一種激活促紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種激活促紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)的方法，為利用TALE技術(shù)在目的細(xì)胞中激活促紅細(xì)胞生成素基因的表達(dá)，包括以下步驟：1）在促紅細(xì)胞生成素基因啟動(dòng)子上游尋找TALE靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)特異性識(shí)別TALE靶點(diǎn)序列的，由TAL核酸識(shí)別單元組成的靶點(diǎn)識(shí)別模塊；2）靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列的構(gòu)建；3）通過(guò)酶切連接的方法，將步驟2）制備的所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列與骨架載體連接，獲得重組質(zhì)粒；4）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化目的細(xì)胞并培養(yǎng)。本發(fā)明利用TALE技術(shù)在自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中激活促紅細(xì)胞生成素基因的表達(dá)，為基因治療提供了新的細(xì)胞來(lái)源，并能在組織工程和細(xì)胞治療中發(fā)揮重要的作用。
【專利說(shuō)明】一種激活促紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種激活促紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)的方法。【背景技術(shù)】
[0002]TALE (Transcription activator-effectors)技術(shù)是一種薪新的分子生物學(xué)工具。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，來(lái)自植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)分泌的一種TALE蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有著恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。利用TALE的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任何DNA序列的模塊化蛋白，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的(LiT,Huang S, Jiang W Z,et al.TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TALeffectors and FokI DNAcleavage domain.Nucleic Acids Res.2011;39(I):359-372.)。
[0003]目前 TALE 技術(shù)主要有兩種應(yīng)用:l)TALEN(transcription activator-like (TAL)effector nucleases)的基因敲除；2) TALEA (transcription activator-like (TAL)effector activator)的轉(zhuǎn)錄激活。TALEA的轉(zhuǎn)錄激活是將識(shí)別特異DNA序列的TALE與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域VP64 (VP64Activation Domain)融合,可構(gòu)建成識(shí)別啟動(dòng)子上特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄激活因子TALEA，將TALEA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，表達(dá)的融合蛋白結(jié)合啟動(dòng)子附近的特異DNA序列，并通過(guò)VP64激活區(qū)域與PolII結(jié)合，激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高了內(nèi)源目標(biāo)基因的表達(dá)(Zhang F, Cong L, Lodato S, et al.Efficient construction ofsequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.NatBiotechnol.2011; 29⑵:149-153.)。目前，TALEA已經(jīng)成功運(yùn)用到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Miller等利用人工設(shè)計(jì)的TALEA在人HEK293細(xì)胞中能夠激活內(nèi)源性NTF3基因的轉(zhuǎn)錄并使其表達(dá)水平增加了 20 倍(Miller JC, Tan S, Qiao G, et al.A TALE nuclease architecture forefficient genome editing.Nat Biotechnol.2011; 29 (2): 143-148.)。因?yàn)?TALE 技術(shù)無(wú)基因、細(xì)胞、物種限制，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，毒性低、脫靶情況少等優(yōu)點(diǎn)，TALE技術(shù)在酵母、動(dòng)植物細(xì)胞的基因組定點(diǎn)修飾、遺傳疾病的基因療法及基因的功能研究等方面都有廣闊的應(yīng)用前
旦
o
[0004]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是骨髓中除造血干細(xì)胞以外的一類具有高度可塑性的細(xì)胞群體，是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞。在特定的誘導(dǎo)條件下具有向骨、軟骨、肌腱、心肌、神經(jīng)、脂肪等基質(zhì)細(xì)胞分化的能力(George J, Goldstein E, Abashidze A, etal.Erythropoietin promotes endothelial progenitor cell proliferative andadhesive properties in a PI3-kinase-dependent manner.Cardiovasc Res.2005 ；68
