專利名稱：一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種無乳鏈球菌的檢測方法，特別是一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法。
背景技術：
羅非魚是全球主要經(jīng)濟魚類之一，具有生長快、抗病力與抗逆性強、肉質好、繁殖力強、適應性廣以及群體產(chǎn)量高等一系列優(yōu)點，現(xiàn)已成為南方各省出口型養(yǎng)殖規(guī)模最大的魚類，產(chǎn)量占全世界的50%，羅非魚產(chǎn)業(yè)對于增加就業(yè)機會、提高農(nóng)民收入都有十分重要的意義。然而近年來，由于高密度飼養(yǎng)，種群退化，加上養(yǎng)殖水質、環(huán)境及氣候惡化，各類病害時常大面積爆發(fā)，嚴重影響到羅非魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。2009 2011年，國內主要的羅非魚養(yǎng)殖區(qū)爆發(fā)了非常嚴重的羅非魚流行病，患病羅非魚在水面離群獨游，游姿失衡，眼球突出，被養(yǎng)殖戶形象的稱為“突眼病”。該病發(fā)病率一般達20% 30%，死亡率在95%以上。 病原分析表明引起羅非魚“突眼病”的病原為鏈球菌，主要為海豚鏈球菌印tococcusiniae)和無乳鏈球菌{Streptococcus agalactiae)。據(jù)統(tǒng)計，近幾年因鏈球菌病導致羅非魚產(chǎn)業(yè)的損失達20億元，如何防治羅非魚鏈球菌病已成為農(nóng)業(yè)和漁業(yè)管理部門最為關注的問題。分子診斷技術是當代醫(yī)學發(fā)展的重要前沿領域之一，主要包括免疫診斷技術和分子生物學診斷技術，二者都具有操作簡便、快速、準確、特異性強、陽性率高的特點。免疫學技術是利用特異性抗原抗體反應，檢測病原微生物，簡化了病原微生物的鑒定步驟，備受關注。各大文獻數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)顯示，幾乎建立了所有病原體的血清學檢測方法，表明該方法已成為一種微生物實驗室常用的成熟的檢測技術，具有操作簡便、快速、準確、特異性強、陽性率高等特點。免疫學方法中常見的幾種診斷技術包括凝集技術、熒光抗體技術、酶聯(lián)免疫技術等。隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，使人們對微生物的認識從外部表型逐漸轉向內部基因結構特征，微生物的檢測也從生化、免疫方法轉向基因水平檢測，對于那些難培養(yǎng)和不可能培養(yǎng)的微生物，可直接通過獲得基因信息，給微生物學的檢測帶來嶄新的領域。分子生物學診斷技術中常用的方法有PCR技術、核酸分子雜交、多位點序列分型、環(huán)介導等溫擴增技術等。同免疫診斷試劑相比較，分子生物學診斷試劑具有生產(chǎn)工藝簡單，靈敏度更高的特點，逐漸成為新一代分子診斷試劑開發(fā)的主流。CAMP因子是無乳鏈球菌特異性產(chǎn)生的一種蛋白質，是無乳鏈球菌區(qū)別于其他細菌的重要特征指標。在傳統(tǒng)的無乳鏈球菌生理生化鑒定中，CAMP試驗已成為鑒定無乳鏈球菌的關鍵試驗。CAMP因子的編碼基因是￠/ 基因，利用分子生物學技術檢測樣品中是否含有c/辦基因即可判斷樣品是否受到了無乳鏈球菌的感染。環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediatedisothermal amplification,簡稱 LAMP)是2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件￠3 °C左右)保溫3(T60 min，即可完成核酸擴增反應。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。LAMP是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術，能不依賴任何專門的儀器設備實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。羅非魚鏈球菌病是危害羅非魚養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的爆發(fā)性疾病，無乳鏈球菌是最主要的病原菌。通過分子檢測手段，在養(yǎng)殖過程中定期檢測羅非魚是否受到無乳鏈球菌的感染，是預防鏈球菌病的一種有效措施。目前已公開的專利和論文多使用PCR的方法檢測無乳鏈球菌，該方法能夠特異性的檢測無乳鏈球菌，但檢出靈敏度低，只適用于感染后期魚體內病原菌含量較多的時候。由于感染已發(fā)展至后期，因此在得出檢測結果后采取預防措施的效果會大打折扣，更有可能在采取措施之前，疾病就已爆發(fā)。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種測試靈敏度高、測試速度快的羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法。·
