花生檸檬酸轉運蛋白AhFRDL1、其編碼基因及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種花生檸檬酸轉運蛋白AhFRDL1、其編碼基因及應用。所述花生檸檬酸轉運蛋白AhFRDL1具有如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由SEQ?ID?NO.2衍生的氨基酸序列。本發明首次公開了一個花生根系檸檬酸轉運蛋白，獲得了該基因cDNA全長；AhFRDL1基因可調控檸檬酸向木質部分泌，及木質部鐵向地上部運輸；為從植物分子育種角度獲得高鐵營養高品質農產品，從分子育種及基因工程技術角度培育耐鐵花生品種提供必要的基礎。
【專利說明】花生檸檬酸轉運蛋白AhFRDLK其編碼基因及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及花生檸檬酸轉運蛋白AhFRDLl、其編碼基因及應用。
【背景技術】
[0002]植物要維持正常的生長發育就必須不斷的從土壤中獲得多種營養元素，如大量元素N、P、K及微量元素鐵、錳、銅、鋅等。而鐵是包括植物在內的大部分有機體的必需營養元素之一。鐵在植物體中參與葉綠素的合成，參與植物體內的氧化還原反應和電子傳遞是植物細胞色素氧化酶、過氧化物酶等與呼吸有關的酶類的重要組成部分，具有催化功能，直接或間接參與植物體內的代謝過程(Imsande J, Touraine B.1994.N demand and theregulation of nitrate uptake.Plant Physiology.105:73-77)。雖然鐵在自然界中的豐度很高，但大多以生物有效性低的氧化態形式存在，特別是石灰性土壤上，石灰性土壤占世界土地面積的三分之一以上，高pH和高重碳酸鹽含量嚴重降低了土壤中鐵的有效性(Guerinot ML, Yi Y.1994.1ron:Nutritious, noxious and not readily available.PlantPhysiology.104:815-820;Schmidt ff.2003.1ron solutions:acquisition strategiesand signaling pathway in plants.Trends in Plant Science.8:188-193)。而在我國典型的北方石灰性土壤上缺鐵同樣是影響植物生長的一個主要限制因子。
[0003]土壤溶液中的有效鐵含量非常低無法滿足植物正常的生長發育需求，植物在長期的進化過程中形成了兩種不同的活化和吸收鐵的機制，1986年，德國著名科學家RiVmheld.和Marschner揭示了不同植物適應缺鐵脅迫的兩種反應機制:機理I植物和機理II植物。機理I植物包括雙子葉植物和非禾本科單子葉植物，機理II植物是禾本科單子葉植物(Romheld V，Marschner H.1986.Evidence for a specific uptake system for ironphytosiderophores in roots of grasses.Plant Physiology.80:175 - 180)。
[0004]機理I植物和機理II植物的缺鐵適應性變化包括生理變化和形態變化，形態學變化包括:根的伸長受阻，根尖膨大，側根和根毛形成增加，根表皮細胞壁向內褶皺，形成典型的轉移細胞等(Landsberg EC.1994.Transfer cell formation in sugar beet rootsinduced by latent Fe deficiency.Plant Soil.165:197-205)。生理變化包括植物H+-ATP酶向胞外釋放質子，使土壤的pH值降低，提高土壤中鐵的有效性。
