一種提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株，該菌株命名為草酸青霉（Penicillium?oxalicum）RE-10，所述菌株已于2014年3月17日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC?No.8922。本發明還公開了所述菌株在生產纖維素酶和半纖維素酶中的應用。實驗證實利用本發明提供的菌株在產酶培養基條件下濾紙酶活相比出發菌株提高52倍，相比目前已有工業菌株，本發明提供的工程菌生產周期明顯縮短，且纖維素酶和半纖維素酶產量高，生產成本低，并可以應用于纖維素酶和半纖維素酶中的大規模生產，具有良好的工業開發和應用前景。
【專利說明】一種提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種具有纖維素酶和半纖維素酶活性的工程菌株，尤其涉及一種提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌，屬于基因工程領域。
【背景技術】
[0002]草酸青霉是一種高產纖維素酶和半纖維素酶的絲狀真菌(Qu，et al.2013.1mproving lignocellulolytic enzyme production with Penicillium:from strainscreening to systems biology.Biofuels, 4 (5)，12),在纖維素酶的表達調控以及高產纖維素酶的遺傳改造方面取得了廣泛進展，并且該菌已應用于了纖維素酶的工業生產。隨著自然界石化能源資源的枯竭，可再生能源越來越受到重視，特別是木質纖維素，作為自然界中儲存量最為豐富的可再生資源，與其有關的生物煉制產業很有可能成為解決我國石化資源緊張的有效途徑之一。在生物質原料的生物轉化過程中，木質纖維素的難降解特性是將其轉化可發酵糖類的重要障礙，而提高纖維素酶及半纖維素酶的表達量可有效降低木質纖維素生物轉化的成本，然而，工業菌株中纖維素酶及半纖維素酶的表達量的提高并不僅是通過對菌株發酵工藝的 優化即能解決的問題，目前，通過基因工程方法對細胞中纖維素酶表達調控的網絡進行重構，是提高宿主細胞纖維素酶表達強度的有效方法。
[0003]近年來，草酸青霉菌株的遺傳改造工作已逐步展開(Qu, et al.2013.1mprovinglignocellulolytic enzyme production with Penicillium:from strain screeningto systems biology.Biofuels, 4(5)，12.)，并且 申請人:課題組于2013年公布了草酸青霉基因組序列(Liu，G.，et al.2013.Genomic and secretomic analyses reveal uniquefeatures of the lignocellulolytic enzyme system of Penicillium decumbens.PLoS One，8(2)，e55185.)，更有助于該菌基因功能的研究以及基因工程菌株的理性改造。近期成功構建的草酸青霉轉錄因子突變株庫也為解析該菌纖維素酶的表達調控機制提供了有效的資源。其它絲狀真菌中，發現了一些顯著調控纖維素酶和半纖維素酶基因表達的轉錄因子，如在里氏木霉中轉錄因子CREl編碼基因的敲除(Kubicek，C.P et al.2011.The CRElcarbon catabolite repressor of the fungus Trichodermareese1:a master regulator of carbon assimilation.BMC Genomics，12.)、粗糖脈抱菌轉錄因子 ClrB 的過表達(Coradetti，S.T.et al.2013.Analysis of a conservedcellulase transcriptional regulator reveals inducer-1ndependent production ofcellulolytic enzymes in Neurospora crassa.Microbiologyopen.)均可以促使纖維素酶和半纖維素酶的高表達，然而經檢索，絲狀真菌中沒有文獻報道ClrB的過表達與CREl的敲除存在強烈的協同正調控纖維素酶和半纖維素酶表達的作用。
[0004]β-葡萄糖苷酶在產纖維素酶絲狀真菌中普遍存在(Chen，M.，et al.2013.Promotion of extracellular lignocellulolytic enzymes production by restrainingthe intracellular beta-glucosidase in Penicillium decumbens.BioresourTechnol, 137，33-40.)，但不同屬種中β -葡萄糖苷酶同源蛋白的細胞功能存在明顯的差異，比如在粗糙脈孢菌中多種β_葡萄糖苷酶基因的單獨敲除菌株對纖維素酶的表達沒有明顯的影口向(Znameroski, E.A et al.2013.Evidence for transceptor function ofcellodextrin transporters in Neurospora crassa.J Biol Chem),但在里氏木霉中敲除同源的β -葡萄糖苷酶編碼基因cella (bglll), Δ cella突變株在纖維素條件下,纖維素酶反而出現表達顯著下降和延遲表達(Zhou, Q et al.2012.Differential involvement ofbeta-glucosidases from Hypocrea jecorina in rapid induction of cellulase genesby cellulose and cellobiose.Eukaryot Cell)。然而經檢索，目前在絲狀真菌中，沒有文獻報道β-葡萄糖苷酶Bgl2的缺失會明顯促進轉錄因子ClrB對纖維素酶和半纖維素酶表達的正調控作用，更沒有將此應用于高產纖維素酶菌株的遺傳改造。