解決上述技術問題的技術方案是一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，包括以下步驟
51.抽取待檢羅非魚的血液廣2mL，提取血液中的總RNA;
52.以所提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，獲得待測羅非魚血液樣品的cDNA；
53.根據(jù)無乳鏈球菌的￠/ 基因序列設計并合成用于環(huán)介導等溫擴增的引物；
54.以上述步驟S2中獲得的cDNA為模板，利用上述步驟S3中合成的引物，進行目標基因的環(huán)介導等溫擴增；
55.擴增完成后，檢測反應結果，結果陽性的表示供檢羅非魚感染了無乳鏈球菌，結果陰性的表示供檢羅非魚沒有感染無乳鏈球菌。本發(fā)明的進一步技術方案是步驟SI中所述的提取羅非魚血液總RNA，具體方法如下
511.抽取待檢羅非魚的血液ImL，將其于轉速為5000 rpm離心10 min，去掉上清液后加入I mL用于總RNA抽提的trizol試劑，反復吹打重懸沉淀，得重懸液；
512.將上述步驟Sll中所得的重懸液于室溫靜置5min后，每ImL trizol加O. 2 mL氯仿，用手輕搖3-5次，使得氯仿和trizol試劑混合均勻，在室溫靜置2-3min后，于4_8°C，轉速12000 rpm離心15 min,離心后,溶液分為水層、中間層和氯仿層共3層；
513.將上述步驟S12中的水層O.4-0. 5 mL轉移到一只干凈的I. 5 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，用手輕搖3-5次混勻，在室溫放置10 min,于4_8°C，轉速12000 rpm離心10 min,離心后棄去上清液,所得沉淀備用；
514.將上述步驟S13中所獲的沉淀，用ImL濃度為75%乙醇洗滌后，在4-8°C，轉速7500rpm離心5 min,離心后棄去上清液,所得沉淀即為提取的總RNA ；
515.將上述步驟S14獲得的RNA自然干燥后加入40μ L去RNA酶水進行溶解。步驟S2中所述的以所提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，具體方法如下
S21.配制反應體系20 μ L，包括RNA模板I μ 1，5倍反應緩沖液4 μ L，濃度為10 mmol/L
的dNTP 2 μ L，濃度為IOU/ μ L的RNA酶抑制劑2 μ L，濃度為25 μ mo I/L的隨機弓丨物I μ L，濃度為5U/ μ L的反轉錄酶2 μ L，添加去RNA酶水至總體積20 μ L ;上述的 5 倍反應緩沖液由 ρΗ=8· 3 的 Tris-HCl 250 mmol/L,KCl 375 mmol/L,MgCl2 40mmol/L 和 DTT 50 mmol/L 組成而得；
522.輕微混勻通過上述步驟S21所得的反應液，于室溫放置10min后移入42°C恒溫槽中保溫I h ；
523.將經(jīng)過上述步驟S22的反應液于冰水中冷卻2min完成反轉錄反應，獲得待測羅非魚血液樣品的cDNA。步驟S3中所述的引物是根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的無乳鏈球菌的￠/ 基因序列，并結合環(huán)介導等溫擴增技術的原理設計并合成，分別是
PI: 5-ATGAACGTTACACATATGATGT-3 ； P2: 5-GTTCCCTGAACATTATCTTTGA-3 ；
P3: 5-TCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGATCTATCTGGAACTCTAGTGG-3 ；
P4: 5-AGTGACAACTCCACAAGTGGTAGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAG-3。步驟S4中所述的目標基因的環(huán)介導等溫擴增的具體方法如下
541.配制反應體系25μ L，包括10倍反應緩沖液2. 5 μ L，濃度為25mmol/L的MgSO44 μ L、濃度為IOmmoI/L的dNTP 4 μ L，濃度為20ymol/L的引物Pl和P2各I. 5 μ L，濃度為10 μ mo I/L的引物P3和P4各O. 5 μ L，濃度為8U/ μ L的Bst DNA聚合酶大片段I μ L，步驟S2中獲得的cDNA模板2 μ L，添加ddH20至總體積25 μ L ；
上述上 10 倍反應緩沖液由 ρΗ=8· 8 的 Tris-HCl 200mmol/L, KCl 100 mmol/L, (NH4)2SO4100 mmol/L, MgSO4 20 mmol /L 和 TritonX-100 1%組成而得;