[0005]對于機理I植物來說，主要通過兩步來完成對鐵的吸收:首先，質膜上的H+-ATP酶向根際釋放質子酸化根際，提高鐵的有效性。同時，根表皮質膜上的Fe3+還原酶將Fe3+還原為 Fe2+(Robinson NJ, Procter CM, Connolly EL, Guerinot ML.1999.A ferric-chelatereductase for iron uptake from soils.Nature.397:694-697)。然后，植物根系質膜上的鐵轉運蛋白IRT將Fe2+轉運到細胞內。每一個鐵吸收過程都有相對應的基因進行控制從而保證根系從土壤中充分吸收鐵。而機理II植物在缺鐵情況下分泌麥根酸鐵載體，麥根酸在根際將鐵溶解，再通過細胞質膜上的YSl轉運蛋白將麥根酸鐵轉運到根細胞內(Curie C,Panaviene Z,Loulergue C，Dellaporta SL, Briat JF, Walker EL.2001.Maizeyellow stripe lencodes a membrane protein directly involved in Fe (III)uptake.Nature.409:346 - 349)。
[0006]當鐵進入根系之后，還需要經過運輸作用，將其運往地上部加以利用，從而完成植物體對鐵的吸收與利用。木質部是長距離運輸通道之一，鐵在木質部中是以檸檬酸鐵的形式運輸。最早被鑒定的負責將檸檬酸向木質部分泌的基因是擬南芥AtFRD3(Durrett TP, Gassmann ff, Rogers EE.2007.The FRD3_mediated efflux of citrateinto the root vasculature is necessary for efficient iron translocation.Plant Physiology.144:197-205)，隨后在水稻中也發現了具有類似功能的基因OsFRDLl (Yokosho K, Yamaji N, Ueno D, Mitani N, Ma J F.2009.0sFRDLl is a citratetransporter required for efficient translocation of iron in rice.PlantPhysiology.149:297-305)。無論是擬南芥突變體frd3_l，還是敲除了 OsFRDLl的水稻轉基因植株，葉片都出現了明顯的缺鐵失綠黃化現象，同時在根中出現過量的鐵累積，結果表明AtFRD3、OsFRDLl是鐵通過木質部由地下部向地上部運輸不可或缺的基因。
[0007]花生是我國北方地區大量種植的主要的油料作物，但是由石灰性土壤引發的缺鐵現象已成為花生產量的主要限制因素之一(左元梅、劉永秀、張福鎖，玉米/花生混作改善花生鐵營養對花生根瘤碳氮代謝及固氮的影響，生態學報，2004,24(11) = 2584-2590 )。到目前為止，有關花生吸收鐵的報道有AhIRTl基因(Ding H, Duan L，Li J, Yan H, Zhao M, ZhangF，Li WX.Cloning and functional analysis of the peanut iron transporter AhIRTlduring iron deficiency stress and intercropping with maize.Journal ofPlantPhysiology.2010)，但是與木質部鐵運輸有關的花生基因還沒有任何報道。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種花生檸檬酸轉運蛋白AhFRDLl、其編碼基因，以用于提高花生木質部的鐵向地上部運輸。
[0009]本發明另一目的是提供含有上述基因的載體。
[0010]本發明又一目的是提供含有上述基因或載體的宿主細胞。
[0011]本發明再一目的是提供花生檸檬酸轉運蛋白AhFRDLl或其編碼基因在提高花生木質部的鐵向地上部運輸中的應用，及制備高鐵營養農產品中的應用。
[0012]本發明所述花生檸檬酸轉運蛋白AhFRDLl，具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0013]本發明所述花生檸檬酸轉運蛋白AhFRDLl基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，共有2034bp，包括5’ -端UTR，蛋白編碼區和3’ -UTR包含ployA尾巴，表明是完整的核苷酸編碼序列。通過DNAman基因分析軟件分析得到了 SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，該AhFRDLl蛋白由520個氨基酸組成。