(2):299-306.)。由于骨髓間充值干細(xì)胞具有采集方便、易于在體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴(kuò)增以及免疫原性低等特性，被認(rèn)為在細(xì)胞治療、基因治療、組織工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)的許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證明，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞移植在心血管疾病中的治療效果顯著。但目前研究發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞在心肌微環(huán)境下發(fā)生凋亡可能是影響心功能改善效率的重要原因之一(Lange C，Schroeder J, Stute N，et al.High-potential humanmesenchymal stem cells.Stem Cells Dev.2005;14(I):70-80.)。[0005]促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EP0)是促進(jìn)紅細(xì)胞分化和生存的主要細(xì)胞因子，是細(xì)胞生長(zhǎng)因子超家族成員之一。有實(shí)驗(yàn)表明，心血管組織可以表達(dá)EP0，表明EPO可能起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，外源性EPO具有很好的治療心血管疾病的作用(Van derMeer P, Lipsic E, Henning RH, et al.Erythropoietin improves left ventricularfunction and coronary flow in an experimental model of ischemia-reperfusioninjury.Eur J Heart Fail.2004; 6 (7): 853)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，EPO 治療聯(lián)合 MSC 較單獨(dú)的MSC移植能進(jìn)一步改善缺血下肢功能恢復(fù)和組織重塑，這可能與體內(nèi)EPO增加，EPO能抑制MSC凋亡，促進(jìn)MSC分泌VEGF以及EPO本身血管生成能力有關(guān)(Zhang D, ZhangF, Zhang Y, and et al.Erythropoietin enhances the angiogenic potency ofautologous bone marrow stromal cells in a rat model of myocardial infarction.Cardiology.2007; 108 (4): 228-36.)。然而傳統(tǒng)的EPO注射易出現(xiàn)紅細(xì)胞增多，多次注射有導(dǎo)致純紅細(xì)胞再生障礙等不良反應(yīng)(Rossert J, Pure Red Cell Aplasia GlobalScientific Advisory Board (GSAB) ? Erythropoietin-1nduced, antibody-mediated purered cell aplasia.Eur J Clin Invest.2005;35:95-99.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種利用TALE技術(shù)在人自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)中激活EPO (促紅細(xì)胞生成素)基因表達(dá)的方法。本發(fā)明選用人EPO基因和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為靶基因和靶細(xì)胞，利用TALE技術(shù)在MSC細(xì)胞中激活EPO基因的表達(dá)，為基因治療提供新了一種新的細(xì)胞來(lái)源，并將在組織工程和細(xì)胞治療中發(fā)揮重要作用。
[0007]本發(fā)明首先公開(kāi)了一種激活促紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)的方法，為利用TALE技術(shù)在目的細(xì)胞中激活促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因的表達(dá)，包括以下步驟:
[0008]I)在促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因啟動(dòng)子上游尋找TALE靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)特異性識(shí)別TALE靶點(diǎn)序列的由TAL核酸識(shí)別單元組成的靶點(diǎn)識(shí)別模塊；
[0009]2)靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列的構(gòu)建:構(gòu)建編碼步驟I)所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的雙鏈DNA ；
[0010]3)通過(guò)酶切連接的方法，將步驟2)制備的所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列與骨架載體連接，獲得重組質(zhì)粒；
[0011]4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，及目的細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0012]較優(yōu)的，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列為EPO (促紅細(xì)胞生成素)基因啟動(dòng)子上游16~20個(gè)連續(xù)的堿基。
