專利名稱：檢測肺癌腫瘤細胞rna變化的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及小RNA檢測試劑盒的制備及使用方法，具體而言，本發明涉及以新發現小RNA前體的核苷酸序列為基礎，設計特異的寡聚核苷酸引物和熒光標記探針，采用實時熒光定量PCR技術組裝肺癌骨轉移的檢測試劑盒，本發明也涉及其檢測方法。
背景技術：
肺癌是當今世界上腫瘤患者死亡的首位病種，且其發病率和死亡率呈上升趨勢，嚴重威脅著人類健康和生命。2000年全世界肺癌新發病例120萬，死亡110萬。造成肺癌高病死率的主要原因是早期肺癌因無癥狀而發現困難，當出現癥狀就診時，大多已經比較嚴重或已肺外轉移，到了臨床不可治愈的階段。肺癌易發生骨轉移，有研究表明肺癌骨轉移發生率為 22%-81. 8%。(Lack E, Dickgreber N, Muller T, et a I. Randomized PhaseIII study of Gemcitabine and Vinorelbine versus Gemcitabine， Vinorelbine， and Cisplatin in the treatment of Advanced Non-Small-Cell lung cancer From theGerman and Swiss Lung Cancer Smdy Group[J]. Journal of clinical Oncology，2004，22(12) :2348-2356)骨轉移的常見臨床癥狀包括程度不等的疼痛、病理性骨折、脊髓受壓以及危及生命的高I丐血癥等，統稱骨相關事件(Skeletal related events, SREs)。骨轉移瘤所引起的疼痛等癥狀往往成為肺癌患者的最大痛苦，對患者造成嚴重的心理影響，是臨床上降低肺癌患者生活質量和影響患者生存的重要因素。腫瘤的浸潤和轉移是決定腫瘤患者預后的一個關鍵因素。大部分患者并不是死于原發部位的腫瘤，而是死于腫瘤其它部位的擴散轉移。所謂腫瘤的轉移，是指腫瘤細胞從原發腫瘤部位脫離，遷徙到其他位點，不斷生長，最終發展為轉移性腫瘤。人們很早就發現，腫瘤的轉移不是隨機性的，而是有選擇性，具有嗜器官性的。腫瘤骨轉移，是腫瘤轉移研究中最早觀察到的現象之一。骨骼的主要組成是礦物質成分，其微環境對腫瘤細胞而言可謂嚴酷，但乳腺癌、前列腺癌、肺癌卻極易發生骨轉移，這暗示能夠轉移至骨的腫瘤細胞具有改造局部微環境的特性。腫瘤骨轉移過程涉及一系列復雜的分子事件，是多步驟、多因素、多基因共同參與的復雜過程，腫瘤細胞首先從原發灶中分離，通過侵襲透過腫瘤新生血管進入全身循環系統，在其中絕大多數癌細胞由于宿主免疫反應和血流物理壓力而滅亡，只有極少量癌細胞可以存活，進入骨髓腔的竇狀小管，而后穿過竇狀小管的壁，侵襲骨髓基質，癌細胞與局部骨組織微環境發生一系列復雜的相互作用，導致癌細胞增殖分化，局部骨質破壞，形成骨轉移灶。肺癌骨轉移絕大多數為溶骨性轉移，最初人們認為腫瘤骨轉移引起溶骨性骨質破壞是腫瘤細胞直接作用引起的，然而研究證實到達局部骨組織的腫瘤細胞，并不能直接破壞骨組織，而是通過分泌多種細胞因子，包括甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)、IL-U IL-6、前列腺素E2等，直接或間接的作用于骨組織中破骨細胞，激活破骨細胞引起局部骨吸收作用異常活躍，使局部出現溶骨性的骨質破壞，為腫瘤細胞的“定居”和擴展提供了空間。同時骨基質中富含有多種生長因子，包括轉化生長因子(TGF-β)、纖維母細胞生長因子(FGF)、胰島素生長因子(IGF)、血小板源性生長因子(TOGF)和骨形態發生蛋白(BMP)等。溶骨性骨破壞的過程中，大量生長因子獲得釋放并被激活，刺激腫瘤細胞分裂增殖，同時增多的腫瘤細胞進一步刺激破骨細胞分化，骨質破壞進一步加重，這樣就形成了一個惡性循環，從而導致溶骨性轉移灶的形成。microRNA(miRNA)是天然存在、長約22個核苷酸的非編碼RNA，它們介導了轉錄后的基因調控。miRNAs在許多生物過程中扮演了重要角色，包括分化和發育、細胞信號通路以及對感染的反應。miRNAs表現出一種轉錄后調控基因表達的全新機制，它通過結合靶基因的mRNA的3’ UTR抑制基因的表達。miRNAs已經被證實在發育、感染、免疫應答、炎癥反應和腫瘤的發生等多種生理與病理過程中發揮作用。從最初發現到現在，已經在哺乳動物中發現了 700多個miRNAs，其中絕大部分miRNAs的生物學功能是未知的。已有報道，miRNAs參與免疫應答中多方面的調控作用。研究還發現血清和血漿中可以檢測到循環miRNAs，且它們的表達因疾病而異，這一發現說明循環miRNAs的表達特征可作為疾病診斷和預防的 生物標志物，具有巨大潛力。