專利名稱：一種微擬球藻突變株及其重離子誘變選育方法
技術領域：
本發明涉及微生物工程領域，具體的說是一種微擬球藻突變株及其重離子誘變選育方法。
背景技術：
能源是人類社會賴以生存和發展的物質基礎，高效、清潔的能源利用是實現經濟可持續發展的重要保證。隨著常規不可再生化石資源的不斷減少、日益顯著的全球氣候變暖，使得能源、資源與環境成為人類社會可持續發展所面臨的重要問題。生物質能源，包括生物柴油、生物乙醇等，由于其具有可再生性和環境友好等特點，被認為是解決能源危機的最有潛力的途徑之一。
微藻由于具有生物質積累速度快、環境適應性強、含油量高、具有綜合利用價值等特性，被認為是最有潛力的生物質能源原料。以微藻生產生物柴油為例，專家做了一個保守的估計，與每公頃高產油植物(如油棕櫚、麻瘋樹)每年可以產生1800-6000升油脂相比，每公頃微藻每年可以產生5萬-13萬升油脂。微藻用于生產生物燃料的優勢明顯，但目前進行產業化生產還面臨著巨大挑戰，微藻生物燃料生產成本依然較高。降低微藻生物燃料生產成本主要集中在兩個方面一是降低生產工藝成本；二是降低生產原料成本。而微藻生物燃料生產成本中的75%是原料成本。從降低生物原料成本入手成為降低微藻生物燃料生產成本的重中之重。提高微藻的油脂產率，培育生物量積累速率快、油脂產率高的藻種，提供優質生物燃料原料，是降低微藻生物燃料生產成本的有效手段。
微擬球藻(Nannochloropsis sp. 0Z-1)是直徑為2-3 μ m的真核單細胞綠色微藻， 歸屬于褐藻門，大眼藻綱，單珠藻科，其細胞內油脂含量可達干重的68%，是公認的最有希望用于工業化的高產油海水藻之一。近年來已有多例以微擬球藻為材料在實驗室內進行生物柴油制備的報道，該藻的產業化前景非常廣闊。
近年來，重離子束特別是低能碳離子束作為一種新興的輻射源，由于其對微生物與植物種子有很強的致突變作用，已經在微生物及植物誘變育種研究中取得了巨大的經濟與社會效益，為育種提供了新的途徑。與傳統的誘變源相比，重離子束具有以下重要特點(I)傳能線密度大，能在生物介質中產生高密度的電離、激發、能量和質量沉積，造成生物介質的損傷，易于突變體的形成；(2)能量沉積過程中，在其射程末端存在一個尖銳的能量損失峰，使得生物樣品的局部受損，這種局部受損的位置可隨離子能量的高低而變化，是選擇可控的，有利于宏觀定點、定位誘變，實現定向育種；(3)損傷后修復效應小，可產生大量的突變且突變體穩定；(4)相對生物學效應高，因此突變體的產生效率高且突變譜廣。而目前為止，這種高效的誘變方式尚未應用于產油微藻的育種。
微擬球藻油脂含量高，是非常有潛力的生物柴油制備原料，但微藻大規模養殖成本高，生物量累積比較緩慢。采用生物技術手段誘變藻株，針對生長速率篩選微擬球藻突變株具有重要價值。而目前用于藻類育種的誘變技術篩選時間較短，通常只經過一次篩選， 得到的突變株遺傳穩定性較差，容易出現回復突變。發明內容
本發明目的在于提供一種微擬球藻突變株及其重離子誘變選育方法。
為實現上述目的本發明采用技術方案為一種微擬球藻突變株，其特征在于微擬球藻分類學命名Nannochloropsis sp. OZ-I ΗΡ-l,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號；保藏日期:2012年5月14日，保藏號為=CGMCC No. 6140。
所述微擬球藻的誘變選育方法，其特征在于以野生型微擬球藻 (Nannochloropsis sp. OZ-I)作為出發藻株經光照培養至對數生長期，利用重離子加速器對處于對數生長期的藻株進行誘變，獲得微擬球藻突變株Nannochloropsis sp. 0Z-1HP-1。
所述微擬球藻的誘變選育方法，其特征在于利用重離子加速器對生長至對數生長期的球藻進行不同劑量的碳重離子的輻射，將致死率達到50%的輻射劑量的藻株分別進行活化，再逐級傳代培養，選取在逐級傳代培養中Fv/Fm和0D750值穩定提高的生長迅速突變藻株，而后轉接于鼓泡柱式光反應器中傳代培養進一步篩選，獲得微擬球藻突變株 Nannochloropsis sp. 0Z-1HP-1。