【發明內容】

[0005]針對現有技術的不足，本發明要解決的技術問題是提供一種提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株。[0006]本發明的技術方案是基于 申請人:發現草酸青霉纖維素酶和半纖維素酶表達正轉錄因子 ClrB (GenBank:EPS31045.1)在同時敲除 CreA (GenBank:EPS28222.1)和 Bgl2(GenBank:EPS25645.1)編碼基因時，所表現出的協同促進纖維素酶和半纖維素酶基因表達的特點，采用在草酸青霉中組成型過表達轉錄因子ClrB，并敲除轉錄因子CreA編碼基因和敲除-葡萄糖苷酶Bgl2編碼基因，即得到提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株，命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum) RE-1O。在纖維素誘導產酶培養基條件下應用該菌即可生產纖維素酶和半纖維素酶。
[0007]本發明所述的提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株，其特征在于:所述菌株命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum) RE-10,該菌株已于2014年3月17日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC N0.8922。
[0008]上述提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株的構建方法，步驟是:
[0009](I) ClrB過表達載體的構建及轉化:
[0010]以草酸青霉CGMCC N0.5302基因組為模板，克隆clrB基因的編碼區與終止子區，然后以質粒PAN7-1 (GenBank: Z32698.1)為模板，擴增來源于構巢曲霉(Aspergillus nidulans)的3’-磷酸甘油醒脫氫酶編碼基因(gpdA)的啟動子序列gpdA(p) (GenBank:Z32524.1)，將所獲得的 gpdA(p)啟動子區與 ClrB (GenBank:EPS31045.1)基因的編碼區和終止子區，以及篩選標記Ptra基因序列(硫胺吡啶抗性基因)利用Double-joint PCR方法融合成clrB組成型過表達盒重組片段，然后將此重組片段與克隆載體pMD18-T(TaKaRa Code:D103A)經T/A連接，從而獲得攜帶有ClrB過表達盒的載體PTClrB0然后通過制備原生質體轉化的方法，將ClrB過表達盒的載體pTClrB轉入到草酸青霉菌株CGMCC N0.5302獲得轉化子ClrB的過表達菌株，命名為草酸青霉RE-ClrB，其基因型為 gpdA (P):: clrB::ptra。
[0011](2) CreA基因的敲除:
[0012]通過同源重組雙交換的方法在獲得的草酸青霉RE-ClrB中敲除CreA(GenBank:EPS28222.1)基因；得到缺失creA基因的重組草酸青霉，命名為草酸青霉RE-CCreA,其基因型為 Δ creA::bar-gpdA(p):: clrB::ptra。
[0013]上述基因重組方法，是通過設計帶有creA基因序列同源臂的和篩選標記bar (草胺磷抗性基因)的重組片段。然后通過制備原生質體轉化的方法，將creA敲除盒重組片段轉入到草酸青霉重組菌株RE-ClrB中，creA敲除盒兩端的同源臂與基因組上的目的基因creA相對應的同源序列發生雙交換重組，從而使抗性基因bar將原有的基因的編碼區置換下來，然后獲得CreA基因敲除同時ClrB組成型過表達的重組菌株草酸青霉RE_CCreA( Δ creA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra)。
[0014](3)Bgl2基因的敲除:
[0015]通過同源重組雙交換的方法在獲得的草酸青霉RE-CCreA中進一步敲除Bgl2(GenBank:EPS25645.1)基因，得到缺失bgl2基因的草酸青霉重組菌株即為提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株,命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum)RE_10,其基因型為 Δ bgl2::hph- Δ creA::bar-gpdA(p):: clrB::ptra。
[0016]上述基因重組方法,是通過DoubIe-joint PCR方法合成帶有bgl2基因序列同源臂的和篩選標記hph (潮霉素抗性基因)的重組片段，其中bgl2基因序列同源臂位于篩選標記hph的兩側。然后通過制備原生質體轉化的方法，將bgl2敲除盒重組片段轉入到草酸青霉菌株RE-CCreA中 ，bgl2敲除盒兩端的同源臂與基因組上的目的基因bgl2相對應的同源序列發生雙交換重組，從而使抗性基因hph將原有的基因的編碼區置換下來，獲得敲除Bgl2 基因的重組菌株，命名為草酸青霉 RE-10 ( Abgl2::hph-Δ creA::bar_gpdA(p)::clrB::ptra)0