而缺乏特異的、高敏感度的分子標志物是目前制約肺癌骨轉移早期診斷以及有效治療的關鍵問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測小RNA表達水平的熒光定量PCR試劑盒及使用方法，該PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈敏度高，定量快速準確、穩定性好，具有良好的應用前景。本發明的另一目的是在于提供一種熒光定量PCR試劑盒對肺癌是否發生骨轉移進行快速的檢測。為了實現上述目的，本發明首先分別提取了肺癌發生骨轉移患者腫瘤細胞和肺癌未發生骨轉移患者腫瘤細胞的總RNA,并從中純化miRNA,利用Single-end library建庫方法，共得到兩個肺癌骨轉移前后腫瘤細胞miRNA轉錄組文庫。對所得的miRNA轉錄組文庫進行高通量測序，對高通量測序序列過濾，去除低質量序列，使用S0AP2方法跟人類基因組進行比對。并對測序結果進行分析，其中通過fold-change方法，對不同樣本的表達差異基因進行了比較，得到了表達差異顯著的miRNA_novel_mir_30，其序列見序列表SEQ NO. 5。本發明根據nOVel_mir_30的序列信息，設計了四條引物，第一條為莖環狀結構的反轉錄引物RT30，其序列見序列表SEQ NO. I ;第二條是上游的特異引物F30，其序列見序列表SEQ NO. 2 ;第三條為下游的通用引物R30，其序列見序列表SEQ NO. 3 ;第四條是在熒光定量PCR中需要的熒光探針引物Flu30，其序列見序列表SEQ NO. 4，在熒光探針Flu30的5’端標有熒光基因FAM，在熒光探針Flu30的3’端標有熒光淬滅基團TAMRA。本發明還制備了含有noVel_mir_30序列的標準DNA模板。制備步驟方法如下提取肺癌未發生骨轉腫瘤細胞的總RNA，從中純化出miRNA，接著進行逆轉錄反應，反轉錄體系為:莖環狀結構的反轉錄引物RT30，SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ 1，miRNA4 μ 1，dNTP混合物(每種 2.5mmol/L)4y 1,0. lmol/LDTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆轉錄酶(200U/μ1)2μ1。反應條件為37°C水浴60分鐘，95°C水浴3分鐘。將逆轉錄反應得到的cDNA進行常規PCR擴增，PCR產物檢測后切膠回收并純化，將純化產物連接到PGM-T克隆載體上，隨后轉化到DH5a感受態細胞中。通過序列為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的特異性引物篩選陽性克隆。陽性克隆擴增后提取質粒DNA，質粒DNA采用NanoDropND-IOOO核酸定量儀定量(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)并做10倍系列稀釋作為標準品用于標準曲線的制備。本發明還制備了一種檢測novel_mir_30表達水平的突光定量PCR試劑盒,組分如下特異性引物、特異性探針、標準DNA模板、熒光定量PCR反應液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ IDN0.2，下游引物序列為SEQ ID NO. 3，特異性探針的核苷酸序列見序列表SEQN0. 4，在熒光探針的5’端標有熒光基因FAM，在熒光探針的3’端標有熒光淬滅基團TAMRA。本發明還公開了一種檢測肺癌是否發生骨轉移的熒光定量PCR試劑盒的使用方法，熒光定量 PCR體系Hot-start Taq DNA聚合酶(2. 5U/μ I) I μ l，Hot_start Taq DNA聚合酶的IOXbuffer 5 μ I, dNTP混合物(每種IOmmoI/L) I μ 1，上游引物(10 μ mol/L)，下游引物(10 μ mol/L) ,TaqMan 探針(5 μ mol/L)各 I μ 1，樣品 cDNA5 μ I 或標準質粒 DNA2 μ 1，加·離子水至50 μ I。熒光定量PCR程序5°C IOmin預變性，接45個循環95°C 40s，60°C lmin。本發明還檢測了本試劑盒靈敏性，結果顯示本試劑盒檢測范圍為107_102copies/μ I，最小檢出濃度為IOOcopies/ μ I。通過對陽性樣品的檢測，發現本試劑盒檢測準確率達96%。連續3次重復實驗，實驗結果穩定。


