專利名稱：一種液固雙重發酵制備微生態制劑的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程制備技術領域，涉及一種通過液態發酵和固態發酵制備高濃度蠟樣芽胞桿菌固態微生態制劑的方法。
背景技術：
動物微生態學是近20年來發展起來的新興學科，是研究正常微生物與動物體內環境、動物體與外界環境和正常微生物之間三者的相互關系，以動物體內微生態的平衡與失調等理論為核心，具有細胞學水平和分子水平的生命科學，微生物作為活菌飼料添加劑是微生態學的又一發展。微生態制劑一般又稱為微生態調節劑，通過加強腸道微生物區系的屏障作用或通過增進非特異性免疫功能，維持宿主微生態平衡，提高其健康水平。目前，用來做益生素的有益菌種類較多，美國FDA(1989)規定可以飼喂的微生物有43種，我國農業部1999年6月公布的飼料及微生物添加劑也有12種之多，應用較多的為乳酸桿菌、糞鏈 球菌、酵母菌和芽孢桿菌，蠟樣芽孢桿菌為桿狀菌體，既能產生具有活性較強的蛋白酶、月旨肪酶和淀粉酶，又能產生具有相當高熱穩定性的抗菌活性蛋白，具有抑制動植物病害的能力，是自然界中廣泛存在的非致病菌，對人畜無害，不污染環境，因此被廣泛應用于飼料、農業、醫藥保健和食品等各領域；通常所用的蠟樣芽孢桿菌是從中國科學院黃海水產研究所引進的，是從健康的海參腸道和周圍生活環境中分離篩選出對海參腐皮綜合癥具有拮抗作用的土著益生菌。現有的固態微生態制劑特別是蠟樣芽胞桿菌固態微生態制劑的方法通常有兩種工藝技術方案，一種是先進行液態深層發酵，最后加入固態載體吸附，干燥而成；液態發酵培養可得到較純菌體，但成本高，發酵易受產物反饋控制，難以得到高濃度菌株，其產品的有效菌數含量較低；另一種是常規固態發酵的模式；但現有的這些技術工藝方法普遍存在著工藝步驟復雜，制備成本高，產品收率低、雜菌含量高等缺點。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點，尋求設計一種高濃度蠟樣芽胞桿菌固態微生態制劑的制備方法，將蠟樣芽孢桿菌先進行液態發酵至對數生長期，再配用同重量的固體發酵基質相混合，實現大劑量菌液接種，然后再次進行固體發酵而制得高濃度菌體制劑，所以稱之為液固雙重發酵制備微生態制劑的方法。為了實現上述目的，本發明的主體工藝步驟包括液體菌液的培養、固體基料的配制和固體基料與液體菌液的混勻三個過程，其具體工藝步驟包括(I)、平板培養蠟樣保存菌種劃線接種至平板培養基，其培養基配料為大豆蛋白胨3g，NaCl 20g，葡萄糖2. 5g，磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白胨17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，32°C培養24h ；(2)、試管接種取生長良好、菌落典型的菌株接種10ml，其培養基配料為大豆蛋白胨3g，NaCl 20g，葡萄糖2. 5g，磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白胨17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，32°C培養40h ；
(3)、三角瓶接種100ml，其培養基同步驟(2)，121°C滅菌，32°C培養36h ；(4)、三角瓶接種1000ml，其培養基同步驟(3)；(5)、IOL種子發酵罐，培養液7. 5L，培養基同步驟(3)，pH值為7，121°C滅菌30分鐘，培養溫度為32°C，時間為24h，轉速150r/min，通氣量I. 5m3/h，指每分鐘通入單位發酵體積m3的空氣體積m3 ；(6)、100L種子發酵罐，培養液75L，培養基按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸錳30mg，硫酸鎂lg，磷酸氫二鈉3g，磷酸二氫鈉I. 5g，植物油2ml，氯化鈉20g，水IOOOml的比例配制，pH值調節至7. 2，121°C滅菌30分鐘，培養溫度為32°C，時間為24h，轉速150r/min，通氣量I. 5m3/h ； (7)、2000L發酵罐，培養液為1500L，培養基同步驟(6)，發酵方法同步驟(5)，培養36h。