[0017]本發明所述提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株在生產纖維素酶和半纖維素酶中的應用，方法是:
[0018](I)菌種選擇:選工程菌草酸青霉(Penicillium oxalicum) RE-10CGMCCN0.8922 ；
[0019](2)平板培養:將上述工程菌草酸青霉RE-10菌種接種于含有質量百分比為1.5~
2.0%的瓊脂的固體基本培養基平板上，30°C條件下，靜置培養48h ；
[0020](3)種子培養:將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接I~2環分生孢子于100毫升并加有2% (質量百分比)葡萄糖(或3%麩皮)為碳源的液體基本培養基中，30°C條件下，150~250轉/分鐘，pH5.0~5.8，搖床振蕩培養16~24小時，制得種子液；
[0021](4)產酶培養:以體積比為10%的接種量，將步驟(3)的種子液接種于200毫升并加有終濃度3%微晶纖維素和3%麩皮為碳源的液體產酶培養基中，pH5.0~5.8，30°C條件下，150~250轉/分鐘振蕩培養72~168h，制得擴大量的發酵培養菌液；
[0022](5)收集發酵培養菌液:發酵結束后，將發酵液在8，000轉/分鐘的轉速下離心10分鐘，收集上清液，常規方法分離提純纖維素酶和半纖維素酶；
[0023]上述的應用中，步驟(3)、(4)中所述振蕩培養，優選200轉/分鐘。
[0024]上述的應用中，步驟(4)所述的振蕩培養，優選培養時間為120小時。
[0025]上述的應用中，步驟(4)所述的pH優選為pH5.6。
[0026]本發明應用生物工程技術獲得并公開了草酸青霉(Penicillium oxalicum)RE-10(Δ bgl2::hph- Δ creA::bar-gpdA(p):: clrB::ptra)工程菌株(CGMCC N0.8922),實驗證實利用本發明提供的工程菌在生產纖維素酶和半纖維素酶中，其纖維素酶和半纖維素酶生產能力明顯增強，在產酶培養基條件下濾紙酶活相比野生出發菌株(CGMCC N0.5302)提高52倍，相比目前工業生產纖維素酶和半纖維素酶誘變突變株，本發明提供的工程菌生產周期明顯縮短(縮短24~36h)，且纖維素酶和半纖維素酶產量高，生產成本低，并可以應用于纖維素酶和半纖維素酶中的大規模生產，具有良好的工業開發和應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]本發明所述草酸青霉(Penicillium oxalicum)RE_10菌株已于2014年3月17日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC N0.8922。
[0028]圖1:本發明所述草酸青霉(Penicillium oxalicum) RE-10 (CGMCC N0.8922)與野生(Wild-type)出發菌株(CGMCC N0.5302)在纖維素液體培養條件下培養液中纖維素酶和半纖維素酶活測定:濾紙酶活(A圖)，外切纖維素酶活(B圖)，內切纖維素酶(C圖)和木聚糖酶(D圖)測定。
[0029]圖2:本發明所述酸青霉(Penicillium oxalicum) RE-10 (CGMCC N0.8922)與野生(Wild-type)出發菌株(CGMCC N0.5302)在麩皮和纖維素復合碳源產酶發酵條件下培養液中濾紙酶活。
【具體實施方式】[0030]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0031]一般性說明:
[0032]微生物來源
[0033]實施例中的出發菌株草酸青霉(Penicillium oxalicum)CGMCC N0.5302是 申請人:先前專利申請時保藏的菌株，該菌株已于2011年9月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號為CGMCC N0.5302。
[0034]培養基
[0035]所述基本培養基(Vogel，s)鹽組分(IL)=Na3Citrate.2H20, 125g, KH2PO4, 250g,NH4NO3, 100gjMgSO4.7Η20，10g, CaCl2.2Η20，5g，微量元素溶液 5ml，生物素溶液 2.5ml, 121。。滅菌30min。
[0036]所述微量元素溶液(100ml):Citric acid.H20,5g, ZnSO4.7H205g,Fe (NH4) 2 (SO4) 2.6H201g, CuSO4.5H200.25g, MnSO4.H2O0.05g, H3BO30.05g,Na2MoO4.2H200.05g。
[0037]所述生物素溶液:5.0mg溶于50ml無菌水中。
[0038]所述轉化培養基:基本培養基中加2%的葡萄糖為碳源，IM D-山梨醇為原生質體的滲透壓穩定劑。基本培養基中根據轉化外源片段遺傳篩選標記基因的不同，分別加入終濃度200ug/ml的潮霉素B (EMRESC0，產品編號2012C098，抗性基因hph)、終濃度300ng/ml的硫胺吡唳(Sigma,產品編號P0256,抗性基因ptra)或終濃度1.6mg/ml的草胺磷(PESTANAL，產品編號 278-636-5，抗性基因 bar)，121°C滅菌 30min，pH5.6。[0039]所述分單孢培養基:基本培養基中加2%的葡萄糖為碳源，根據轉化外源片段中遺傳篩選標記基因的不同，分別加入終濃度200ug/ml的潮霉素B (hph)、終濃度300ng/ml的硫胺吡唳(ptra)或終濃度1.6mg/ml的草胺磷(bar), 121°C滅菌30min, pH5.6。
