專利名稱：一種檢測肺癌骨轉移試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒，具體而言，涉及一種肺癌骨轉移熒光定量PCR檢測試劑盒。
背景技術：
目前全世界范圍內每年有超過100萬的患者被診斷為肺癌，惡性腫瘤可以轉移至體內不同的器官，骨轉移是惡性腫瘤常見并發癥之一。骨組織是惡性腫瘤遠處轉移最好發的器官，許多類型的惡性腫瘤都可以發生骨轉移，引起骨轉移的常見腫瘤有乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等。惡性腫瘤骨轉移多發生在50-80歲，40歲以下少見。骨轉移可累及全身骨骼，中軸骨(脊柱，骨盆等)及長骨近端是骨轉移的好發部位。骨轉移常為多發性，少數為單發病變。骨的破壞形式大多為溶骨型，少數為成骨型或兩者兼有(混合型)。原發性肺癌骨轉移的好發部位依次為胸部、脊柱、骨盆、肢體骨及顱骨，肺循環血·流豐富，癌細胞可循血運到達人全身骨骼系統造成骨轉移；肺癌中腺癌的骨轉移率高于其他類型原發性肺癌，可能和腺癌的生物學特性有關，腺癌周圍型肺癌較多見，容易直接侵犯到肋骨、脊柱又可以通過血路經脊柱靜脈和肺靜脈達到全身骨骼；也可能和腺癌病人存活時間長有關。肺癌骨轉移最常見的類型為溶骨性骨轉移，雖然也有局部骨組織的反應性增生，但其主要表現為骨組織的溶解破壞和吸收。成骨性轉移以大量病理性成骨為特點，這些新生骨組織呈編織樣，不具備正常骨的功能，反而破壞了骨的正常結構，影響骨的正常功能，因此會造成病理性骨折等并發癥。病理性成骨的形成是腫瘤細胞與成骨細胞相互作用的結果，但也不能忽視破骨細胞的作用。腫瘤細胞在骨局部通過破骨細胞破壞骨組織的同時，可釋放出骨組織中貯存的生長因子如TGFp、IGF等，加上腫瘤細胞自身分泌的BMP，PSA，ET-I等，可刺激成骨細胞的增殖。當成骨細胞活性增高，成骨大于破骨時，就出現了腫瘤性成骨，顯示成骨性轉移的特殊臨床病理表現。混合性轉移一般說來，由于骨代謝的特點，成骨及溶骨過程二者相互關聯，成骨細胞與破骨細胞在功能上相互依存。因此，腫瘤的骨轉移往往都是二者共存，只不過某一過程占據主導地位而已。破骨細胞的激活是所有骨轉移發生的重要先決條件。以前列腺癌為例，盡管臨床表現以成骨性轉移為主，但在轉移發生的早期階段，腫瘤細胞對骨組織的破壞是重要的起始步驟，骨組織中貯存的生長因子如TGFp、IGF等的釋放啟動了前列腺癌骨轉移的過程。隨著成骨細胞的激活，病理性成骨逐漸變得明顯，最后形成前列腺癌特有的成骨性轉移。一般來說，30% -40%的晚期肺癌會發生骨轉移，骨轉移所致的骨損害將加重患者的病情，引起功能障礙，降低患者的生活質量，甚至縮短生存期。因此，深入研究惡性腫瘤發生骨轉移的機制，分析骨轉移患者的臨床特點，早期診斷骨轉移，預防相關并發癥，可以提高患者的生活質量，為進一步的治療提供條件。
預測腫瘤骨轉移的手段有很多，如影像學診斷X線、CT，ECT，PET ;化學診斷主要包括血清學、生化、免疫學指標的檢測；細胞學和病理組織學診斷僅對病人預后和臨床治療方案選擇有一定的幫助；基因診斷的敏感性高，但極容易出現假陽性，診斷特異性取決于對靶分子的選擇，發展高通量，自動化，集成化，標準化的基因診斷技術是今后的研究方向；骨髓穿刺活檢(bone marrow biopsy):骨髓中發現的腫瘤細胞,不僅可以預測骨轉移的情況，對預測其它器官如肺、肝的轉移也很有臨床價值。惡性腫瘤骨轉移的診斷方法目前主要依賴病理和影像學檢查如穿刺細胞學檢查，X線、CT，MR和ECT檢查等，尚無特異性實驗室診斷方法，目單純依賴ECT檢查來判斷骨轉移有無及其進展狀況，已難以滿足臨床需求。惡性腫瘤骨轉移的診斷方法如能提前，可根據病人實際進行針對性治療，阻止骨轉移的發生，降低其危害。骨轉移的發生必定需要基因的調控，基因起作用亦需要上游RNA的調控，所以、以miRNA為診斷檢測骨轉移的指標可將預測病變的時間大大提前，為阻止骨轉移創造更佳的時機并爭取更多的時間。