542.輕微混勻通過上述步驟S41所得的反應液，于65°C保溫Ih ；
543.將經(jīng)過上述步驟S42的反應液于80°C保溫IOmin以終止反應。步驟S5中所述的擴增完成后，檢測反應結果的方式為直接用肉眼觀察反應結果，若步驟S4中的反應體系中出現(xiàn)白色沉淀者為陽性，說明血液樣品中含有無乳鏈球菌，即表示帶檢羅非魚已受到無乳鏈球菌的感染。步驟S5中所述的擴增完成后，檢測反應結果的方式為使用DNA染料SYBR GreenI染料進行染色，即向步驟S4中的反應液中加入SYBR Green I I μ L，若反應體系在紫外燈下出現(xiàn)綠色熒光為陽性，說明血液樣品中含有無乳鏈球菌，即表示帶檢羅非魚已受到無乳鏈球菌的感染。該方法不經(jīng)過細菌的培養(yǎng)，直接以羅非魚血液為樣本進行檢測。由于采用上述技術方案，本發(fā)明之一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法有以下有益效果
I.檢測靈敏度高
本發(fā)明結合了反轉錄技術和環(huán)介導等溫擴增技術，通過反轉錄的方法將菌體內單拷貝的Cfb基因轉變?yōu)槎嗫截悾偻ㄟ^環(huán)介導等溫擴增技術對目標基因進行檢測，從而大大提高了檢測靈敏度高。檢出限可到達l(Tl00CFU/mL，能夠在羅非魚感染無乳鏈球菌初期檢出體內的無乳鏈球菌，為羅非魚鏈球菌病的預防提供新的技術手段。2.檢測速度快
本發(fā)明通過分子生物學方法檢測羅非魚血液中是否存在無乳鏈球菌基因，從而判斷被檢羅非魚是否受到了無乳鏈球菌感染。檢測結果可用肉眼直接觀察，整個檢測時間小于5h。本方法使用羅非魚的血液為樣品進行檢測，可以對羅非魚進行抽血，不會致死，同時也減少了使用肝、脾等器官進行檢測時所必需的組織碾磨的步驟。3.特異性高
本發(fā)明之一種羅非魚無乳鏈球菌高靈敏度的快速檢測方法，以無乳鏈球菌特有的Cfb基因為目標基因，能避免其他細菌的干擾而特異性的檢測無乳鏈球菌。
具體實施例方式 一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，包括以下步驟
SI.抽取待檢羅非魚的血液廣2 mL，提取血液中的總RNA ;具體方法如下
511.抽取待檢羅非魚的血液ImL，將其于轉速為5000 rpm離心10 min，去掉上清液后 加入I mL用于總RNA抽提的trizol試劑，反復吹打重懸沉淀，得重懸液；
512.將上述步驟Sll中所得的重懸液于室溫靜置5min后，每ImL trizol加O. 2 mL氯仿，用手輕搖3-5次，使得氯仿和trizol試劑混合均勻，在室溫靜置2-3min后，于4_8°C，轉速12000 rpm離心15 min,離心后,溶液分為水層、中間層和氯仿層共3層；
513.將上述步驟S12中的水層O.4-0. 5 mL轉移到一只干凈的I. 5 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，用手輕搖3-5次混勻，在室溫放置10 min,于4_8°C，轉速12000 rpm離心10 min,離心后棄去上清液,所得沉淀備用；
514.將上述步驟S13中所獲的沉淀，用ImL濃度為75%乙醇洗滌后，在4-8°C，轉速7500rpm離心5 min,離心后棄去上清液,所得沉淀即為提取的總RNA ；
515.將上述步驟S14獲得的RNA自然干燥后加入40μ L去RNA酶水進行溶解。S2.以所提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，獲得待測羅非魚血液樣品的cDNA ;具體方法如下
521.配制反應體系20μ L，包括RNA模板I μ 1，5倍反應緩沖液4 μ L，濃度為10 mmol/L的dNTP 2 μ L，濃度為IOU/ μ L的RNA酶抑制劑2 μ L，濃度為25 μ mo I/L的隨機引物I μ L，濃度為5U/ μ L的反轉錄酶2 μ L，添加去RNA酶水至總體積20 μ L ;
上述的 5 倍反應緩沖液為由 ρΗ8. 3 的 Tris-HCl 250 mmol/L, KCl 375 mmol/L, MgCl240 mmol/L 和 DTT 50 mmol/L 組成而得；
522.輕微混勻通過上述步驟S21所得的反應液，于室溫放置10min后移入42°C恒溫槽中保溫I h ；
523.將經(jīng)過上述步驟S22的反應液于冰水中冷卻2min完成反轉錄反應，獲得待測羅非魚血液樣品的cDNA。S3.根據(jù)無乳鏈球菌的Cfb基因序列設計并合成用于環(huán)介導等溫擴增的引物； 其中，所述的引物是根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的無乳鏈球菌的cfb基因序列，該序列在
數(shù)據(jù)庫中的登陸號為NC_007432，并結合環(huán)介導等溫擴增技術的原理設計并合成，分別是 PI: 5-ATGAACGTTACACATATGATGT-3 ；