[0040]所述發酵產酶培養基:基本培養基鹽組分中，添加2%的微晶纖維素(或3%的微晶纖維素+3%的麩皮)為碳源，pH5.6。
[0041]硫胺吡唳溶液配制:用無菌水配制100ug/ml的硫胺吡唳母液。
[0042]草胺磷溶液:用無菌水配制10%的草胺磷母液。
[0043]所述纖維素酶和半纖維素酶活測定緩沖液試劑配制:
[0044]醋酸-醋酸鈉緩沖液:量取590ml0.2M的NaAC溶液與410ml0.2M的HAC溶液，混合配制成pH ^ 4.8的0.2M的HAC-NaAC緩沖液1000ml ；
[0045]pNP 溶液:300ng/ μ I 的 pNP (4-Nitrophenol, Aldrich 產品編號 241326)溶液儲存液，使用時稀釋到60ng/l.! I ；
[0046]PNPG 溶液:將 pNPG (p-Nitrophenyl β -D-cellobioside, Sigma 產品編號 N5759)溶于0.2mol/l醋酸-醋酸鈉緩沖液中，配成IOmM反應液；
[0047]pNPC 溶液:將 pNPC(4-Nitrophenyl β-D-cellobioside, Sigma 產品編號 N5759)溶于0.2mol/l醋酸-醋酸鈉緩沖液中，配成lmg/ml反應液；
[0048]10%Na2C03酶反應終止液:準確稱量IOg Na2CO3,加入100mL的雙蒸水，充分溶解后混勻；
[0049]DNS試劑:首先將Na0H104g溶于1300ml蒸餾水中，加入3，5_ 二硝基水楊酸30g，混勻，加熱溶解；其次，稱取酒石酸鉀鈉910g溶于2500ml蒸餾水中，再加入25g重蒸酚和25g無水亞硫酸鈉，加入到酒石酸鉀鈉溶液中；將以上各步驟的溶液混合，加入1200ml蒸餾水(總體積5000ml)，放在棕色瓶中，暗處放置一周后即可使用；
[0050]木聚糖溶液:稱取Ig的木聚糖(Beechwood Xylan, Sigma產品編號X4252)溶于100mL醋酸-醋酸鈉緩沖液。
[0051]洗分生孢子生理鹽水:0.9%的NaCl和0.05%的吐溫-80水溶液，121°C滅菌30min。
[0052]蛋白質濃度測定:吸取稀釋10倍的發酵液上清液10μ I與200ul反應液試劑(Bio-Ras試劑盒)充分混合，595nm測吸光值。
[0053]pME2892質粒采用如下論文中記載的方法制備(Krappmann, S et al.2005.Deletion and allelic exchange of the Aspergillus fumigatus veA locus via a novelrecyclable marker module.Eukaryot Cell，4(7)，1298-307.)。
[0054]pSilent-1質粒釆用如下論文中記載的方法制備(Nakayashiki，H et al.2005.RNA silencing as a tool for exploring gene function in ascomycete fung1.FungalGenetics and Biology，42 (4)，275-283.)。
[0055]pUC-bar質粒釆用如下論文中記載的方法制備(Luo，Z.et al.2013.Ablation of the creA regulator results in amino acid toxicity, temperaturesensitivity,plei otropic effects on cellular development and loss of virulencein the filamentous fungus Beauveria bassiana.Environ Microbiol.)。
[0056]pAN7_l質粒釆用如下論文中記載的方法制備(Punt，P.J.et al.1990.Functionalelements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encodingglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.Gene, 93(I), 101-9.)。
[0057]草酸青霉染色體DNA大量提取:
[0058](1)將草酸青霉IX IO6數量的分生孢子接種于100mL的Vogel’ s鹽基本培養基中，碳源為2%的葡萄糖，200rpm，30°C培養48h。
[0059](2)將菌懸液用真空抽濾泵除去培養基，并用0.09M NaCl溶液洗滌一次，轉移抽干的菌絲體至研缽中，加液氮冷凍并將菌絲體研磨至粉末狀。
[0060](3)把菌絲體粉末以質量體積比1:5 (菌絲重:抽提液)加入到抽提液緩沖液(200mMTris-HCl、pH8.5，250mM NaCl,25mM EDTA,2% SDS)中，混勻，65°C保溫 30min。
[0061](4)加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)溶液至樣品中，顛倒混勻，12000印111室溫離心10min。
[0062](5)緩慢吸取上層水相至另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，顛倒混勻，_20°C放置 20min, 12000rpm, 4°C, IOmin,收集沉淀。
