專利名稱：利用lamp檢測溶藻弧菌的引物組及其快速診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及ー種利用LAMP檢測溶藻弧菌的引物組及其快速診斷試劑盒。
背景技術：
溶藻弧菌(Kzlrio alginolyticus)是ー種嗜鹽性革蘭氏陰性細菌,廣泛分布于河口和海洋環境中，是引起魚、蝦、貝等多種海水養殖動物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起傷ロ感染、胃腸炎和敗血癥等癥狀，嚴重威脅著水產養殖業發展，造成的經濟損失巨大。近年來，由于溶藻弧菌引起食物中毒事件的不斷出現，使人們進ー步認識到了溶藻弧菌對人類的致病性和危害，也因此將其列入食源性致病菌的范疇，成為食品衛生日常監測和檢疫對象。
目前，我國針對水產養殖中溶藻弧菌等細菌性致病菌的預防缺乏有效的措施，主要依賴于抗生素的廣泛使用，導致了耐藥菌株的出現，同時也對人類的健康構成威脅。此外，檢測手段滯后，仍以傳統的分離培養、生物化學反應鑒定為主，雖然檢測結果準確，但是實驗操作較繁瑣、費時費力，一般需要5-7d完成檢測，影響檢測時限。因此，發展操作簡便、快速準確、靈敏度高且易推廣的檢測方法，對溶藻弧菌進行早診斷和早預防，提高食品衛生水平，保證食品安全具有重要意義。LAMP技術是具有巨大發展潛力的ー種高新檢測技術，具有操作簡便、反應快速、靈敏度高、特異性強、檢測成本低廉等優點，已在疾病診斷、物種鑒定等領域得到廣泛應用。該方法的技術特點是依賴于能夠特異性識別靶基因上6個特定區域的4條引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，60-65°C恒溫條件下，40-60min內即可完成檢測工作，伴隨目標DNA的不斷擴增，產生大量的LAMP副產物-焦磷酸鎂白色沉淀，使反應溶液變渾濁，并以此作為直接的結果判斷依據。溶藻弧菌主要有6個毒カ相關基因，即鐵調蛋白基因(fur)、鞭毛蛋白基因(flaA)、膠原酶基因(valC)、堿性絲氨酸蛋白酶基因(aspA)、外膜蛋白基因(ompK和OmpW)。根據靶基因種內高度保守、種間高度特異的選擇原則，經過序列BLAST比對分析，溶藻弧菌的膠原酶基因是作為檢測靶基因的理想候選者。本發明選取了溶藻弧菌膠原酶基因作為靶基因，根據其保守區設定合成了 4條LAMP反應專用引物，建立了溶藻弧菌的LAMP檢測方法。
發明內容
本發明的目的在于提供ー種具有快速、準確、靈敏度高、特異性強、檢測成本低的一種檢測溶藻弧菌的LAMP引物組及其快速診斷試劑盒。本發明利用Genbank中已發布的溶藻弧菌基因組DNA序列，結合生物信息學手段，確定以溶藻弧菌膠原酶(collagenase)基因保守區序列作為檢測靶序列，設計合成了 4條特異性的LAMP引物，對溶藻弧菌進行定性檢測。
本發明采用以下主要技術特征
ー種利用LAMP檢測溶藻弧菌的引物組，由外引物對和內引物對組成，
所述的外引物對為
F3 CCAGTGGCTTACTCGTTGG,
B3 TTCGCGGCCATAAACTCAT,
所述的內引物對為 FIP CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC,
BIP GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG。本發明還具有如下特點
ー種利用LAMP檢測溶藻弧菌的快速診斷試劑盒，它含有如上所述的引物組、陽性對照品、LAMP反應液和DNA Polymerase聚合酶。所述的引物中外引物對和內引物對的添加摩爾比為1:4。所述的溶藻弧菌包括對溶藻弧菌標準菌株和溶藻弧菌分離菌株進行檢測；
所述的LAMP反應體系為
10 X TheraoPoL Buffer5 P L
dKTP ￠2,Smwl./L)8PL
ifSQ, (lW_ol/L)4HL
1lt)FlP(40ranol/L)I^L 引物 BIP(40itrool/L)
引物 F3(10_j1/L)IiiL
引賺 3(iCta iol/L)IPL
臆漏(10麵I幾)肌 Sst DNA Polymerase (8U/
IiL)IHL
細藺基因靈DWAfl後一__— 1M.L
無菌￡離子水23 P L