由于miRNA對引起骨轉移的基因具有重要調控作用，因此本發明針對可引起骨轉移病變的miRNA開發出一對特異性引物，并開發制作出試劑盒，并經大群體人群實驗驗證，結果顯示本發明設計的可預測肺癌骨轉移的試劑盒能有效檢測可引起肺癌骨轉移miRNA的發生。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測小RNA表達水平的熒光定量PCR試劑盒及使用方法，該PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈敏度高，定量快速準確、穩定性好，具有良好的應用前景。本發明的另一目的是在于提供一種熒光定量PCR試劑盒對肺癌是否發生骨轉移進行快速的檢測。為了實現上述目的，本發明首先分別提取了肺癌發生骨轉移患者腫瘤細胞和肺癌未發生骨轉移患者腫瘤細胞的總RNA,并從中純化miRNA,利用Single-end library建庫方法，共得到兩個肺癌骨轉移前后腫瘤細胞miRNA轉錄組文庫。對所得的miRNA轉錄組文庫進行高通量測序，對高通量測序序列過濾，去除低質量序列，使用S0AP2方法跟人類基因組進行比對。并對測序結果進行分析，其中通過fold-change方法，對不同樣本的表達差異基因進行了比較，得到了表達差異顯著的miRNA novel_mir_89，其序列見序列表SEQ ID NO. 5。本發明根據noVel_mir_89的序列信息，設計了四條引物，第一條為莖環狀結構的反轉錄引物RT89，其序列見序列表SEQ NO. I ;第二條是上游的特異引物F89，其序列見序列表SEQ NO. 2 ;第三條為下游的通用引物R89，其序列見序列表SEQ NO. 3 ;第四條是在熒光定量PCR中需要的熒光探針引物Flu89，其序列見序列表SEQ NO. 4，在熒光探針Flu89的5’端標有熒光基因FAM，在熒光探針Flu89的3’端標有熒光淬滅基團TAMRA。本發明還制備了含有noVel_mir_89序列的標準DNA模板。制備步驟方法如下提取肺癌發生骨轉腫瘤細胞的總RNA，從中純化出miRNA，接著進行逆轉錄反應，反轉錄體系為莖環狀結構的反轉錄引物RT89，SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ 1，miRNA4y tl, dNTP混合物(每種 2. Smmol /I,) 4 μ 1,0. lmol/L DTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆轉錄酶(200U/μ1)2μ1。反應條件為37°C水浴60分鐘，95°C水浴3分鐘。將逆轉錄反應得到的cDNA進行常規PCR擴增，PCR產物檢測后切膠回收并純化，將純化產物連接到PGM-T克隆載體上，隨后轉化到DH5a感受態細胞中。通過序列為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的特異性引物篩選陽性克隆。陽性克隆擴增后提取質粒DNA，質粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量儀定量(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware)并做10倍系列稀釋作為標準品用于標準曲線的制備。本發明還制備了一種檢測novel_mir_89表達水平的突光定量PCR試劑盒，組分如下特異性引物、特異性探針、標準DNA模板、熒光定量PCR反應液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ IDN0.2，下游引物序列為SEQ ID NO. 3，特異性探針的核苷酸序列見序列表SEQN0. 4，在熒光探針的5’端標有熒光基因FAM，在熒光探針的3’端標有熒光淬滅基團TAMRA。本發明還公開了一種檢測肺癌是否發生骨轉移的熒光定量PCR試劑盒的使用方法，熒光定量 PCR 體系Hot-start Taq DNA 聚合酶(2. 5U/μ I) I μ l，Hot_startTaq DNA 聚合酶的10Xbuffer5 μ 1，dNTP混合物(每種IOmmoI/L) I μ 1，上游引物(10 μ mol/L)，下游 引物(10 μ mol/L) ,TaqMan 探針(5 μ mol/L)各 I μ 1，樣品 cDNA5 μ I 或標準質粒 DNA2 μ 1，加離子水至50 μ I。熒光定量PCR程序5°C IOmin預變性，接45個循環95°C 40s，60°C lmin。本發明還檢測了本試劑盒靈敏性，結果顯示本試劑盒檢測范圍為107-102COpieS/μ i，最小檢出濃度為IOOcopies/ μ I。通過對陽性樣品的檢測，發現本試劑盒檢測準確率達91 %。連續3次重復實驗，實驗結果穩定。