[0063](6)以70%乙醇洗滌沉淀一次，12000rpm, 2min,然后，真空干燥，用適量ddH20完全溶解沉淀。
[0064](7)加入終濃度 0.1 μ g/ μ I 的 RNAase, 37°C溫育 Ih0
[0065](8)再加入等體積苯酹/氯仿抽提一次，12000rpm, 20min。
[0066](9)上清轉移至另一離心管中，加0.1倍體積3M NaAc (pH4.8)和0.6倍體積異丙醇，于 _20°C放置 20min，12000rpm, 4°C，IOmin,收集沉淀。
[0067](10)加70%乙醇，洗滌一次，待乙醇揮發完全，用適量ddH20溶解，制得草酸青霉基因組DNA。
[0068]實施例1、草酸青霉ClrB基因過表達菌株的構建
[0069](I)草酸青霉ClrB編碼區及終子區片段的克隆
[0070]以提取到的草酸青霉基因組DNA為模板，在ClrB編碼區及終子區設計特異引物clrB-Fa和clrB-Ra進行PCR擴增，獲得片段1，引物序列如下:
[0071]上游引物
[0072]clrB-Fa:
[0073]5， -AACAGCTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCATGTTCCACACCTTTGAAGG-3’
[0074]下游引物
[0075]clrB-Ra:
[0076]5， -CCAATGGGATCCCGTAATCAATTGCCCGTAGCACCAGCGAAACATAC-3，。
[0077](2)草酸青霉ClrB過表達盒啟動子區gpdA(p)的克隆
[0078]ClrB過表達盒啟動子采用來源于構巢曲霉3 磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因(gpdA)的啟動子序列。gpdA啟動子序列的擴增以質粒PAN7-1為模板,設計引物PgpdA-Fl和PgpdA-F2進行PCR擴增，獲得片段2，引物序列如下:
[0079]上游引物PgpdA-Fl: 5，-AGTCAGACGGCGTAACCAAA-3，
[0080]下游引物PgpdA-F2:5，-GTAAGGATTTCGGCACGG-3，。
[0081 ] (3) ClrB過表達盒篩選標記ptra序列的擴增
[0082] 篩選標記表達盒的構建以質粒PME2892為模板，設計引物PtraFl和PtraRl，PCR擴增制得片段3，引物序列如下:[0083]上游引物PtraFl: 5 ’ -GGGCAATTGATTACGGGATC-3 ’
[0084]下游引物PtraRl: 5 ’ -ATGGGGTGACGATGAGCCGC-3 ’。
[0085](4) ClrB 過表達盒 gpdA (p):: clrB::ptra 的擴增
[0086]將上述(I)、⑵和(3)步驟中PCR擴增出的片段1、片段2和片段3以摩爾比2:1:1混合并作為融合PCR反應的模板(50ul融合PCR反應體系中，模板總添加量不超過500ng)，獲得融合PCR產物4。融合PCR條件為:94°C，90s，12個循環(94°C ,30s, 58°C,10min，72°C 3min)，72°C lOmin，然后將上述PCR產物4稀釋20倍后作為模板，設計引物PgpdA-F2和PtraRl進行PCR擴增，獲得ClrB過表達盒片段，引物序列如下:
[0087]上游引物:PgpdA-F2:5’-GTAAGGATTTCGGCACGG-3’
[0088]下游引物:PtraRl:5，-ATGGGGTGACGATGAGCCGC-3，
[0089]將上述獲得ClrB過表達盒片段與克隆載體PMD18_T (Takara Code6011)經T/A連接，獲得攜帶有ClrB過表達盒的載體PTClrB。
[0090](5)質粒PTClrB轉化草酸青霉菌株
[0091](1)草酸青霉菌株(菌種保藏號=CGMCC N0.5302)原生質體的制備
[0092]①取新鮮生孢的草酸青霉平板或斜面，用無菌的生理鹽水(0.9%NaCl, 0.05%Tween),將分生孢子洗下,制備草酸青霉分生孢子懸液。
[0093]②在Vogel’ s基本培養基(2%葡萄糖為碳源)平板上蓋一層玻璃紙，并用玻璃棒鋪平，在玻璃紙上加入50-100 μ I孢子懸液，涂布均勻。做8-10個同樣處理，30°C培養約12-15h。
[0094]③加0.1g 裂解酶(Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum, Sigma 產品編號 L1412)到 20ml 溶液 I 中(1.2M sorbitol, 0.1M KH2PO4, ρΗ5.6)，輕輕搖均，并用 0.2 μ m濾器過濾除菌到培養皿或試管中。
[0095]④吸取2_3ml裂解酶溶液到無菌培養皿中，在溶液表面覆蓋一層長有草酸青霉菌體的玻璃紙，然后再加2-3ml裂解酶液，按此順序依次疊放6-7層，在兩層玻璃紙之間不能留存大的氣泡。放置培養皿于30 V培養箱中，為使酶液在培養皿中分布均勻，酶解期間可輕輕晃動培養皿1-2次。
[0096]⑤酶解約90min后，用鑷子挑取玻璃紙，用移液槍吸取溶液沖掉玻璃紙上殘留的菌絲體，大的菌絲團塊可用移液槍(槍尖剪掉)緩慢吹打。
[0097]⑥準備帶有玻璃棉的漏斗，并滴加數滴溶液I到玻璃棉使其緊貼漏斗內壁。用玻璃棉漏斗過濾原生質體懸液到50ml離心管中，并置于冰上,然后用數毫升溶液I沖洗玻璃棉，過濾液的總體積不超過35ml。利用水平轉子2000rpm,4°C離心10min后，小心棄掉上清液，并用 4ml 冰冷的溶液 2(1M sorbitol 18.22g ;50mmol/L CaCl2 ；10mM/L TrisHCl，pH7.5)重懸原生質體，然后離心4°C，2000rpm,離心10min，小心棄掉上清液，并用0.5-1.0ml冰冷的溶液2重懸原生質體，置原生質體懸液于冰上。