LAMP反應條件65°C水浴作用45min。采用瓊脂糖凝膠電泳法或濁度觀察法進行檢測結果的判定。利用試劑盒法提取溶藻弧菌基因組DNA，以提取的溶藻弧菌基因組DNA作為LAMP反應陽性模板。采用單因子濃度梯度實驗法逐一改變LAMP反應體系中各組分濃度，以優化LAMP反應體系，并調節反應溫度和作用時間，建立了 LAMP檢測方法(見圖I)。本發明分別以霍亂弧菌(ATCC 14035、ATCC 16112)、擬態弧菌(ATCC 33655)、副溶血性弧菌(ATCC 27968)、創傷弧菌(ATCC 27562、ATCC 33149)、溶藻弧菌(ATCC 33839、ATCC 51160)大腸埃希菌(ATCC 25922、ATCC 8739)、腸出血性大腸埃希菌 O157: H7 (ATCC35150)、產腸毒素大腸埃希菌(ATCC 35401)、阪崎腸桿菌(ATCC 51329)、福氏志賀氏菌(ATCC 12022)、金黃色葡萄球菌(ATCC 49444)、空腸彎曲菌(ATCC 33560)、單核細胞增生李斯特菌(ATCC 19111)、綿羊李斯特菌(ATCC 19119)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC 50115)、豬霍亂沙門氏菌(ATCC 10708)、嗜水氣單胞菌(ATCC 7966)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(ATCC9610)、沙門氏菌分離株、副溶血性弧菌分離株、創傷弧菌分離株、溶藻弧菌分離株、腸出血性大腸埃希菌O157: H7分離株、綠膿桿菌分離株基因組DNA進行實驗，以驗證該方法檢測的特異性。實驗結果顯示，本發明方法能夠特異性的對溶藻弧菌標準菌株和溶藻弧菌分離菌株進行檢測，引物與其他細菌無交叉反應，證明本發明方法具有高度的檢測特異性。本發明將已知菌體濃度的溶藻弧菌進行10倍梯度稀釋，同時制備溶藻弧菌污染食品樣本，利用試劑盒法提取每個稀釋梯度的基因組DNA，以此作為模板進行LAMP擴增，以確定該方法的檢測靈敏度。實驗結果顯示，本發明方法對純培養的溶藻弧菌的最低檢出限約為9CFU/mL (見圖2)，對污染食品中溶藻弧菌的最低檢出限為15CFU/mL (見圖3)。利用本發明方法重復20次檢測同一個陽性標準品，檢測結果均相同；兩次(時間 間隔30天)檢測同一批次陽性標準品，檢測結果均相同，可見本發明方法具有良好的重復性和穩定性。應用建立的溶藻弧菌LAMP檢測方法對采集的實際樣本進行了檢測，共檢測了 192份牡蠣樣本、125份生蠔樣本、43份象牙蛘樣本、97份螃蟹樣本、172份蝦樣本、85份海產魚類樣本，結果共檢出13份溶藻弧菌陽性樣本，經檢驗檢疫行業標準SN/T 2564-2010法驗證，符合率為100%，顯示本發明方法具有良好的可靠性和實用性。本發明方法與實時熒光PCR技術相比，兩者具有相同的檢測靈敏度(圖4)，但本發明方法不需要投入昂貴的儀器設備和配備專業的檢測人員，而且該方法可操作性強、快速、結果判定直觀、檢測成本低廉、實驗裝置簡單，僅需要普通水浴鍋或其他可以得到穩定熱源的設備即可，具有廣泛推廣性。作為ー種經濟適用的檢測方法，既要保證檢測的時效性，又要保證檢測的準確性。LAMP技術針對靶基因序列設計的兩對內外引物，可嚴格地識別靶序列的6個獨立區域，所以LAMP反應不會受到反應物中非靶序列DNA存在的影響，增強了檢測的特異性。
圖I為溶藻弧菌LAMP檢測方法的建立(A :渾濁度觀察.I :LAMP陰性結果；2 LAMP陽性結果.B :瓊脂糖凝膠電泳檢測結果.M DNA marker 2000 ；1 :LAMP陽性結果；2 LAMP陰性結果)；
圖2為純培養溶藻弧菌LAMP方法檢測靈敏度結果(A :瓊脂糖凝膠電泳檢測結果.M DNA Marker 2000 ; I 8 依次是9. 2 X 106，9. 2 X 105，9. 2 X 104，9. 2 X 103，9. 2 X 102，9. 2X101,9. 2X 10°，9. 2X10_1CFU/mL ;B :渾濁度觀察結果.I 8 依次是:9. 2X106，9. 2X105，9. 2X104，9. 2X103，9. 2X102，9. 2X101,9. 2X10°,9. 2X lO^CFU/mL)；
圖3為污染食品樣本中溶藻弧菌LAMP方法檢測靈敏度結果(A :瓊脂糖凝膠電泳檢測結果.M DNA Marker 2000 ; I 5 依次是:1. 5X104，1. 5X 103, 1. 5X 102，1. 5X101,!. 5X10°CFU/mL ；B:渾濁度觀察結果.I 6 依次是1. 5X104，I. 5X103，I. 5X102，I. 5X101，I. 5X 10° CFU/mL,陰性對照樣本)；