所述的微擬球藻的應用，其特征在于所述微擬球藻Nannochloropsis sp. 0Z-1 HP-I用于油脂、生物柴油、脂肪酸、葉綠素a、類胡蘿卜素和或生物質成分。
本發明所具有的優點
本發明通過重離子誘變微擬球藻，采用葉綠素熒光成像系統Imaging PAM和酶標儀，以Fv/Fm和OD75tl作為考察指標，對突變體庫進行高通量篩選，具有快速便捷的特點，保證了一定數量的篩選量。而通過多步逐級篩選的方法，進一步保證了微藻優良性狀的穩定性，最終獲得的優良藻株在不同規模的培養體積中都具有較高的生長速率。
本發明對單細胞產油微藻Nannochloropsis sp. 0Z-1進行重離子誘變,獲得一株生長速率更快的突變株HP-I。該突變藻株生物量積累在培養末期較野生株提高19%，葉綠素a含量在培養第四天較野生株提高45%，類胡羅卜素含量較野生株提高47 %。該突變株油脂積累末期生物量較野生株提高33 %，含油量與野生株相比未顯著性提高，油脂產率提高28%，由O. Zlgr1CT1提高為O. 27gr1d-10油脂特性分析顯示突變株脂肪酸組成與野生型藻株相比未發生顯著性差異，突變株油脂成分中TAG含量較野生型藻株提高14%。


圖I為本發明實施例提供的微擬球藻重離子誘變不同輻照劑量致死率效果圖。
圖2為本發明實施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I生長曲線圖。
圖3A為本發明實施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I葉綠素a含量對比圖。
圖3B為本發明實施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I類胡蘿卜含量對比圖。
圖4A為本發明實施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I產油期生長曲線圖。
圖4B為本發明實施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I光系統II最大光化學效率(Fv/Fm)圖。
圖5A為本發明實施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I油脂含量圖。
圖5B為本發明實施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I油脂產率圖。
圖6為本發明實施例提供的氣相色譜分析野生株WT油脂脂肪酸組成圖。
圖7為本發明實施例提供的氣相色譜分析突變株HP-I油脂脂肪酸組成圖。
圖8為本發明實施例提供的薄層層析分析野生株WT油脂組成圖。
圖9為本發明實施例提供的薄層層析分析突變株HP-I油脂組成圖。
具體實施方式
根據下列實施例及附圖，可以更好的理解本發明。
實施例I:微擬球藻重離子誘變突變體庫的創制及高生長速率突變株篩選
I)取微擬球藻野生藻株(Nannochloropsis sp. 0Z-1)作為出發藻株；將所述藻株從平板上接種至含IOOmL Blue-Green Medium (簡稱BGl I)培養液的250mL錐形瓶中，置于光照培養箱中25°C，100ymol/m2 · s，連續光照培養至對數生長期。
BGll培養液的組成和配制參見表1，在配置培養液時，將以下成分以固體形式加入蒸餾水中配成100-1000倍的母液，使用時再按需稀釋配置成培養液。而后將BGll培養基分裝封口，滅菌處理。取出滅過菌的培養基，冷卻至室溫后，待用。
表I BGll培養基的組成及其含量
成分儲液濃度使用時終濃度NaNO3150g/LI. 5g/LMgSO4. 7H2075.Og/L0. 075g/LCaCl2. 2H2036. Og/L0.036g/L檸檬酸6.Og/L0.006g/LNa2EDTAI. 0g/L0.OOlg/L豐寧檬酸鐵銨6. Og/L0.006g/LNa2TO320.Og/L0.002g/LK2HPO440.Og/L0.004g/LH3BO32.86g/L0.000286g/LMnCl2. 4H20I. 47g/L0.000147g/LZnSO4. 7H200.222g/L0.0000222g/LNa2MoO4. 2H200.39g/L0.000039g/LCuSO4. 5H200.079g/L0.0000039g/LCo(NO3)2. 6H200.494g/L0.0000222g/L