[0014]應當理解，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響蛋白表達的條件下，對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。因此，本發明還包含對編碼上述蛋白的基因序列進行的替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達載體、含有所述載體的宿主細胞，利用所述宿主細胞制備花生根系檸檬酸轉運蛋白的方法等。
[0015]所述該序列經替換一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，是指該序列的活性功能域之外的位點進行有限氨基酸的保護替換所得的序列仍能保持原來的活性。
[0016]本發明通過一對引物擴增上述花生根系檸檬酸轉運蛋白編碼基因:
[0017]AhFRDLl-F: TGGTAGAGAAAATGGCTGAGAAG
[0018]AhFRDLl-R:AACATGATTGCATTCATCTCCAT
[0019]把AhFRDLl基因轉入到擬南芥frd3_l突變體中。正常營養液培養的條件下，相對于擬南芥frd3-l突變體，轉入AhFRDLl基因的擬南芥frd3_l突變體植株木質部檸檬酸和鐵的濃度顯著增加，根系鐵含量顯著降低，葉片葉綠素總量上升，新葉活性鐵含量顯著增加，老葉活性鐵含量降低。
[0020]本發明有益效果:
[0021 ] I)本發明首次公開了一種花生根系檸檬酸轉運蛋白，獲得了該基因cDNA全長，并分析得到了其編碼的蛋白序列；
[0022]2)本發明的AhFRDLl基因可調控檸檬酸向木質部分泌，并且參與木質部鐵向地上部運輸的過程；
[0023]3)本發明深入了植物鐵營養分子機制的研究，為從植物分子育種角度獲得高鐵營養高品質農產品奠定了基礎，為從分子育種及基因工程技術角度培育耐鐵花生品種提供必要的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為AhFRDLl基因與各物種同源基因之間的氨基酸序列相似性分析圖；
[0025]圖2為轉入AhFRDLl基因的擬南芥植株木質部汁液檸檬酸含量圖；
[0026]圖3為轉入AhFRDLl基因的擬南芥植株木質部汁液鐵含量圖；
[0027]圖4為轉入AhFRDLl基因的擬南芥植株根系總鐵含量圖；
[0028]圖5為轉入AhFRDLl基因的擬南芥植株新葉、老葉活性鐵含量圖；
[0029]圖6為轉入AhFRDLl基因的擬南芥植株葉片總葉綠素含量圖；
[0030]其中，WT代表野生型、FRD3代表突變體、53、54、63、64代表不同的轉基因株系。
【具體實施方式】
[0031]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0032]實施例1花生AhFRDLl基因的克隆
[0033](1)花生水培培養
[0034]將花生種子魯花14(購于中國農業科學院)用10%雙氧水消毒20-30分鐘，清洗干凈后置于飽和硫酸鈣溶液中約8小時，并通氣避光。之后置于鋪有吸水紙的托盤中，澆適量的水后避光置于人工培養室中。培養室設置條件為光照14小時30度，黑暗10小時22度。1-2天左右花生發出小芽后移入石英砂中培養，待長出1-2片葉子后轉入水培營養液中培養。水培營養液配方如下=KH2PO4 (0.5mM)、K2SO4 (0.75mM)、KCl (0.1mM)、MgSO4.7H20(0.65mM)、CaSO4.2H20(2mM) ,H3BO3Cl μ M),MnSO4.4H20(1 μ M)、ZnS04.7H20(1 μ M)、CuSO4.5H20 (0.1 μ M)、(NH4) 6Μο7024.4Η20 (0.005 μ Μ)、EDTA-Fe (80 μ Μ)，pH 值為 5.8-6。
[0035](2)花生RNA提取
