專利名稱：定性檢測kras基因分型的測序引物對及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及體外核酸檢測領域，采用PCR結合焦磷酸測序技術，用于檢測患者組織DNA中KRAS基因型，具體涉及一種定性檢測KRAS基因分型的測序引物對及其試劑盒。
背景技術：
RAS基因家族與人類 腫瘤相關的基因有三種——HRASjKRAS和NRAS，其中KRAS對人類癌癥影響最大，它好像分子開關當正常時能控制調控細胞生長的路徑；異常時該基因永久活化，導致細胞持續生長，并阻止細胞自我毀滅，使細胞增殖失控而癌變(見圖I )。據統計，KRAS突變型結直腸癌患者約占30-40%，在肺癌患者中突變率約占20-30%。NCCN專家組認為，KRAS突變是結直腸癌形成過程中的早期事件，并且原發灶和轉移灶的KRAS基因高度保持一致，可用于早期診斷和復發的及時監測。檢測KRAS基因突變是深入了解癌基因的情況、了解結直腸癌等惡性腫瘤的發展預后、評估放化療療效的重要指標為結直腸癌等惡性腫瘤的早期診斷提供依據科學研究發現，人體內從單個細胞開始到形成米粒大小的腫瘤，需要8 10年，在此階段人體幾乎沒有任何癥狀；從米粒大小的腫瘤發展成杏仁大小的腫瘤，只需I年左右；如果沒有及時發現，杏仁大小的腫瘤發展到晚期只需要2 6個月。近幾年西妥昔單抗、帕尼單抗等靶向藥物(表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑)聯合化療的應用為廣大結直腸癌患者帶來福音。KRAS基因檢測已被寫入最新版《美國國立癌癥綜合網絡(NCCN)結直腸癌臨床實踐指南》。新指南傳遞出了兩條重要的信息一是所有轉移性結直腸癌患者都應檢測KRAS基因狀態；二是只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗和帕尼單抗治療(見圖I)。另外，《09年NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》明確指出當KRAS基因發生了突變，則不建議病人使用特羅凱進行分子靶向治療。為癌癥患者的預后提供指導。例如Ryan et al (2003)發表在頂尖雜志⑶T(IF>10)的文章指出，術后血清KRAS基因突變檢測對于腫瘤的預后具有重要作用術后血清KRAS基因突變檢測陽性者復發率高達63%，而術后血清KRAS基因突變檢測陰性者的復發率僅為2%。a. EGFR被TGF a、EGF等配體激活后啟動細胞內信號傳導，維持細胞存活，促進細胞增殖、轉移，在存在血管內皮生長因子(VEGF)的條件下還可促進新生血管生成。b.腫瘤的靶向治療藥物如抗EGFR單抗(西妥昔單抗、帕尼單抗等)通過阻斷EGFR二聚體的形成，抑制其下游的細胞內信號傳導，從而抑制腫瘤細胞的存活、增殖、轉移以及新生血管生成。c. KRAS基因突變可旁路激活細胞內信號傳導，從而導致抗EGFR單抗喪失抗癌活性。目前醫院用于KRAS基因檢測的“金標準”是PCR-直接測序法，但直接測序法的敏感性不高，只能檢測出突變細胞比率在10-20%以上的腫瘤組織，對于含〈10%突變細胞的腫瘤組織以及外周血，常規PCR+直接測序法幾乎無能為力。相比于直接測序法，焦磷酸測序的靈敏性更高、成本更低。焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序(確定DNA中核苷酸的順序)方法，是新一代DNA序列分析技術。它是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。通過分析出峰情況，達到測定DNA序列的目的。目前市場上還沒有利用焦磷酸技術進行KRAS的基因多態性檢測的產品。

發明內容
本發明的目的是提供一種特異性高、成本低、定量、準確檢測KRAS的基因突變的測序引物對及其試劑盒。·為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案一種檢測KRAS基因分型的測序引物對，所述引物對為如下引物KRAS1213 正向擴增引物5' -TATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3' (SEQ ID NO. I)；KRAS1213 反向擴增引物5' -TATTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3' (SEQ ID NO. 2)KRAS1213 測序引物5' -GCACTCTTGCCTACG-3' (SEQ ID N0:3)KRAS6I 正向擴增引物5' -AATTGATGGAGAAACCTGTCTCTT-3; (SEQID NO. 4)KRAS61 反向擴增引物5' -TCCTCATGTACTGGTCCCTCATT-3' (SEQID NO. 5)KRAS61 測序引物5' -CTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID NO. 6)其中，KRAS1213正向擴增引物(SEQ ID NO. I)和 KRAS61 (SEQ ID NO. 5)反向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。一種定性檢測KRAS基因分型的測序試劑盒，所述試劑盒包括含有SEQ IDN0. 2所示反向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向擴增引物的PCR反應液2，SEQID NO. I所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端進行生物素標記。進一步地，所述試劑盒中還包括質控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作為空白對照品的超純水；質控序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。進一步地，所述試劑盒還包括KRAS1213陽性對照品1，KRAS1213陽性對照品2，；KRAS61陽性對照品1，KRAS61陽性對照品2 ；所述KRAS1213陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的KRAS1213野生純合子質粒；所述KRAS1213陽性對照品2為所述KRAS1213野生純合子質粒與插有SEQID NO. 9所示核苷酸序列的KRAS1213突變純合子質粒組成的質粒混合物；所述KRAS61陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的KRAS61野生純合子質粒；KRAS61陽性對照品2為所述KRAS61野生純合子質粒與插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的KRAS61突變純合子質粒組成的質粒混合物；其中，質粒載體為pMD18-T質粒；所述KRAS1213質粒混合物中KRAS1213突變純合子質粒和所述KRAS1213野生純合子質粒的數量比為1:1 ;所述KRAS61質粒混合物中KRAS61突變純合子質粒和所述KRAS61野生純合子質粒的數量比為1:1。所述的PCR反應液I和PCR反應液2中其他組分為常規的IOx PCR Buffer^dNTPs和H2O,各組分按常規體積比配置(10x PCR Buffer、dNTPs、H20和反應液中引物的體積比為5:3:37. 5:1)。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本發明的優點及有益效果