[0013]更優(yōu)的，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列為EPO基因啟動(dòng)子上游18個(gè)連續(xù)的堿基。
[0014]最優(yōu)的，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015]較優(yōu)的，步驟I)所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的TAL核酸識(shí)別單元組成為N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI。
[0016]更進(jìn)一步的，步驟I)所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的氨基酸組成如SEQ ID NO:21所示。
[0017]靶點(diǎn)識(shí)別模塊N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI 的氨基酸序列組成如SEQ ID N0:21所示。[0018]本發(fā)明的靶點(diǎn)識(shí)別模塊由N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識(shí)別單元組成。所述TAL核酸識(shí)別單元為重復(fù)的34個(gè)恒定氨基酸序列，其中12、13位點(diǎn)雙連氨基酸與A、T、G、C四種堿基有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，NN識(shí)別G，HD識(shí)別C。因此，本發(fā)明靶點(diǎn)識(shí)別模塊中的N1、NG、NN、HD不指代具體的氨基酸，而是代表特異性識(shí)別A、T、G、C四種堿基的TAL核酸識(shí)別單元；根據(jù)TALE靶點(diǎn)序列的堿基組成，獲得由對(duì)應(yīng)TAL核酸識(shí)別單元組成的靶點(diǎn)識(shí)別模塊。
[0019]通過(guò)TALE技術(shù)，能夠組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊蛋白(靶點(diǎn)識(shí)別模塊)，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的。
[0020]N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識(shí)別單元各自對(duì)應(yīng)一個(gè)能夠編碼該識(shí)別單元的單體，所述單體為雙鏈DNA。對(duì)照靶點(diǎn)識(shí)別模塊的組成，對(duì)編碼不同TAL核酸識(shí)別單元的單體進(jìn)行串聯(lián)組裝，即可獲得能夠編碼該靶點(diǎn)識(shí)別模塊的雙鏈DNA (靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列)。所述串聯(lián)組裝方式可以為在首尾相鄰的單體之間設(shè)有相同的粘性末端，具體可通過(guò)在單體序列內(nèi)TAL核酸識(shí)別單元編碼序列兩側(cè)插入對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，通過(guò)多步酶切、連接的方法獲得，或采用同序異尾限制性內(nèi)切酶一步酶切法獲得。
[0021]較優(yōu)的，步驟2)所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列的構(gòu)建步驟具體如下:
[0022]A.構(gòu)建單體庫(kù):所述單體庫(kù)包括分別針對(duì)N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識(shí)別單元的四個(gè)次庫(kù)，每一個(gè)次庫(kù)包括彼此分離設(shè)置的M個(gè)單體，并且M個(gè)單體按照第I位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫(kù)針對(duì)的TAL核酸識(shí)別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識(shí)別單元編碼序列左右兩側(cè)的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)；
[0023]B.按照所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的組成，由N端開(kāi)始向C端方向，從前述單體庫(kù)中依次選擇對(duì)應(yīng)的單體，通過(guò)酶切、連接的方法獲得靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列。
[0024]本發(fā)明的連接末端是位于TAL核酸識(shí)別單元編碼序列左右兩側(cè)的雙鏈DNA序列，連接末端含有酶切位點(diǎn)序列(包括限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列和/或限制性內(nèi)切酶剪切序列)，可以經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切獲得特定的粘性末端。當(dāng)某一單體下游的連接序列與另一單體的上游連接序列酶切后獲得互補(bǔ)粘性末端的時(shí)候，該兩個(gè)單體能夠連接并且連接順序是一定的，因此可以通過(guò)特定連接末端序列的設(shè)計(jì)，將多個(gè)單體按照特定順序進(jìn)行連接。
[0025]更優(yōu)的，步驟2)所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列的構(gòu)建步驟具體如下:
[0026]a按照所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的組成，將靶點(diǎn)識(shí)別模塊由N端開(kāi)始向C端方向，順次按照每n個(gè)TAL核酸識(shí)別單元一組的方式分組，構(gòu)成r.V/.__""!個(gè)次模塊；