(8)、固體基質為豆柏粉1000kg，蒸煮滅菌，待冷卻至32°C時，加入步驟(7)中的發酵液900kg，固體基質重量與液體發酵液重量比為I :1，攪拌均勻后裝盤，入無菌培養室，恒溫35°C，通風，淺盤發酵54小時，中間翻料3次，發酵結束后提高溫度至60°C，加大風量，干燥，粉碎即得固體微生態制劑產品。本發明與現有技術相比，其制備工藝簡單，易于控制，不易染雜菌，菌株濃度高，后加工成本低，生產環境友好。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步說明。實施例I :制備IOOkg臘樣芽胞桿菌微生態制劑(I)、菌種平板培養蠟樣菌保存菌，劃線平板培養，平板培養基；大豆蛋白胨3g，NaCl 20g，葡萄糖2. 5g，磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白胨17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，32°C培養 24h ；(2)、試管接種菌液10ml,培養基配制大豆蛋白胨3g, NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白胨17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，32°C培養40h ；(3)、接種三角瓶100ml，培養基及培養方法按照步驟(2)進行；(4)、接種三角瓶IOOOmL,培養基及培養方法按照步驟(3)進行；(5)、接種IOL種子發酵罐，培養液為7. 5L，培養基同步驟(4)，pH值為7，121。。滅菌，等溫度降至32°C后接種菌種，培養溫度32°C，時間24h，轉速為150r/min，通氣量為I. 5m3/h ；(6)、200L種子發酵罐，接種發酵液100L，培養基按培養基按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸錳30mg，硫酸鎂lg，磷酸氫二鈉3g，磷酸二氫鈉I. 5g，植物油2ml，氯化鈉20g，水IOOOml的比例配制，pH值調節至7. 2，121°C滅菌30分鐘，培養溫度為32°C，時間為24h，轉速150r/min，通氣量I. 5m3/h ;培養制得液體菌液；(7)、固體基料豆柏粉100kg，通蒸汽，121°C滅菌30min，冷卻至32°C ;固體基質重量與液體發酵液重量比約為I :1，攪拌均勻后裝盤，入無菌培養室，恒溫35°c，通風，淺盤發酵54小時，中間翻料3次，發酵結束后提高溫度至60°C，加大風量，干燥，粉碎即得蠟樣芽胞桿菌固態微生態制劑100kg，測得其活菌濃度I. 6X109cfu/g。實施例2 :培養5噸蠟樣芽胞桿菌固態微生態制劑(I)、菌種平板培養蠟樣芽孢桿菌劃線接種至平板培養基，其培養基配方為大豆蛋白胨3g, NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氫二鉀2. 5g,胰蛋白胨17g,瓊脂15g,蒸懼水1000ml，pH 值為 7，121°C滅菌，32°C培養 24h ；(2)、試管接種菌液10ml,培養基配制大豆蛋白胨3g, NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氫二鉀2. 5g，胰蛋白胨17g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH值為7，121°C滅菌，32°C培養40h ；(3)、接種三角瓶100ml，培養基及培養方法按照步驟(2)進行；(4)、接種三角瓶IOOOmL,培養基及培養方法按照步驟(3)進行；·(5)、接種IOL種子發酵罐，培養液為7. 5L，培養基同步驟(4)，pH值為7，121。。滅菌，等溫度降至32°C后接種菌種，培養溫度32°C，時間24h，轉速為150r/min，通氣量為