[0098]⑦原生質體的質量控制(顯微鏡觀察):a、在載玻片上滴加3μ I原生質體懸液，在蓋玻片旁滴加3μ I無菌水，原生質體細胞內因滲透壓高于細胞外水的滲透壓吸水脹裂，而分生孢子則不受影響；b、通過血球計數板小室計算原生質體數量(幾個小格即可)。原生質體終濃度應大于108，如果原生質體數量太高，可用溶液2稀釋到5X108。z=nX (400/f) X IO5, η=原生質體計數數量，f=計數的小格數量。[0099](II)草酸青霉原生質體的轉化
[0100]①在200 μ I草酸青霉原生質體懸液中加入不超過10 μ I的質粒PTClrB和50 μ IPEG 溶液(25%PEG6000，50mmol/L CaCl2,10mmol/L TrisHCl，pH7.5)，混勻轉化體系，并在冰上放置20min。轉化用DNA片段應純化，DNA濃度應不少于I μ g/ μ I。
[0101]②加2ml PEG (室溫)，輕輕混勻，20°C放置5min，然后加入4ml溶液2，輕輕混勻。
[0102]③吸取0.2-lml轉化體系混合液到4ml預保溫(55°C )的上層轉化培養基中，輕輕混勻，并立即倒入鋪有下層轉化培養基的平板上，等培養基凝固后，置30°C培養，其中轉化培養基的上、下層均加有終濃度300ng/ml的硫胺吡啶作為篩選轉化子的抗性試劑。
[0103]④在轉化培養基上培養3-4天后，用接種針挑取轉化子到分單孢培養基，分單孢培養基中加入終濃度300ng/ml的硫胺吡啶作為轉化子的篩選試劑，30°C培養2_3天，長出分生孢子，用無菌的生理鹽水將分生孢子洗下，制成孢子懸液，并將其在含有Triton-XlOO的分單孢培養基平板上劃線培養，以消除轉化子異核體的影響，獲得ClrB過表達的重組草酸青霉，命名為草酸青霉RE-ClrB (gpdA(P)::clrB::ptra)。
[0104]實施例2、草酸青霉CreA編碼基因的敲除
[0105](1)草酸青霉」creA::bar敲除盒上游同源臂片段的克隆
[0106]以提取到的草酸青霉基因組DNA為模板，設計特異引物CreA_F2和CreAbar-R進行PCR擴增CreA編碼基因敲除盒上游同源臂片段1，引物序列如下:
[0107]上游引物CreA-Fl: 5 ’ -CATTCCAGAGATGAACGACC-3 ’
[0108]下游引物
[0109]CreAbar-R: 5，-GAAGGCCTGTAAGCGAATTAGCAAGCGTCGATGTGGGAACACCGGATA T-3，。
[0110](2)草酸青霉」creA::bar敲除盒下游同源臂片段的克隆
[0111]以上述一般性說明中的方法提取到的草酸青霉基因組DNA為模板，設計特異引物CreAbar-F和CreA_R2進行PCR擴增CreA編碼基因敲除盒下游同源臂片段2，引物序列如下:
[0112]上游引物CreAbar-F:
[0113]5 ’ -GCAGGGCAAGAGAGGGCAGCAAGCCAGTGCACTCTCACGACTCATTGCTC-3，
[0114]下游引物CreA-Rl: 5 ’ -CCAGAGGATGGAACAAACAC-3 ’。
[0115](3) Zl creA::bar敲除盒遺傳轉化篩選標記表達盒bar序列的擴增
[0116]以質粒pUC-bar為模板，設計引物Bar-F和Bar-R進行PCR擴增，獲得篩選標記表達盒片段3，引物序列如下:
[0117]上游引物Bar-F: 5，-GACGCTTGCTAATTCGCTTAC-3，
[0118]下游引物Bar-R: 5，-GCACTGGCTTGCTGCCCTC-3，。
[0119](4) creA敲除盒序列的擴增
[0120]將實施例2中上述(I)、⑵和(3)步驟PCR擴增出的片段1、片段2和片段3以摩爾比1:1: 2混合并作為融合PCR反應的模板(50ul融合PCR反應體系中，模板總添加量不超過500ng)，獲得融合PCR產物4，將PCR產物4稀釋20倍后作為模板，設計引物CreA-F2和CreA_R2進行特異性擴增,獲得Zl creA::bar敲除盒片段,引物序列如下:
[0121]上游引物:CreA-F2:5’ -CGAACGGTCACCTCATCAAA-3 ’
[0122]下游引物:CreA-R2:5’ -AAGGACGGATTCCCCGAGAT-3 ’。[0123](5)草酸青霉重組菌株RE-ClrB原生質體的制備
[0124]creA的敲除以實施例1中構建的重組草酸青霉菌株RE-ClrB為出發菌株，該菌株原生質體的制備方法根據實施例1中草酸青霉出發菌株(CGMCC N0.5302)原生質體的制備方法執行。
[0125](6) Zl creA::bar敲除盒片段的原生質體轉化
[0126]①在200 μ I草酸青霉ClrB過表達菌株RE-ClrB原生質體懸液中加入不超過10μ I 的」creA::bar 敲除盒和 50 μ I PEG 溶液(25%PEG6000，50mmol/L CaCl2, lOmmol/LTrisHCl，pH7.5)，混勻轉化體系，并在冰上放置20min。轉化用DNA片段應純化，DNA濃度應不少于I μ g/μ I。
[0127]②加2ml PEG (室溫)，輕輕混勻，20°C放置5min，然后加入4ml溶液2，輕輕混勻。
[0128]③吸取0.2-lml轉化體系混合液到4ml預保溫(55°C )的上層選擇培養基中，輕輕混勻，并立即倒入鋪有下層培養基的平板上，等培養基凝固后，置30°C培養，其中轉化的上、下層培養基中均加入終濃度1.6mg/ml的草胺磷作為篩選試劑。