2)取處于對數生長期的微擬球藻野生株，利用重離子加速器提供的碳重離子對藻株進行誘變創制突變體庫；
取處于對數生長期的微擬球藻，使用血球計數板測定細胞數目后，稀釋至 O. 5-1 X 107，分別取藻液I. 5mL，置于無菌平皿中。然后在重離子加速器垂直輻照終端裝置下，進行誘變，誘變能量重離子束流為12C6+,能量為80MeV/u。將劑量范圍設定為20Gy、40Gy、 60Gy、80Gy、lOOGy、120Gy、140Gy和160Gy。使用血球計數板對各輻照后樣品進行細胞計數， 并稀釋到1500個/mL，分別取200uL稀釋液涂布平板，使每個平板數目在300個左右，將上述各不同劑量輻照的稀釋后藻液涂布海水BGll固體平板后的存活藻的數目與野生株進行比較，計算致死率(參見圖1)，選取致死在率50%以上的藻株進行重點篩選，得到含約2000 株誘變藻株的突變體庫。
3)高生長速率突變藻株的初篩；
利用24孔細胞培養板可以實現藻株的大規模篩選，同時經過多步逐級篩選可以確保優良性狀的穩定。上述經分離后平板保存的2000株誘變藻株轉接于BGll固體培養基平板進行活化，而后從平板上將活化后的藻株接種于24孔細胞培養板中，每孔添加2mL BGll液體培養基，在溫度為25±1°C、光強為lOOymol/m2 · s條件下連續光照培養8天后， 采用葉綠素熒光成像系統Imaging-PAM(德國WALZ公司)和酶標儀(Bio-Tech)對突變體庫進行大規模篩選，考察指標為Fv/Fm值和OD75tl值，調整同樣OD75tl值傳代接種至新的24孔板中，生長8天后，測量OD75tl值和Fv/Fm值，挑選兩次24孔板篩選OD75tl和Fv/Fm值提高10 % 突變株，調整相同OD75tl值傳代接種入50mL錐形瓶中，在溫度為25± 1°C、光強為100 μ mol/ m2 · s連續光照條件下培養10天后，測量OD75tl值和Fv/Fm，選擇OD75tl值和Fv/Fm值提高10% 突變株接種于200mL錐形瓶中。在上述條件下培養10天后，測量OD75tl值和Fv/Fm值，最終得到生長迅速的15株誘變藻株保存于固體BGll培養基平板。
4)高生長速率的藻株的復篩；
經過初篩得到的生長迅速的15株誘變藻株經過復篩進一步篩選，并經過多步篩選步驟確定其優良性狀的穩定。上述經分離后平板保存的15株誘變藻株轉接于BGll固體培養基平板進行活化，而后從平板上將活化后的藻株分別接種于添加IOOmL BGll液體培養基的錐形瓶中在溫度為25±1°C，光強為lOOymol/m2 · S，連續光照培養條件下培養至對數生長期，測定干重。以干重O. 3g/L接種于含400mL BGll液體培養基的鼓泡柱式光反應器中，每株設三個平行樣，溫度為25±1°C，光強為lOOymol/m2 · s，連續光照培養。并在反應器底部持續鼓泡通氣，通氣量為O. 25vvm，通入氣體為純CO2和自然空氣混合，使培養液中 CO2的濃度為2% (體積比)，并使用0.22 μ m濾膜過濾除菌，培養10天后，測量干重。以干重O. 3g/L的突變藻株接種于含400mL BGll液體培養基的鼓泡柱式光反應器中，每株設三個平行樣，上述條件下培養10天后，測量干重，以干重O. 3g/L的突變藻株接種于含400mL BGll液體培養基的鼓泡柱式光反應器中，每株設三個平行樣，上述條件下培養10天。經過上述連續三次傳代培養的篩選，獲得高生長速率的微擬球藻Nannochloropsis sp. 0Z-1 HP-I突變株。
所述突變藻株HP-I于2012年5月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國北京朝陽區北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，100101)， 保藏號為CGMCC No. 6140。
上述誘變方法也適用于誘變其他單細胞生物，篩選方法經過初篩和復篩的多步篩選步驟可從大量誘變株系中篩選出具有高生長速率性狀穩定的單細胞藻類。