[0027]b構(gòu)建單體庫(kù):所述單體庫(kù)包括分別針對(duì)N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識(shí)別單元的四個(gè)次庫(kù)，每一個(gè)次庫(kù)包括彼此分離設(shè)置的M個(gè)單體，并且M個(gè)單體按照第I位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫(kù)針對(duì)的TAL核酸識(shí)別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識(shí)別單元編碼序列左右兩側(cè)的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)；每一次庫(kù)中的M個(gè)單體從排序第I的單體開(kāi)始，順次以每n個(gè)單體作為一個(gè)分組，共獲得個(gè)分組，并且同一分組內(nèi)前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)，但與該分組內(nèi)其他單體連接序列酶切后的粘性末端是非互補(bǔ)的；四個(gè)次庫(kù)之間，排次相同的編碼不同TAL核酸識(shí)別單元的四種單體，其上游連接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游連接序列酶切后的粘性末端也彼此相同；
[0028]c按照所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的組成，由N端開(kāi)始向C端方向，從前述單體庫(kù)中依次選擇對(duì)應(yīng)的單體，按照每n個(gè)單體一組的方式連接，構(gòu)成LM/?」個(gè)編碼對(duì)應(yīng)次模塊的n聯(lián)單體，然后再將IMMj個(gè)n聯(lián)單體連接，或者將LM/?j個(gè)n聯(lián)單體與該靶點(diǎn)識(shí)別模塊組成所需要的其他單體連接，獲得靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列；其中，M為靶點(diǎn)識(shí)別模塊中TAL核酸識(shí)別單元的數(shù)目，n為整數(shù)，并且n的取值范圍為2~6。
[0029]本發(fā)明中H為向上取整的符號(hào)，所述『M?l為取比[M/n]大的最小整數(shù)。Li為向下取整的符號(hào)，所述為取比L.M/W小的最大整數(shù)。
[0030]本發(fā)明步驟a是指:由于靶點(diǎn)識(shí)別模塊由M個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，因此從靶點(diǎn)識(shí)別模塊N端的第一個(gè)TAL核酸識(shí)別單元開(kāi)始向靶點(diǎn)識(shí)別模塊的C端，按照每n個(gè)TAL核酸識(shí)別單元一組的方式，依次將靶點(diǎn)識(shí)別模塊分為個(gè)次模塊，『I為向上取整的符號(hào)，當(dāng)M/n能夠整除時(shí)，所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊分為I"M/?l個(gè)次模塊，并且每個(gè)次模塊內(nèi)含有n個(gè)TAL核酸識(shí)別單元；當(dāng)M/n不能整除時(shí)，所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊分為『M/h1個(gè)次模塊，前『Mwl-1個(gè)次模塊的每個(gè)次模塊內(nèi)含有n個(gè)TAL核酸識(shí)別單元，余下的第個(gè)次模塊內(nèi)包括
【權(quán)利要求】
1.一種激活促紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)的方法，其特征在于，為利用TALE技術(shù)在目的細(xì)胞中激活促紅細(xì)胞生成素基因的表達(dá)，包括以下步驟: 1)在促紅細(xì)胞生成素基因啟動(dòng)子上游尋找TALE靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)特異性識(shí)別TALE靶點(diǎn)序列的由TAL核酸識(shí)別單元組成的靶點(diǎn)識(shí)別模塊； 2)靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列的構(gòu)建:構(gòu)建編碼步驟I)所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的雙鏈DNA； 3)通過(guò)酶切連接的方法，將步驟2)制備的所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列與骨架載體連接，獲得重組質(zhì)粒； 4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，及目的細(xì)胞的培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列為促紅細(xì)胞生成素基因啟動(dòng)子上游16~20個(gè)連續(xù)的堿基。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述TALE靶點(diǎn)序列如SEQID NO:2所示。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的TAL核酸識(shí)別單元組成為 N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的氨基酸組成如SEQIDNO:21所示。