[0036]把保存于-80°C的花生根系及葉片樣品放入用液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨植物樣品直至成粉末狀，取出約0.1g粉末樣品于1.5ml無RNase離心管中，加入ImlTrizol0渦旋震蕩15s，室溫靜置5min，加入200 μ I氯仿，充分混勻，靜置5min，4°C離心，12000rpm，15min，取上清液入1.5ml的離心管中，加入500 μ I異丙醇，混勻，室溫靜置lOmin，于4°C 12000rpm離心lOmin，取出后倒掉上清液，加入Iml 75%的乙醇，渦旋震蕩數秒，4°C 7500rpm離心5min，重復洗滌兩次，倒掉乙醇并吸去剩余上清液后，離心管于室溫下風干。加入適量的DEPC水和RNA酶抑制劑，放于_20°C或_80°C冰箱中貯存備用。[0037](3)基因全長克隆
[0038]通過抑制性差減雜交獲得了花生AhFRDLl基因片段，用已知的片段序列設計引物，以花生根系RNA為模板,用invitrogen公司Super Script II逆轉錄酶試劑盒，Oligo(dT)15為引物，42°C反應得到反轉錄cDNA模板。通過clonetech公司RACE試劑盒(SMARTRACE cDNA Amplification Kit)進行PCR反應，分別克隆測序得AhFRDLl基因5’及3’端，5’端克隆引物為:
[0039]AhFRDL 1-5， -GSP ATCCGTGGCGCGCAGCTAAAGACG
[0040]3’端克隆引物為:
[0041]AhFRDL 1-3’ -GSP GCAGCCATTGCCCATGTCATTTCTCA
[0042]然后拼接得到全長序列。
[0043]利用拼接的理論全長序列，設計擴增該基因全長的引物，分別為:
[0044]AhFRDLl-F: TGGTAGAGAAAATGGCTGAGAAG
[0045]AhFRDLl-R:AACATGATTGCATTCATCTCCAT
[0046]PCR反應體系為:將根系cDNA稀釋5倍后取2 μ 1，10X反應緩沖液2 μ 1，dNTP(10mM)0.5μ IjMgCl2 (50mM)0.5μ 1，正向引物 AhFRDLl-F (0.01mM)0.5μ 1，反向引物AhFRDLl-R (0.01mM) 0.5 μ I, ddH2013.7μ I，TaqDNA 聚合酶(invitrogen 公司)0.3 μ 1.將上述混合后進行PCR反應，程序為:94°C預變性3min ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸2min ；30個循環；72°C延伸IOmin0
[0047]PCR反應后瓊脂糖凝膠電泳得到預期約1.6kb的DNA條帶，進行膠回收純化，獲得DNA全長。然后將回收得到的DNA連接到pMD20-T載體(TaKaRa公司)，16°C過夜，轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞(TIANGEN公司)，涂于含Amp抗生素的LB板，37°C過夜培養，挑單克隆于LB液體37°C過夜搖菌，送菌液測序(上海生物工程公司)確定序列的正確性。對得到的cDNA進行分析，利用DNAman軟件翻譯得到蛋白序列。AhFRDLl基因序列如SEQ ID N0.1所示(2034bp)，對應氨基酸序列為SEQ ID N0.2。本發明基因與目前已經鑒定的各個物種中的同源基因之間的氨基酸序列相似性分析如圖1所示。
[0048]實施例2轉入AhFRDLl基因的擬南芥遺傳轉化
[0049](I)將實施例1中構建好的質粒轉入農桿菌GV3101感受態細胞中，劃板培養，挑取單克隆到培養基中，在恒溫振蕩培養器中28°C過夜培養。所述培養基為5ml的LB培養基(每升培養基中含IOg氯化鈉，IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，用NaOH調節pH值為7.0)中加入50mg/L Rif，25mg/L Gen, 50mg/L Kan ;將過夜培養的農桿菌接種到500ml的培養瓶中，加入50mg/L Rif,50g Sucrose, 500ul Silwet-L77, IL MQ water，28°C過夜培養約 12h ;取上述菌液離心，4000-6500rpm, 15_20min,棄去上清液,用轉化介質重懸沉淀至OD值達到
0.8左右備用。