圖I小RNA長度在樣本A和B的分布。樣本A為肺癌未轉移病人的腫瘤細胞miRNA轉錄組數據，樣本B為肺癌骨轉移病人的腫瘤細胞的miRNA轉錄組數據。圖2各濃度下標準DNA模板的PCR擴增曲線。曲線從左到右依次為濃度為108、107U06U05U04U03U02個拷貝/ μ I的標準DNA模板的PCR擴增曲線。圖3標準DNA模板熒光定量PCR的標準曲線。圖4novel_mir_30在肺癌骨轉移病人和正常人中的表達量，其中在正常人中的表達量均值為2112個，在肺癌骨轉移病人中不表達。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件。實施例I肺癌骨轉移前后腫瘤細胞microRNA表達的變化一材料和方法I、材料腫瘤細胞均來自于云南腫瘤醫院2004年-2010年因肺癌住院病例，分別取30例肺癌骨轉移病人的腫瘤細胞和30例肺癌未轉移病人的腫瘤細胞。2、方法2. I肺癌骨轉移前后腫瘤細胞總RNA的提取
按Trizol試劑盒說明書提取肺癌骨轉移病人和肺癌未轉移病人腫瘤細胞的RNA，通過凝膠電泳證明RNA的完整性，用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度。采用上海華舜生物工程有限公司總RNA抽提試劑盒子提取。主要操作步驟如下(I)用胞裂解液BL裂解組織細胞，離心取上層細胞。在上層細胞中加入I ml的Trizol，用帶針頭的一次性注射器抽打裂解物10次。(2)靜置5分鐘后，加入200 μ I的氯仿，用力顛倒離心管混勻后，室溫靜置使之分層，12000g離心5分鐘，小心移取水相至I. 5ml的離心管中。(3)加入等體積的異丙醇，徹底混勻后，取出750 μ I移入吸附柱，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中，將剩余的全部將入吸附柱中，離心30秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一個收集管中。(4)加入500 μ L RP液，離心30秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集·管中。(5)將500 μ I的W3液，靜置I分鐘，離心15秒。(6)將吸附柱移入一個干凈的收集管中，加入500 μ I W3液，離心15秒。(7)倒掉收集管中的液體，再將吸附柱移入同一收集管中，離心I分鐘。(8)將吸附柱放入另一個干凈的I. 5ml的離心管中，在吸附膜中央加入50 μ I純水，室溫靜置I分鐘后，離心I分鐘。將RNA貯存于-70°c。(9)總RNA完整性鑒定取2 μ I RNA樣品在I. 5%瓊脂糖凝膠電泳(80v，15min)，分出區帶后，EB染色，紫外燈下觀察電泳區帶。(10)用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度2. 2、肺癌骨轉移前后腫瘤細胞miRNA轉錄組文庫的構建及測序利用QIAGEN公司的RNeasy MinElute Cleanup Kit從上述得到的總RNA純化miRNA,具體步驟見說明書。利用Single-end library建庫方法,共得到兩個肺癌骨轉移前后腫瘤細胞miRNA轉錄組文庫。將上述miRNA轉錄組文庫進行高通量測序，對高通量測序序列過濾,去除低質量序列，使用S0AP2方法跟人類基因組進行比對。2. 3、生物信息學分析生物信息學分析流程Illumina測序所得50nt序列，通過去接頭、去低質量、去污染等過程完成數據處理得到干凈序列，對其進行序列長度分布的統計及樣品間公共序列統計。將清理后的干凈序列分類注釋，可以獲得樣品中包含的各組分及表達量信息。將所有小RNA片段注釋后，用預測軟件Mireap對未得到注釋片段進行新的miRNA預測。具體生物信息學內容如下數據處理對原始數據進行去除接頭、污染序列及低質量reads的處理，并統計sRNA的長度分布，標準信息分析(I)分析樣品間的公共序列及特有序列；(2)探索sRNA在選定的參考基因組上的分布；(3)通過與Rfam(9. I)數據庫以及Genbank的比對,鑒定rRNA、tRNA、snRNA等非編碼RNA ；(4)通過與miRNA數據庫(miRBasel6. O)中指定范圍的miRNA進行比對,鑒定樣品中的已知miRNA ；(5)分析已知miRNA的表達模式；(6)通過與重復序列的比對，鑒定與重復序列相關的sRNA ；(7)通過與外顯子、內含子的比對鑒定mRNA降解片段；(8)按照優先級對sRNA進行分類注釋；(9)利用Mireap對沒有注釋的sRNA進行預測預測新的miRNA,繪制新的miRNA的二級結構圖；