I)本發明提供的定量檢測KRAS基因突變的焦磷酸測序試劑盒定性準確，具有靈敏性高、特異性強的優點，樣品處理簡單，測序速度快，高通量，半個小時完成一次上機反應，直接給出檢測位點頻率分析，結果直觀。2)本發明提供的定量檢測KRAS基因突變多態性的焦磷酸測序試劑盒靈敏度和特異性高；3)本發明提供的定量檢測KRAS基因突變多態性的焦磷酸測序試劑盒檢測速度快；4)本發明提供的定量檢測KRAS基因突變多態性的焦磷酸測序試劑盒步驟簡單；5)本發明提供的定量檢測KRAS基因突變多態性的焦磷酸測序試劑盒可同時進行高通量的樣本檢測。6 )本發明的試劑盒中設置了空白對照、陽性對照和陽性對照，能更好的確保檢測結果的準確性。由于設計了靈敏度高，特異性好的引物，并且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒能夠對KRAS基因分型進行快速檢測。本發明的試劑盒可實時監測反應進程，反應時間短，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，高通量，比金標準一一毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。


圖I抗EGFR單抗作用機制及KRAS基因突變效應示意圖；圖2為臨床KRAS密碼子1213野生型的焦磷酸測序圖；圖3為臨床KRAS密碼子1213突變型的焦磷酸測序圖；圖4為臨床KRAS密碼子61野生型的焦磷酸測序圖；圖5為臨床KRAS密碼子61突變型的焦磷酸測序圖；圖6為臨床質控品control oligo的焦磷酸測序圖；圖7為臨床空白對照的焦磷酸測序圖；圖8至圖11為多組設計引物的焦磷酸測序圖；其中圖8、圖9、圖10的測序結果均不準確，只有圖11的測序結果真實可靠。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。實施例I :試劑盒的制備I.引物和探針的設計與合成研究表明目前針對KRAS基因突變主要集中在2號外顯子的12、13號密碼子和3號外顯子的61號密碼子中，選擇特異的突變位點，使用PyroMark Assay Design2. O軟件，設計引物；其中擴增引物和測序引物先經過PAGE純化，再經HPLC純化，其中SEQ ID NO: I和SEQ ID NO. 5的5，為生物素標記。
突變位點與類型表I:
MutationBase change
Glyl2AlaGGT>GCT
Glyl2AspGGT>GAT
Glyl2ArgGGT>CGT
Glyl2CysGGTXTGT
Glyl2SerGGT>AGT
Glyl2ValGGT>GTT
Glyl3AspGGOGAC
Gln61ArgCAA>CGA擴增序列如表2 表2.特異性擴增引物與測序引物序列
權利要求
1.一種定性檢測KRAS基因分型的測序引物對，其特征在于，所述引物對為SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 5所示引物的5’端進行生物素標記。
2.一種定性檢測KRAS基因分型的測序試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括含有SEQID NO. 2所示反向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向擴增引物的PCR反應液2，SEQ ID NO. I所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端進行生物素標記。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括SEQID NO. 7所示的質控品和空白對照品。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述空白對照品為水。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括KRAS1213陽性對照品1，KRAS1213陽性對照品2，；KRAS61陽性對照品1，KRAS61陽性對照品2 ； 所述KRAS1213陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的KRAS1213野生純合子質粒；所述KRAS1213陽性對照品2為所述KRAS1213野生純合子質粒與插有SEQ IDNO. 9所示核苷酸序列的KRAS1213突變純合子質粒組成的質粒混合物； 所述KRAS61陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的KRAS61野生純合子質粒；KRAS61陽性對照品2為所述KRAS61野生純合子質粒與插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的KRAS61突變純合子質粒組成的質粒混合物； 其中，質粒載體為PMD18-T質粒。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述KRAS1213質粒混合物中KRAS1213突變純合子質粒和所述KRAS1213野生純合子質粒的數量比為1:1。
7.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述KRAS61質粒混合物中KRAS61突變純合子質粒和所述KRAS61野生純合子質粒的數量比為1:1。
全文摘要
本發明提供一種檢測KRAS基因第2外顯子密碼子12、13和第3外顯子密碼子61突變的測序引物對及其試劑盒，屬于體外核酸檢測領域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR擴增引物以及測序引物；本發明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。
文檔編號C12N15/11GK102899408SQ201210349330
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者肖芳 申請人:長沙三濟生物科技有限公司