圖I小RNA長度在樣本A和B的分布。樣本A為肺癌未轉移病人的腫瘤細胞miRNA轉錄組數據，樣本B為肺癌骨轉移病人的腫瘤細胞的miRNA轉錄組數據。圖2各濃度下標準DNA模板的PCR擴增曲線。曲線從左到右依次為濃度為108、107U06U05U04U03U02個拷貝/ μ I的標準DNA模板的PCR擴增曲線。圖3標準DNA模板熒光定量PCR的標準曲線。圖4novel_mir_89在肺癌骨轉移病人和正常人中的表達量。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件。實施例I肺癌骨轉移前后腫瘤細胞microRNA表達的變化一材料和方法I、材料腫瘤細胞均來自于附屬醫院2004年-2010年因肺癌住院病例，分別取30例肺癌骨轉移病人的腫瘤細胞和30例肺癌未轉移病人的腫瘤細胞。2、方法2. I肺癌骨轉移前后腫瘤細胞總RNA的提取
按Trizol試劑盒說明書提取肺癌骨轉移病人和肺癌未轉移病人腫瘤細胞的RNA，通過凝膠電泳證明RNA的完整性，用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度。采用上海華舜生物工程有限公司總RNA抽提試劑盒子提取。主要操作步驟如下(I)用胞裂解液BL裂解組織細胞，離心取上層細胞。在上層細胞中加入Iml的Trizol，用帶針頭的一次性注射器抽打裂解物10次。(2)靜置5分鐘后，加入200 μ I的氯仿，用力顛倒離心管混勻后，室溫靜置使之分層，12000g離心5分鐘，小心移取水相至I. 5ml的離心管中。(3)加入等體積的異丙醇，徹底混勻后，取出750 μ I移入吸附柱，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中，將剩余的全部將入吸附柱中，離心30秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一個收集管中。(4)加入500 μ L RP液，離心30秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集 管中。(5)將500 μ I的W3液，靜置I分鐘，離心15秒。(6)將吸附柱移入一個干凈的收集管中，加入500 μ I W3液，離心15秒。(7)倒掉收集管中的液體，再將吸附柱移入同一收集管中，離心I分鐘。(8)將吸附柱放入另一個干凈的I. 5ml的離心管中，在吸附膜中央加入50 μ I純水，室溫靜置I分鐘后，離心I分鐘。將RNA貯存于-70°c。(9)總RNA完整性鑒定取2 μ I RNA樣品在I. 5%瓊脂糖凝膠電泳(80v，15min)，分出區帶后，EB染色，紫外燈下觀察電泳區帶。(10)用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度2. 2、肺癌骨轉移前后腫瘤細胞miRNA轉錄組文庫的構建及測序利用QIAGEN公司的RNeasy MinElute Cleanup Kit從上述得到的總RNA中純化miRNA,具體步驟見說明書。利用Single-end library建庫方法,共得到兩個肺癌骨轉移前后腫瘤細胞miRNA轉錄組文庫。將上述miRNA轉錄組文庫進行高通量測序，對高通量測序序列過濾,去除低質量序列，使用S0AP2方法跟人類基因組進行比對。2. 3、生物信息學分析生物信息學分析流程Illumina測序所得50nt序列，通過去接頭、去低質量、去污染等過程完成數據處理得到干凈序列，對其進行序列長度分布的統計及樣品間公共序列統計。將清理后的干凈序列分類注釋，可以獲得樣品中包含的各組分及表達量信息。將所有小RNA片段注釋后，用預測軟件Mireap對未得到注釋片段進行新的miRNA預測。具體生物信息學內容如下數據處理對原始數據進行去除接頭、污染序列及低質量reads的處理，并統計sRNA的長度分布，標準信息分析(I)分析樣品間的公共序列及特有序列；(2)探索sRNA在選定的參考基因組上的分布；(3)通過與Rfam(9. I)數據庫以及Genbank的比對,鑒定rRNA、tRNA、snRNA等非編碼RNA ；(4)通過與miRNA數據庫(miRBasel6. O)中指定范圍的miRNA進行比對,鑒定樣品中的已知miRNA ；(5)分析已知miRNA的表達模式；(6)通過與重復序列的比對，鑒定與重復序列相關的sRNA ；(7)通過與外顯子、內含子的比對鑒定mRNA降解片段；(8)按照優先級對sRNA進行分類注釋；(9)利用Mireap對沒有注釋的sRNA進行預測預測新的miRNA,繪制新的miRNA 的二級結構圖；(10)參照Audic S.等人發表在Genome Research上的基于測序的差異基因檢測方法，分析了肺癌骨轉移前后病人的腫瘤細胞miRNA的差異表達。二結果通過使用Illumina Solexa Hiseq2000,利用 Single-end library 建庫方法,共得到兩個miRNA轉錄組數據，分別為A和B，A為肺癌未轉移病人的腫瘤細胞miRNA轉錄組數據，B為肺癌骨轉移病人的腫瘤細胞的miRNA轉錄組數據。