實施例2 :微擬球藻突變株HP-I和野生型藻株生物曲線繪制
將上述所得高生長速率突變株HP-I和野生株分別于含400mLBGll液體培養基的鼓泡柱式光反應器(外徑4. Ocm,內徑3. 8cm，柱高60cm)中培養至對數生長期，其培養條件為25土1°C，光強為lOOymol/m2 · S，連續光照培養。并在反應器底部持續鼓泡通氣，通氣量為0. 25vvm,通入氣體為純CO2和自然空氣混合，使培養液中CO2的濃度為2% (體積比)， 使用0. 22 μ m濾膜過濾除菌；將上述培養至對數生長期的突變株和野生株做為種子液分別接種于含400mL BGll液體培養基的鼓泡柱式光反應器中，初始接種量O. 8g/L，突變株和野生株分別設三個平行。在上述培養條件下培養，分別取出培養第O天、第2天、第4天、第6 天、第8天、第10天、第12天、第16天和第18天藻液10mL，使用清洗好的醋酸纖維素膜( L 徑O. 45 μ m)抽濾，105°C烘至恒重后稱重，測定干重即得生物量，繪制生長曲線(參見圖2)。
由圖2顯示突變株HP-I生物量顯著高于野生型藻株，在培養的第18天可以提高 19%。
實施例3 :微擬球藻突變株和和野生型藻株色素含量的測定分別取2mL上述實施例中分別培養第O天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天、第16天和第18天的突變體藻液及野生型藻液，分別以5000rpm離心IOmin后，加入2mL甲醇， 60 °C水浴Ih后，再以5000rpm離心IOmin,最后利用分光光度計在665、666、470nm下分別測定其吸光度，根據計算公式C葉綠素a μ g/mg= [13. 43A665v/ (IV) ] /D和C類_蘿卜素μ g/ mg=[(1000A470-44. 76A666/221) v/(IV) ]/D分別測定其葉綠素a和類胡蘿卜素含量，公式中A665、A470、A666分別為665、666和470nm下的吸光度值，ν為甲醇體積，I比色杯光程， V為樣品體積。
由圖3顯示突變株HP-I較野生型藻株葉綠素a含量在培養第四天提高45 %，類胡羅卜素含量提高47%。
實施例4 :微擬球藻突變株和野生型藻株產油期生長曲線、油脂含量和油脂產率測定
采用兩步法誘導產油，將處于對數生長末期野生型和突變體藻液，分別低速離心后(3000rpm，10min)，沉淀接種于無氮海水的BGll培養基中(BG11培養基無NaNO3)在 25±1°C，光強300ymol/m2 *s，連續光照培養，通氣量為O. 25vvm，通入氣體為純CO2和自然空氣混合，使培養液中CO2的濃度為2% (體積比)，并使用O. 22 μ m濾膜過濾除菌。在上述培養條件下高光缺氮誘導產油，在培養的第O天，第3天，第5天，第7天，第9天，第11 天分別取5mL藻液，使用清洗好的醋酸纖維素膜(孔徑O. 45 μ m)抽濾，105°C烘至恒重后稱重，測定產油期生物量(參見圖4)。
采用重量法測定油脂含量，以氯仿-甲醇(甲醇氯仿=2 l(v/v))共溶劑提取。分別取上述高光缺氮誘導產油中的第O天，第3天，第5天，第7天，第9天，第11天的野生型藻株和突變藻株各50mg的藻粉，藻粉通過高速離心(8000rpm，lOmin)獲得藻體后經冷凍真空干燥器凍干24h后得到。分別向突變株和野生株凍干藻粉中加入7. 5mL甲醇/氯仿甲醇 氯仿=2 1 (v/v)混合溶液,于37°C下振蕩提取24h后，6000rpm離心IOmin后分別收集上層有機相。兩藻株殘渣再用7. 5mL甲醇/氯仿混合溶劑重復提取一次。合并兩次提取的有機相，分別加入5mL I % NaCl和氯仿(I % NaCl和氯仿按體積比I: I混合)，混勻后分別離心收集下層氯仿相，氮吹儀下吹干，真空干燥器烘干后分別測定其油脂重量，與干重相比計算野生株和突變株總脂含量。利用生物量和總脂含量相乘除以培養天數計算油脂產率。
由圖4和5結果顯示該突變株HP-I油脂積累末期生物量較野生株提高33 %，含油量與野生株相比未顯著性提高，由于其生物量大，導致油脂產率提高28%，由O. Zlgr1CT1提高為 O.