P2: 5-GTTCCCTGAACATTATCTTTGA-3 ；
P3: 5-TCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGATCTATCTGGAACTCTAGTGG-3 ；
P4: 5-AGTGACAACTCCACAAGTGGTAGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAG-3。S4.以上述步驟S2中獲得的cDNA為模板，利用上述步驟S3中合成的引物，進行目標基因的環(huán)介導等溫擴增；具體方法如下541.配制反應體系25μ L，包括10倍反應緩沖液2. 5 μ L，濃度為25mmol/L的MgSO44 μ L、濃度為IOmmoI/L的dNTP 4 μ L，濃度為20ymol/L的引物Pl和P2各I. 5 μ L，濃度為10 μ mo I/L的引物P3和P4各O. 5 μ L，濃度為8U/ μ L的Bst DNA聚合酶大片段I μ L，步驟S2中獲得的cDNA模板2 μ L，添加ddH20 (重蒸水)至總體積25 μ L ;
上述上 10 倍反應緩沖液為由 ρΗ8. 8 的 Tris-HCl 200mmol/L, KCl 100 mmol/L,(NH4)2SO4 100 mmol/L, MgSO4 20 mmol/L 和 TritonX-100 1%組成而得;
542.輕微混勻通過上述步驟S41所得的反應液，于65°C保溫Ih ；
543.將經(jīng)過上述步驟S42的反應液于80°C保溫IOmin以終止反應。S5.擴增完成后，檢測反應結果，結果陽性的表示供檢羅非魚感染了無乳鏈球菌，結果陰性的表示供檢羅非魚沒有感染無乳鏈球菌；其中，檢測反應結果的方式為直接用肉眼觀察反應結果，若步驟S4中的反應體系中出現(xiàn)白色沉淀者為陽性，說明血液樣品中 含有無乳鏈球菌，即表示帶檢羅非魚已受到無乳鏈球菌的感染；也可以使用DNA染料SYBRGreen I進行染色，即向步驟S4中的反應液中加入SYBR Green I I μ L，若反應體系在紫外燈下出現(xiàn)綠色熒光為陽性，說明血液樣品中含有無乳鏈球菌，即表示帶檢羅非魚已受到無乳鏈球菌的感染。本發(fā)明之一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法不經(jīng)過細菌的培養(yǎng)，直接以羅非魚血液為樣本進行檢測。
權利要求
1.一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟 51.抽取待檢羅非魚的血液廣2mL，提取血液中的總RNA; 52.以所提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，獲得待測羅非魚血液樣品的cDNA； 53.根據(jù)無乳鏈球菌的￠/ 基因序列設計并合成用于環(huán)介導等溫擴增的引物； 54.以上述步驟S2中獲得的cDNA為模板，利用上述步驟S3中合成的引物，進行目標基因的環(huán)介導等溫擴增； 55.擴增完成后，檢測反應結果，結果陽性的表示供檢羅非魚感染了無乳鏈球菌，結果陰性的表示供檢羅非魚沒有感染無乳鏈球菌。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于步驟SI中所述的提取羅非魚血液總RNA，具體方法如下 511.抽取待檢羅非魚的血液ImL，將其于轉速為5000 rpm離心10 min，去掉上清液后加入I mL用于總RNA抽提的trizol試劑，反復吹打重懸沉淀，得重懸液； 512.將上述步驟Sll中所得的重懸液于室溫靜置5min后，每ImL trizol加O. 2 mL氯仿，用手輕搖3-5次，使得氯仿和trizol試劑混合均勻，在室溫靜置2-3min后，于4_8°C，轉速12000 rpm離心15 min,離心后,溶液分為水層、中間層和氯仿層共3層； 513.將上述步驟S12中的水層O.4-0. 5 mL轉移到一只干凈的I. 5 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，用手輕搖3-5次混勻，在室溫放置10 min,于4_8°C，轉速12000 rpm離心10 min,離心后棄去上清液,所得沉淀備用； 514.將上述步驟S13中所獲的沉淀，用ImL濃度為75%乙醇洗滌后，在4-8°C，轉速7500rpm離心5 min,離心后棄去上清液,所得沉淀即為提取的總RNA ； 515.將上述步驟S14獲得的RNA自然干燥后加入40μ L去RNA酶水進行溶解。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于步驟S2中所述的以所提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，具體方法如下 521.