[0129]④在轉化培養基上培養3-4d后，用接種針挑取轉化子到分單孢培養基，分單孢培養基中加入終濃度1.6mg/ml的草胺磷作為轉化子的篩選試劑，30°C培養2_3天，長出分生孢子，用無菌的生理鹽水將分生孢子洗下，制成孢子懸液，并將其在含有Triton-XlOO的分單孢培養基平板上劃線 培養，以消除轉化子異核體的影響，獲得ClrB過表達同時敲除CreA基因的重組草酸青霉，命名為草酸青霉RE-CCreA ( Δ creA::bar_gpdA(p)::clrB::ptra)。
[0130]實施例3、草酸青霉β -葡萄糖苷酶Bgl2編碼基因的敲除
[0131](I)草酸青霉」bgl2::hph敲除盒上游同源臂片段的克隆
[0132]以提取到的草酸青霉基因組DNA為模板，設計特異引物bgl2_F2和bgl2Hph_R進行PCR擴增Bgl2編碼基因敲除盒上游同源臂片段1，引物序列如下:
[0133]上游引物Bgl2-Fl: 5’ -GGCGGATACCCACTATGACC-3’
[0134]下游引物Bgl2hph_R:
[0135]5，-GCTCCTTCAATATCAGTTAACGTCGTGGGTGTTGGTGGCAGAGTG-3，。
[0136](2)草酸青霉Bgl2敲除盒下游同源臂片段的克隆
[0137]以提取到的草酸青霉基因組DNA為模板，設計特異引物bgl2Hph_F和bgl2_R2，PCR擴增Bgl2編碼基因敲除盒下游同源臂片段2，引物序列如下:
[0138]上游引物Bgl2hph_F:
[0139]5’ -GAAAATTCCGTCACCAGCCCTGGGTTGTCTCCTGCTTTCTTGTTCGC-3’
[0140]下游引物Bgl2-Rl: 5，-CGATTACGTTTCTGCTCCAC-3，。
[0141](3)草酸青霉Bgl2敲除盒遺傳轉化篩選標記表達盒序列的擴增
[0142]以質粒PSlient-l為模板，設計引物Hphs-F和Hphs-R進行PCR擴增，獲得篩選標記hph表達盒片段3，引物序列如下:
[0143]上游引物Hphs-F: 5，-CGACGTTAACTGATATTGAA-3 ’
[0144]下游引物Hphs-R: 5 ’ -CAACCCAGGGCTGGTGACGG-3 ’。
[0145](4)草酸青霉Bgl2敲除盒序列的擴增
[0146]將實施例3中上述(I)、⑵和(3)步驟PCR擴增出的片段1、片段2和片段3以摩爾比1:1: 2混合并作為融合PCR反應的模板(50ul融合PCR反應體系中，模板總添加量不超過500ng)，獲得融合PCR產物4，將PCR產物4稀釋20倍后作為模板，設計引物bgl2-F2和bgl2-R2進行特異性擴增，獲得」bgl2::hph敲除盒片段，引物序列如下:
[0147]上游引物:Bgl2-F2:5’-GCTTGGCACGGGCTTGATTG-3’
[0148]下游引物:Bgl2-R2:5’-GAGTAGACGGTGGCCGAGGA-3’。
[0149](5)草酸青霉重組菌株RE-CCreA原生質體的制備
[0150]bgl2的敲除以實施例2中構建的重組草酸青霉菌株RE-CCreA為出發菌株，該菌株原生質體的制備方法根據實施例1中草酸青霉出發菌株(CGMCC N0.5302)原生質體的制備方法執行。
[0151](6) Zl bgl2::hph敲除盒片段的原生質體轉化
[0152]①在200 μ1重組草酸青霉菌株RE-CCreA原生質體懸液中加入不超過10 μ 1的」bgl2::hph 敲除盒片段和 50μ 1 PEG 溶液(25%PEG6000，50mmol/L CaCl2, lOmmol/LTrisHCl，pH7.5)，混勻轉化體系，并在冰上放置20min。轉化用Z bgl2::hph敲除盒片段應純化，DNA濃度應不少于1 μ g/μ 1。
[0153]②加2ml PEG (室溫)，輕輕混勻，20°C放置5min，然后加入4ml溶液2，輕輕混勻。
[0154]③吸取0.2-lml轉化體系混合液到4ml預保溫(55°C )的上層轉化培養基中，輕輕混勻，并立即倒入鋪有下層轉化培養基的平板上，等培養基凝固后，置30°C培養，其中轉化培養基的上、下層均加有終濃度200ug/ml的潮霉素B作為篩選轉化子的抗性試劑。
[0155]④在轉化培養基上培養3-4天后，用接種針挑取轉化子到分單孢培養基，分單孢培養基中加入終濃度200ug/ml的潮霉素B作為轉化子的篩選試劑，30°C培養2_3天，長出分生孢子，用無菌的生理鹽水將分生孢子洗下，制成孢子懸液，并將其在含有Triton-XlOO的分單孢培養基平板上劃線培養，以消除轉化子異核體的影響，獲得ClrB過表達同時敲除CreA和Bgl2基因的重組草酸青霉即為提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株，命名為草酸青霉 RE-10,其基因型為 Δ bgl2::hph- Δ creA::bar_gpdA (p):: clrB::ptr
B o
[0156]上述草酸青霉RE-10菌株已于2014年3月17日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC N0.8922。
[0157]實施例4纖維素酶和半纖維素酶液的制備及酶活性測定
[0158](1)纖維素酶和半纖維素酶液的制備纖維素酶