6.如權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，步驟2)所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列的構(gòu)建步驟具體如下: A.構(gòu)建單體庫(kù):所述單體庫(kù)包括分別針對(duì)N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識(shí)別單元的四個(gè)次庫(kù)，每一個(gè)次庫(kù)包括彼此分離設(shè)置的M個(gè)單體，并且M個(gè)單體按照第I位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫(kù)針對(duì)的TAL核酸識(shí)別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識(shí)別單元編碼序列左右兩側(cè)的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)； B.按照所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的組成，由N端開(kāi)始向C端方向，從前述單體庫(kù)中依次選擇對(duì)應(yīng)的單體，通過(guò)酶切、連接的方法獲得靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列的構(gòu)建步驟具體如下: a按照所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的組成，將靶點(diǎn)識(shí)別模塊由N端開(kāi)始向C端方向，順次按照每n個(gè)TAL核酸識(shí)別單元一組的方式分組，構(gòu)成「W///I個(gè)次模塊； b構(gòu)建單體庫(kù):所述單體庫(kù)包括分別針對(duì)N1、NG、NN、HD四種TAL核酸識(shí)別單元的四個(gè)次庫(kù)，每一個(gè)次庫(kù)包括彼此分離設(shè)置的M個(gè)單體，并且M個(gè)單體按照第I位至第M位的順序順次排列，所述單體為雙鏈DNA，其序列包括該單體所屬次庫(kù)針對(duì)的TAL核酸識(shí)別單元的編碼序列以及位于TAL核酸識(shí)別單元編碼序列左右兩側(cè)的酶切后粘性末端不同的連接序列，并且按照單體的排序，前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)；每一次庫(kù)中的M個(gè)單體從排序第I的單體開(kāi)始，順次以每n個(gè)單體作為一個(gè)分組，共獲得『射/￥1個(gè)分組，并且同一分組內(nèi)前一單體下游連接序列酶切后的粘性末端與后一單體上游連接序列酶切后的粘性末端互補(bǔ)，但與該分組內(nèi)其他單體連接序列酶切后的粘性末端是非互補(bǔ)的；四個(gè)次庫(kù)之間，排次相同的編碼不同TAL核酸識(shí)別單元的四種單體，其上游連接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游連接序列酶切后的粘性末端也彼此相同； C按照所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的組成，由N端開(kāi)始向C端方向，從前述單體庫(kù)中依次選擇對(duì)應(yīng)的單體，按照每n個(gè)單體一組的方式連接，構(gòu)成個(gè)編碼對(duì)應(yīng)次模塊的n聯(lián)單體，然后再將個(gè)n聯(lián)單體連接，或者將lM/〃』個(gè)n聯(lián)單體與該靶點(diǎn)識(shí)別模塊組成所需要的其他單體連接，獲得靶點(diǎn)識(shí)別模塊編碼序列；其中，M為靶點(diǎn)識(shí)別模塊中TAL核酸識(shí)別單元的數(shù)目，n為整數(shù),并且n的取值范圍為2~6。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分組內(nèi)n個(gè)單體順次排列，同一次庫(kù)的每一分組內(nèi)排次第2至第n-1的任一單體，與同一次庫(kù)的其他分組內(nèi)排次第2至第n-1的任一單體，排次相同的單體的序列完全相同。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分組內(nèi)，排次第I單體的上游連接序列的5’端外側(cè)與排次最后一位單體的下游連接序列的3’端外側(cè)還分別各設(shè)有一成環(huán)序列，同一分組內(nèi)的兩個(gè)成環(huán)序列酶切后，獲得互補(bǔ)的粘性末端。
10.如權(quán)利要求8或9任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述次庫(kù)中的單體是通過(guò)PCR的方法，從含有N1、NG、NN或HD任一 TAL核酸識(shí)別單元編碼序列的質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述靶點(diǎn)識(shí)別模塊的TAL核酸識(shí)別單元組成為 N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI，M 為 18，n 取 6，用于從含有N1、NG、NN或HD任一 TAL核酸識(shí)別單元編碼序列的質(zhì)粒中擴(kuò)增單體片段的PCR方法的引物序列為 SEQ ID NO:3、4;SEQ ID NO:5、6 ;SEQ ID NO:7、8 ;SEQ IDNO:9、10 ;SEQ IDNO:11U2 ；SEQ ID NO: 13,14 ；SEQ ID NO:15、4 ;SEQ ID NO: 13,16 ；SEQ ID N0:17、4;SEQID NO:13、18。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述骨架載體中含有轉(zhuǎn)錄因子VP64激活區(qū)域的編碼序列，所述重組質(zhì)粒為能編碼靶點(diǎn)識(shí)別模塊及VP64激活區(qū)域的融合蛋白的重組質(zhì)粒。`
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述目的細(xì)胞為人自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
14.一種高效表達(dá)促紅細(xì)胞生成素的人自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用權(quán)利要求1-12任一權(quán)利要求所述方法制備獲得。
15.權(quán)利要求14所述高效表達(dá)促紅細(xì)胞生成素的人自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在制備心血管疾病治療試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103667344SQ201210348223
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月18日
【發(fā)明者】朱向瑩, 許可, 翁仕強(qiáng), 曹躍瓊, 金楊晟 申請(qǐng)人:上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司