[0050](2)用1%的瓊脂糖浸泡擬南芥frd3_l突變體種子(由美國康奈爾大學植物生理系 Leon Kochian 教授惠贈，參見 “Durret TP, Gassmann ff, Rogers EE.2007.TheFRD3_mediated efflux of citrate into the root vasculature is necessary forefficient iron translocation.Plant Physiology.144:197-205.，，)，裝盆，點種前燒水至飽和。在20-22°C的溫室，光照16h黑暗8h光照處理，2-3天澆一次水。第一個花序長到5-15cm,第二個花序剛出現時移苗到另一個盆中。
[0051]將擬南芥植株的花浸入含有農桿菌的培養基中lmin，保濕暗培養過夜。每天澆水，擬南芥正常生長。當種子成熟時，將種子收集到15ml或50ml的管子中。
[0052]種子滅菌:將種子放入50ml的滅菌管中，加入下列滅菌混合液:100 μ I TritonX-100, 3ml Bleach, 6.9ml MQ water,混合15min,短暫離心后將滅菌液倒出。用無菌水清洗種子4次。
[0053]篩選轉化子:將種子均勻的懸浮在1%的瓊脂糖中，將種子點到MS培養基上，點種后放置25-35min晾干培養基。培養基配方:4.3g/L MS salts，1%的蔗糖，5g/L MES8%phytagar,加瓊脂粉之前用IMNaOH調節pH值到5.7,高壓滅菌20min,冷卻后加入50mg/L Kan，在培養基凝固之前將培養基倒板。
[0054]培養基置于4°C的冰箱中`春化兩天后放在培養箱中黑暗培養；觀察擬南芥的生長是否受細菌的威脅，如果被污染將擬南芥移到另一個培養基中生長；擬南芥幼苗至少有一個真葉時，將其移到擬南芥培養室的小盆中，將根上的瓊脂糖沖洗掉，將根系埋在土中，黑暗培養，2-3天澆一次水；擬南芥長到一周后，用2μ 1/L的除草劑噴轉基因植株，每兩天噴一次，連續噴4-5次，約10-20%的植株能夠生存下來。
[0055]實施例3轉基因植株T3代種子的獲得
[0056]將T2代種子放入1.5ml滅菌管中，加入里面Iml滅菌水，放入4°C的冰箱中春化2天。將蛭石和營養滅菌，120°C，20min。將蛭石與營養土以1:1的比例混合均勻，裝盆，點種前燒水至飽和。
[0057]將春化后的種子點種，點種后用塑料薄膜覆蓋住盆子，放在擬南芥培養室中培養，室內溫度21_22°C，光照16h黑暗8h光照處理，光照植物出苗后，將塑料薄膜揭開，適當澆水。
[0058]擬南芥長到4-6片葉子時噴100mg/L的除草劑，每隔兩天噴一次連續噴三次，部分擬南芥死亡。擬南芥成熟時,收種子。
[0059]實施例4花生AhFRDLl基因生物學功能的驗證
[0060]將T3代種子放入1.5ml離心管中，加入Iml滅菌水。將離心管放入4°C冰箱春化至少48h。配制母液(營養液配方見表1 )，使用時將其稀釋1000倍，NaOH調節pH值在5.8-6.0之間。盆中裝入適量營養液使點種板剛好漂浮起來，點種子。三天換一次營養液。
[0061]點完種子后，放在擬南介培養室中黑暗培養72h。再培養5天后間苗留一棵。以后每3天換一次營養液，等擬南芥長即將抽薹的時候，收集擬南芥木質部汁液，取樣測定。
[0062]表1擬南芥營養液配方
【權利要求】
1.一種花生檸檬酸轉運蛋白，其特征在于，具有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID N0.2衍生的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述花生檸檬酸轉運蛋白的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求2或3所述基因或權利要求4所載體的宿主細胞。
6.權利要求1所述花生檸檬酸轉運蛋白、權利要求2或3所述基因在提高植物木質部鐵向地上部運輸中的應用。
7.權利要求1所述花生檸檬酸轉運蛋白、權利要求2或3所述基因在制備高鐵營養農產品中的應用。
【文檔編號】C12N5/10GK103665123SQ201210348268
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月18日 優先權日:2012年9月18日
【發明者】左元梅, 邱巍, 郭笑彤, 李輝, 熊宏春 申請人:中國農業大學