[0159]將草酸青霉出發菌株CGMCC N0.5302以及草酸青霉重組菌株RE-10 (CGMCCN0.8922)，接種于基本培養基(50ml )，碳源為2%葡萄糖，200rpm, 30°C培養24h，分別制備出發菌株CGMCC N0.5302以及草酸青霉重組菌株RE-10種子培養液，然后各量取IOml的種子培養液分別轉接到裝有100ml2%微晶纖維素為碳源(或3%微晶纖維素+3%麩皮為碳源)培養基的三角瓶中，200rpm，30°C培養，分別在轉接培養后時間點24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h時取菌體培養液樣品，然后將所獲取的每個時間點的樣品1000Orpm離心5min，吸取樣品上清液，然后分別檢測培養上清液中的濾紙酶活、外切葡聚糖酶活、內切葡聚糖酶活和木聚糖酶活。
[0160](2)纖維素酶和半纖維素酶液的制備及酶活性測定
[0161]濾紙酶活測定:稱取50mg Waterman定量濾紙片(Whatman產品編號CatNo1001125)，加入1ml醋酸緩沖液(pH=4.8)和0.5ml稀釋5-30倍的粗酶液，混勻。500CzjC浴60min，加入2ml DNS終止反應，煮沸5min，靜置冷卻后，加蒸餾水定容到25ml，搖勻，在光吸收波長540nm測OD值。
[0162]內切葡聚糖酶活測定:取0.5ml稀釋10_30倍的粗酶液，加入lmll%CMC-Na溶液，混勻，50°C水浴30min，加入2ml DNS，終止反應，煮沸5min，靜置冷卻后，加蒸餾水定容到25ml，搖勻，在光吸收波長540nm測OD值。
[0163]外切葡聚糖酶活測定:取0.5ml稀釋10-30倍的粗酶液，加入50 μ I pNPC (lmg/ml)，50°C保溫30min ;加入150 μ 110%NaC03終止反應，405nm測定對硝基酚生成量計算酶活力。
[0164]木聚糖酶酶活測定:在Iml用0.2M pH4.8的HAC-NaAC緩沖液配制的1%的燕麥木聚糖懸浮液中，添加0.5ml稀釋50-700倍的酶液，50°C反應30min，加入2ml DNS,終止反應，煮沸5min，靜置冷卻后，加蒸餾水定容到25ml，搖勻，在光吸收波長540nm測OD值，DNS法測定酶解液中的還原糖量(以木糖計)。
[0165]β_葡萄糖苷酶活測定:取0.5ml稀釋10倍的粗酶液，加入50 μ I pNPG (IOmM),50°C保溫30min ;加入150 μ 110%NaC03終止反應，405nm測定對硝基酚生成量計算酶活力。
[0166]草酸青霉出發菌株(CGMCC N0.5302)菌株與本發明構建重組菌株RE-1O ( Δ bgl2- Δ creA-gpdA (p)::clrB)在產酶培養基(3%的微晶纖維素+3%的麩皮為碳源)條件下培養120h時發酵液中纖維素酶及半纖維素酶活如表1。
[0167]酶活力單位:一分鐘內水解底物產生I μ mo I還原糖或對硝基苯酚所需的酶量定義為I個酶活單位。
[0168]表1產酶發酵培養基(3%的微晶纖維素+3%的麩皮為碳源)條件下野生菌株(CGMCC N0.5302)與本發明構建重組菌株RE-10培養120h時上清液中纖維素酶和半纖維素
酶活
[0169]
【權利要求】
1.一種提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株，其特征在于:所述菌株命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum)RE_10,該菌株已于2014年3月17日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC N0.8922。
2.權利要求1所述提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株的構建方法，步驟是: (1)ClrB過表達載體的構建及轉化:以草酸青霉CGMCCN0.5302基因組為模板，克隆clrB基因的編碼區與終止子區，然后以質粒pAN7-l為模板，擴增來源于構巢曲霉(Aspergillus nidulans)的3’-磷酸甘油醒脫氫酶編碼基因(gpdA)的啟動子序列gpdA(p),將所獲得的gpdA(p)啟動子區與ClrB基因的編碼區和終止子區，利用Double-joint PCR方法融合成clrB組成型過表達盒重組片段，然后將此重組片段與克隆載體PMD18-T經T/A連接，從而獲得攜帶有ClrB過表達盒的載體pTClrB,將ClrB過表達盒的載體pTClrB轉入到草酸青霉菌株CGMCCN0.5302獲得轉化子ClrB的過表達菌株，命名為草酸青霉RE-ClrB，其基因型為 gpdA (P):: clrB::ptra ； (2)CreA基因的敲除:通過同源重組雙交換的方法在獲得的草酸青霉RE-ClrB中敲除CreA基因；得到缺失creA基因的重組草酸青霉，命名為草酸青霉RE-CCreA，其基因型為AcreA::bar_gpdA(p)::clrB::ptra ； (3)Bgl2基因的敲除:通過同源重組雙交換的方法在獲得的草酸青霉RE-CCreA中進一步敲除Bgl2基因，得到缺失bgl2基因的草酸青霉重組菌株即為提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株，命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum)RE_10,其基因型為Δbgl2::hph-ΔcreA::bar_gpdA(p)::clrB::ptra。
3.權利要求1所述提高纖維素酶和半纖維素酶酶活性的草酸青霉菌株在生產纖維素酶和半纖維素 酶中的應用。
【文檔編號】C12N9/42GK103911296SQ201410160118
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】曲音波, 李忠海, 姚光山, 秦玉琪, 李雪芝 申請人:山東大學