I. small RNA測序結果概述對這些初步的35nt左右的原始reads做去接頭,去低質量reads,去污染等處理，得到高質量的測序reads，其中A有25 100 000個reads，B有24 600 000個reads，后續分析均以此為基礎。首先對小RNA做長度分布統計，一般來說，miRNA集中在21或22nt，siRNA集中在24nt，piRNA集中在30nt。2個樣本的small RNA均在22nt位置呈現出明顯的單峰結構(如圖I)，說明其大多數為miRNA。A組中20— 24nt的sRNAs占細胞總sRNA的51. 61 %，B組中20—24nt的sRNAs占細胞總sRNA的52. 28%。樣品中reads做分類注釋，得到2個樣本中各種小RNA的比例(如圖2)。可以看到miRNA的含量最高，其次是未注釋的RNA(unarm)，其可能為siRNA和未發現的miRNA。2.新miRNA候選基因的預測將clean reads序列做分類注釋，我們獲得樣品中各類小RNA的表達信息，其包括miRNAs, rRNA, tRNA, scRNA, snRNA, snoRNA,重復序列相關小 RNA，mRNA 相關 RNA 和未注釋的小RNA。除表達量最高的miRNAs之外，其次就是未注釋的小RNA。對新miRNA的生物信息學預測，是基于已知的miRNA加工成熟中的特點來實現的，長度為18-25nt，其對應前體的位置能夠形成發夾樣結構，我們是利用miRNA預測軟件Mireap (https: //sourceforge. net/pro jects/mireap/)進行的，預測 miRNA 主要是根據miRNA的特殊結構1、候選發夾狀結構的上游高度保守的模序的存在；2、sRNA必須在遠離發夾結構環，位于發夾結構兩臂上；3、酶切位點的保守性，一般的miRNA酶切位點不會偏移超過3個堿基；4、發夾前體要有較低的折疊自由能能量。分析發現了一些新的miRNA候選基因，共107條，其中在骨轉移前88條，骨轉移后76條。3.肺癌骨轉移前后病人的腫瘤細胞miRNA的差異表達分析為了分析肺癌骨轉移前后病人miRNA的差異表達，先將A、B兩個miRNA轉錄組的各個miRNAs標準化，某miRNA標準化表達=某miRNA實際數量X 1000000/轉錄組中reads的總數。如果某個miRNA在兩個轉錄組中的標準化reads之和小于1，則被剔除不再分析，如果某個miRNA在其中一個轉錄組中的表達值為O則其標準表達值為O. 01。倍數變化(fold-change)計算為Log2 (實驗組/對照組)。用下面方法計算P值

倍數變化值大于I則認為miRNA表達上調，倍數變化值小于_1則認為miRNA表達下調，特別是當P值小于O. 05時，具體結果見表I :表I肺癌骨轉移前后病人的腫瘤細胞miRNA的差異表達
權利要求
1.一種miRNA novel_mir_89的特異性引物及特異性探針,其特征在于,所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4。
2.一種檢測肺癌骨轉移的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求I所述的特異性引物和特異性探針。
3.根據權利要求2所述的一種檢測肺癌骨轉移的熒光定量PCR試劑盒，還包括標準DNA 模板、Hot-start Taq DNA 聚合酶,其濃度為 2. 5U/μ I, Hot-start TaqDNA 聚合酶的IOXbuffer, dNTP 混合物，每種 NTP 濃度為 10mmol/L。
4.權利要求I的引物和探針在制備檢測肺癌骨轉移試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測肺癌骨轉移熒光定量PCR的試劑盒。該試劑盒包括以下成分特異性引物、特異性探針、標準DNA模板、熒光定量PCR反應液。本發明還公開了一種檢測肺癌骨轉移熒光定量PCR試劑盒的使用方法。利用該試劑盒可以快速定量檢測novel_mir_89的表達量，從而檢測肺癌骨轉移的發生情況。本發明操作簡便、快速、結果穩定、靈敏度高且特異性強。
文檔編號C12N15/11GK102876789SQ201210347230
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者楊祚璋, 謝琳, 徐磊, 李國奇 申請人:楊祚璋