圖4為實時熒光PCR方法檢測溶藻弧菌靈敏度對照圖(初始菌體濃度為9. 2X IO7CFU/mL)。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進ー步的說明
I. LAMP模板的制備
參照天根TIANamp Bacteria DNA Kit說明書進行細菌基因組DNA的提取和純化，按比例加入相應試劑
1.1取I. 5mL待檢細菌增菌液,10000r/min離心lmin,棄上清,加入200 y L緩沖液GA，徹底懸浮菌體；
1.2加入20 ii L蛋白酶K (20mg/mL)，并加入220iiL緩沖液GB，充分混勻，70°C水浴作用 IOmin ；
1.3加入220 UL無水こ醇，充分混勻15s，離心5-10秒后將所得溶液(包括絮狀沉淀)轉移吸附柱CB3中，12000r/min離心30s，棄去收集管中的液體；
I. 4向吸附柱CB3中加入500 u L緩沖液⑶(含無水こ醇)，12000r/min離心30s，棄去收集管中的液體；
I. 5向吸附柱CB3中加入600 u L漂洗液Pff (含無水こ醇)，12000r/min離心30s,棄去收集管中的液體；
I.6重復步驟I. 5 (向吸附柱CB3中加入600 u L漂洗液Pff (含無水こ醇)，12000r/min離心30s，棄去收集管中的液體)；
I.7將吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min空載離心2min，室溫放置2-5min，晾干殘留的漂洗液；
I.8將吸附柱CB3轉入新的收集管中，在加入100 u L緩沖液TE，室溫放置2_5min，12000r/min離心2min,收集洗脫液。2. LAMP陽性質控標準品的制備
分析比較Genbank中公布的溶藻弧菌基因組序列，選取溶藻弧菌膠原酶(col Iagenase)基因作為檢測祀基因，設定合成了引物VA-F (上游)5' -CTGAAGATTTTGAGTGTCGCG-3'和 VA-R (下游):5' -CTCGCGTTACCCGTATACTTG-3'，以提取的溶藻弧菌基因組DNA為模板，采用常規PCR法擴增靶基因序列，PCR反應體系(25 u L)如下
權利要求
1.一種利用LAMP檢測溶藻弧菌的引物組，其特征在于，所述的引物組由下列外引物對和內引物對組成 所述的外引物對為F3 CCAGTGGCTTACTCGTTGG,B3 TTCGCGGCCATAAACTCAT, 所述的內引物對為FIP CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC,·BIP GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG。
2.一種利用LAMP檢測溶藻弧菌的快速診斷試劑盒，其特征在于它含有權利要求I所述的引物組、陽性對照品、LAMP反應液和ifei DNA Polymerase聚合酶。
3.根據權利要求2所述的一種利用LAMP檢測溶藻弧菌的快速診斷試劑盒，其特征在于所述的引物中外引物對和內引物對的添加摩爾比為1:4。
全文摘要
本發明涉及一種利用LAMP檢測溶藻弧菌的引物組和快速診斷試劑盒，所述的引物組為F3CCAGTGGCTTACTCGTTGG，B3TTCGCGGCCATAAACTCAT，FIPCGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC，BIPGGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG；快速診斷試劑盒，它含有如上所述的引物組、陽性對照品、LAMP反應液和BstDNAPolymerase聚合酶。本發明具有可操作性強、快速、結果判定直觀、檢測成本低廉、實驗裝置簡單的優點，僅需要普通水浴鍋或其他可以得到穩定熱源的設備即可。
文檔編號C12Q1/68GK102851385SQ20121035742
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者徐義剛, 吳巖, 李丹丹, 劉忠梅, 劉新亮, 李蘇龍 申請人:黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心