(10)參照Audic S.等人發表在Genome Research上的基于測序的差異基因檢測方法，分析了肺癌骨轉移前后病人的腫瘤細胞miRNA的差異表達。二結果通過使用Illumina Solexa Hiseq2000,利用 Single-end library 建庫方法,共得到兩個miRNA轉錄組數據，分別為A和B，A為肺癌未轉移病人的腫瘤細胞miRNA轉錄組數據，B為肺癌骨轉移病人的腫瘤細胞的miRNA轉錄組數據。I. small RNA測序結果概述對這些初步的35nt左右的原始reads做去接頭,去低質量reads,去污染等處理，得到高質量的測序reads，其中A有25 100 000個reads，B有24 600 000個reads，后續分析均以此為基礎。首先對小RNA做長度分布統計，一般來說，miRNA集中在21或22nt，siRNA集中在24nt，piRNA集中在30nt。2個樣本的small RNA均在22nt位置呈現出明顯的單峰結構(如圖I)，說明其大多數為miRNA。A組中20— 24nt的sRNAs占細胞總sRNA的51. 61 %，B組中20—24nt的sRNAs占細胞總sRNA的52. 28%。樣品中reads做分類注釋，得到2個樣本中各種小RNA的比例(如圖2)。可以看到miRNA的含量最高，其次是未注釋的RNA(unarm)，其可能為siRNA和未發現的miRNA。2.新miRNA候選基因的預測將clean reads序列做分類注釋，我們獲得樣品中各類小RNA的表達信息，其包括miRNAs, rRNA, tRNA, scRNA, snRNA, snoRNA,重復序列相關小 RNA，mRNA 相關 RNA 和未注釋的小RNA。除表達量最高的miRNAs之外，其次就是未注釋的小RNA。對新miRNA的生物信息學預測，是基于已知的miRNA加工成熟中的特點來實現的，長度為18-25nt，其對應前體的位置能夠形成發夾樣結構，我們是利用miRNA預測軟件Mireap (https: //sourceforge. net/pro jects/mireap/)進行的，預測 miRNA 主要是根據miRNA的特殊結構1、候選發夾狀結構的上游高度保守的模序的存在；2、sRNA必須在遠離發夾結構環，位于發夾結構兩臂上；3、酶切位點的保守性，一般的miRNA酶切位點不會偏移超過3個堿基；4、發夾前體要有較低的折疊自由能能量。分析發現了一些新的miRNA候選基因，共107條，其中在骨轉移前88條，骨轉移后76條。3.肺癌骨轉移前后病人的腫瘤細胞miRNA的差異表達分析為了分析肺癌骨轉移前后病人miRNA的差異表達，先將A、B兩個miRNA轉錄組的各個miRNAs標準化，某miRNA標準化表達=某miRNA實際數量X 1000000/轉錄組中reads的總數。如果某個miRNA在兩個轉錄組中的標準化reads之和小于1，則被剔除不再分析，如果某個miRNA在其中一個轉錄組中的表達值為O則其標準表達值為O. 01。倍數變化(fold-change)計算為Log2 (實驗組/對照組)。用下面方法計算P值
權利要求
1.一種miRNA novel_mir_30的特異性引物及特異性探針,其特征在于,所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4。
2.一種檢測肺癌骨轉移的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求I所述的特異性引物和特異性探針。
3.根據權利要求2所述的一種檢測肺癌骨轉移的熒光定量PCR試劑盒，還包括標準DNA 模板、Hot-start Taq DNA 聚合酶,其濃度為 2. 5U/μ I, Hot-start TaqDNA 聚合酶的IOXbuffer, dNTP 混合物，每種 NTP 濃度為 10mmol/L。
4.權利要求I的引物和探針在制備檢測肺癌骨轉移試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了檢測肺癌腫瘤細胞RNA變化的試劑盒。該試劑盒包括以下成分特異性引物、特異性探針、標準DNA模板、熒光定量PCR反應液。本發明還公開了一種檢測肺癌骨轉移熒光定量PCR試劑盒的使用方法。利用該試劑盒可以快速定量檢測novel_mir_89的表達量，從而檢測肺癌骨轉移的發生情況。本發明操作簡便、快速、結果穩定、靈敏度高且特異性強。
文檔編號C12N15/11GK102899405SQ20121034724
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者楊祚璋, 謝琳, 徐磊, 李國奇 申請人:楊祚璋