配制反應體系20μ L，包括RNA模板I μ 1，5倍反應緩沖液4 μ L，濃度為10 mmol/L的dNTP 2 μ L，濃度為IOU/ μ L的RNA酶抑制劑2 μ L，濃度為25 μ mo I/L的隨機弓丨物I μ L，濃度為5U/ μ L的反轉錄酶2 μ L，添加去RNA酶水至總體積20 μ L ; 上述的 5 倍反應緩沖液由 ρΗ=8· 3 的 Tris-HCl 250 mmol/L,KCl 375 mmol/L,MgCl2 40mmol/L 和 DTT 50 mmol/L 組成而得； 522.輕微混勻通過上述步驟S21所得的反應液，于室溫放置10min后移入42°C恒溫槽中保溫I h ； 523.將經(jīng)過上述步驟S22的反應液于冰水中冷卻2min完成反轉錄反應，獲得待測羅非魚血液樣品的cDNA。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于步驟S3中所述的引物是根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的無乳鏈球菌的cfb基因序列，并結合環(huán)介導等溫擴增技術的原理設計并合成，分別是PI: 5-ATGAACGTTACACATATGATGT-3 ；P2: 5-GTTCCCTGAACATTATCTTTGA-3 ；P3: 5-TCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGATCTATCTGGAACTCTAGTGG-3 ；P4: 5-AGTGACAACTCCACAAGTGGTAGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAG-3。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于步驟S4中所述的目標基因的環(huán)介導等溫擴增的具體方法如下 541.配制反應體系25μ L，包括10倍反應緩沖液2. 5 μ L，濃度為25mmol/L的MgSO44 μ L、濃度為IOmmoI/L的dNTP 4 μ L，濃度為20ymol/L的引物Pl和P2各I. 5 μ L，濃度為10 μ mo I/L的引物P3和P4各O. 5 μ L，濃度為8U/ μ L的Bst DNA聚合酶大片段I μ L，步驟S2中獲得的cDNA模板2 μ L，添加ddH20至總體積25 μ L ；上述上 10 倍反應緩沖液由 ρΗ=8· 8 的 Tris-HCl 200mmol/L, KCl 100 mmol/L, (NH4)2SO4100 mmol/L, MgSO4 20 mmol /L 和 TritonX-100 1%組成而得; 542.輕微混勻通過上述步驟S41所得的反應液，于65°C保溫Ih ； 543.將經(jīng)過上述步驟S42的反應液于80°C保溫IOmin以終止反應。
6.根據(jù)權利要求I所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于步驟S5中所述的擴增完成后，檢測反應結果的方式為直接用肉眼觀察反應結果，若步驟S4中的反應體系中出現(xiàn)白色沉淀者為陽性，說明血液樣品中含有無乳鏈球菌，即表示帶檢羅非魚已受到無乳鏈球菌的感染。
7.根據(jù)權利要求I所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于步驟S5中所述的擴增完成后，檢測反應結果的方式為使用DNA染料SYBR Green I染料進行染色，即向步驟S4中的反應液中加入SYBR Green I I μ L，若反應體系在紫外燈下出現(xiàn)綠色熒光為陽性，說明血液樣品中含有無乳鏈球菌，即表示帶檢羅非魚已受到無乳鏈球菌的感染。
8.根據(jù)權利要求1-7任一權利要求所述的一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，其特征在于該方法不經(jīng)過細菌的培養(yǎng)，直接以羅非魚血液為樣本進行檢測。
全文摘要
一種羅非魚源無乳鏈球菌的高靈敏度快速檢測方法，涉及一種無乳鏈球菌的檢測方法，本發(fā)明以無乳鏈球菌cfb基因為檢測對象，通過檢測羅非魚血液中是否存在無乳鏈球菌cfb基因，從而判斷被檢羅非魚是否受到了無乳鏈球菌感染。本方法通過反轉錄的方法將菌體內單拷貝的cfb基因轉變?yōu)槎嗫截悾偻ㄟ^環(huán)介導等溫擴增技術對目標基因進行檢測，從而大大提高檢測靈敏度。該方法能在感染初期快速、特異、簡便的檢出羅非魚體內的無乳鏈球菌，為羅非魚鏈球菌病的預防提供新的技術手段。
文檔編號C12Q1/14GK102888458SQ20121036810
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權日2012年9月27日
發(fā)明者易弋, 楊軍, 黃稀, 黎婭, 伍時華, 羅福廣, 左躍 申請人:廣西工學院, 柳州市魚家樂飼料有限公司