實施例5 :微擬球藻突變株和野生型藻株油脂脂肪酸組成測定
分別取上述約10 μ g溶于氯仿的高光缺氮誘導第五天的野生型藻株和突變藻株總脂，將兩種藻株的總脂分別經過甲醇甲酯化(甲醇甲酯化條件2%硫酸，85°C，2. 5h)和正己烷萃取后，分別利用Agilent氣相色譜-四級桿質譜聯用儀對其脂肪酸組成進行分析。 GC條件HP-5MS石英毛細管柱(30. OOmmXO. 25mmXO. 25 μ m);柱溫120 240°C，程序升溫10°C /min ;柱流量I. OmL/min ;進樣口溫度250°C ;柱前壓IOOkPa ;進樣量I μ L ;分流比 10 I;載氣為高純氮氣。MS條件電離方式EI ;電子能量70eV;傳輸線溫度250°C ;離子源溫度230°C ;四極桿溫度150°C ;質量范圍35 450m/z ;采用wiley7n. I標準譜庫，計算機檢索定性(參見表I及圖6、7)。
實施例6 :微擬球藻突變株和野生型藻株油脂成分分析
分別取上述約10 μ g溶于氯仿的高光缺氮誘導第五天的野生型藻株和突變藻株總脂，利用棒狀薄層層析對其油脂成分進行分析，展開劑I體系為苯氯仿無水乙酸的體積比為150 60 :2，展開至7cm,展開劑2體系為苯己燒的體積比為I :1，展開至IOcm0 完畢后取出點樣板，待溶劑揮發后，置于氫火焰檢測器，氫氣流量為O. 16L/min，空氣流量為 0.2L/min。使用外標法分別對兩種藻株的油脂成分進行定量，標準樣品為甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、固醇酯、固醇和脂肪酸甲酯(參見表2和圖8、9)。
表2突變株(HP-I)和野生型(WT)微擬球藻油脂脂肪酸組成和油脂成分分析
權利要求
1.一種微擬球藻突變株，其特征在于微擬球藻突變株分類學命名Nannochloropsissp. OZ-I HP-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2012年5月14日，保藏號為=CGMCC No. 6140。
2.按權利要求I所述微擬球藻突變株的誘變選育方法，其特征在于以野生型微擬球藻(Nannochloropsis sp. OZ-I)作為出發藻株經光照培養至對數生長期,再利用重離子加速器對處于對數生長期的藻株進行誘變，獲得微擬球藻Nannochloropsis sp. OZ-I HP-I突變株。
3.按權利要求I所述微擬球藻突變株誘變選育方法，其特征在于利用重離子加速器對生長至對數生長期的微擬球藻進行不同劑量的碳重離子的輻射，將致死率在50%以上的輻射劑量下的藻株分別進行活化，再逐級傳代培養，選取在逐級傳代培養中Fv/Fm和OD75tl值穩定提高的生長迅速突變藻株，而后轉接于鼓泡柱式光反應器中傳代培養篩選得到微擬球藻突變株 Nannochloropsis sp. OZ-I HP-1。
4.按權利要求I所述的微擬球藻的應用，其特征在于所述微擬球藻Nannochloropsissp. OZ-I HP-I用于油脂、生物柴油、脂肪酸、葉綠素a、類胡蘿卜素和或生物質生產。
全文摘要
本發明涉及微生物工程領域，具體的說是一種微擬球藻突變株及其重離子誘變選育方法。微擬球藻突變株分類學命名Nannochloropsis sp.OZ-1HP-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2012年5月14日，保藏號為CGMCC No.6140。本發明突變藻株生物量積累在培養末期較野生株提高19％，葉綠素a含量在培養第四天較野生株提高45％，類胡羅卜素含量較野生株提高47％。該突變株油脂積累末期生物量較野生株提高33％，油脂產率提高28％，突變株脂肪酸組成與野生型藻株相比未發生顯著性變化，突變株油脂成分分析顯示TAG含量比野生型提高14％。該突變株生長速度快、油脂產率高、TAG含量高，可以為微擬球藻生物燃料產業化生產提供優質藻種。
文檔編號C12P17/18GK102978115SQ20121035623
公開日2013年3月20日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者馬玉彬, 張東遠, 周功克, 王芝瑤, 周翠燕 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所, 波音(中國)投資有限公司