I.5m3/h ；(6)、100L種子發酵罐，接種發酵液75L，培養基按按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸錳30mg，硫酸鎂lg，磷酸氫二鈉3g，磷酸二氫鈉I. 5g，植物油2ml，氯化鈉20g，水IOOOml的比例配制，pH值調節至7. 2，121。。滅菌30分鐘，培養溫度為32°C，時間為24h，轉速150r/min，通氣量I. 5m3/h ;培養制得液體菌液；(7),10噸發酵罐，接種發酵液為5噸，培養基按按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸錳30mg，硫酸鎂lg，磷酸氫二鈉3g，磷酸二氫鈉I. 5g，植物油2ml，氯化鈉20g，水IOOOml的比例配制，pH值調節至7. 2，121°C滅菌30分鐘，培養溫度為32°C，時間為48h，轉速150r/min，通氣量I. 5m3/h ;培養制得液體菌液；(8)、固體基料豆柏粉5噸，通蒸汽，121°C滅菌30min，冷卻至32°C ;固體基質重量與液體發酵液重量比為I :1，攪拌均勻后裝盤，入無菌培養室，恒溫35°c，通風，淺盤發酵54小時，中間翻料3次，發酵結束后提高溫度至60°C，加大風量，干燥，粉碎即得蠟樣芽胞桿菌固態微生態制劑100kg，測得其活菌濃度I. 8X109cfu/g。
權利要求
1. 一種液固雙重發酵制備微生態制劑的方法，其特征在于包括液體菌液的培養、固體基料的配制和固體基料與液體菌液的混勻三個過程，其具體工藝步驟包括 (1)、平板培養蠟樣保存菌種劃線接種至平板培養基，其培養基配料為大豆蛋白胨3g,NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氫二鉀2. 5g,胰蛋白胨17g,瓊脂15g,蒸懼水1000ml,pH值為 7，121°C滅菌，32°C培養 24h ； (2)、試管接種取生長良好、菌落典型的菌株接種10ml，其培養基配料為大豆蛋白胨3g,NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氫二鉀2. 5g,胰蛋白胨17g,瓊脂15g,蒸懼水1000ml,pH值為 7，121°C滅菌，32°C培養 40h ； (3)、三角瓶接種100ml，其培養基同步驟(2)，1211滅菌，321培養36h； (4)、三角瓶接種1000ml，其培養基同步驟(3)； (5 )、IOL種子發酵罐，培養液7. 5L，培養基同步驟(3 )，pH值為7，121 °C滅菌30分鐘，培養溫度為32°C,時間為24h,轉速150r/min,通氣量I. 5m3/h,指每分鐘通入單位發酵體積m3的空氣體積m3 ； (6)、100L種子發酵罐，培養液75L，培養基按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸錳30mg，硫酸鎂lg，磷酸氫二鈉3g，磷酸二氫鈉I. 5g，植物油2ml，氯化鈉20g，水IOOOml的比例配制，pH值調節至7. 2，121°C滅菌30分鐘，培養溫度為32°C，時間為24h，轉速150r/min，通氣量I. 5m3/h ； (J)、2000L發酵罐，培養液為1500L,培養基同步驟(6)，發酵方法同步驟(5)，培養36h。
(8)、固體基質為豆柏粉1000kg，蒸煮滅菌，待冷卻至32°C時，加入步驟(7)中的發酵液900kg，固體基質重量與液體發酵液重量比為I :1，攪拌均勻后裝盤，入無菌培養室，恒溫35°C，通風，淺盤發酵54小時，中間翻料3次，發酵結束后提高溫度至60°C，加大風量，干燥，粉碎即得固體微生態制劑產品。
全文摘要
本發明屬于生物工程制備技術領域，涉及一種通過液態發酵和固態發酵制備高濃度蠟樣芽胞桿菌固態微生態制劑的方法，將蠟樣芽孢桿菌先進行液態發酵至對數生長期，再配用同重量的固體發酵基質相混合，實現大劑量菌液接種，然后再次進行固體發酵而制得高濃度菌體制劑，稱為液固雙重發酵制備微生態制劑的方法；其制備工藝簡單，易于控制，不易染雜菌，菌株濃度高，后加工成本低，生產環境友好。
文檔編號A23L1/30GK102823718SQ201210345078
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者張 浩, 張守富, 徐權漢, 夏偉 申請人:青島中仁藥業有限公司