曾西柏, 蘇世鳴, 蔣細良, 白玲玉, 李蓮芳 申請人:中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所