專利名稱：一種hTERTmRNA的TRPCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種端粒酶催化亞基(hTERT)mRNA的預(yù)備模板PCR (Template-ReadyPCR, TRPCR)檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
(ニ)
背景技術(shù)：
端粒酶(telomerase)是ー種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶,是由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物，包含3個(gè)主要成分端粒酶RNA (hTR)模板，端粒酶催化亞單位(hTERT)和端粒酶相關(guān)蛋白(hTLP)。hTR是端粒酶進(jìn)行延伸反應(yīng)的模板，約有450個(gè)堿基，其中包 含5’ -CUAACCCUAAC-3’的模板序列；hTERT是端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的蛋白催化亞基，hTLP是端粒酶的調(diào)節(jié)單位。端粒酶的主要功能是利用染色體末端(端粒)的3’末端為引物，以自身RNA為模板合成端粒-TTAGGG-重復(fù)序列添加到染色體末端，從而維持端粒原有長(zhǎng)度，使端粒的穩(wěn)定和保護(hù)染色體的功能得以延續(xù)，細(xì)胞因逃逸漸進(jìn)性衰老而達(dá)到“永生化”。在ー些特定的組織細(xì)胞，如生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、造血干細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、毛發(fā)、皮膚、子宮內(nèi)膜等分裂旺盛的組織細(xì)胞中有低水平的活化端粒酶的表達(dá)，但在正常成熟的體細(xì)胞中則沒有端粒酶活性，這些體細(xì)胞因?yàn)槎肆５闹饾u縮短而導(dǎo)致衰老和死亡。極少數(shù)體細(xì)胞可能偶然通過(guò)激活端粒酶而逃逸程序性老化，其生存延長(zhǎng)可能給另外的基因損傷的積累提供機(jī)會(huì)，導(dǎo)致進(jìn)行性腫瘤性發(fā)展，即癌變，因此，端粒酶的重新激活是體細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即癌變的關(guān)鍵步驟。對(duì)大量的臨床標(biāo)本的檢測(cè)表明，絕大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞都呈端粒酶陽(yáng)性(>85%)，而在癌旁組織和正常組織的端粒酶陽(yáng)性率很低(<5%)，因此，端粒酶是ー個(gè)被廣泛接受的特異性很高的腫瘤標(biāo)志物。細(xì)胞內(nèi)端粒酶的調(diào)控主要是通過(guò)hTERT的表達(dá)調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的，hTERT mRNA的表達(dá)水平在癌細(xì)胞中有明顯上調(diào)，因此，對(duì)hTERT mRNA的檢測(cè)可能發(fā)展成為對(duì)癌癥進(jìn)行檢測(cè)和分子診斷的有力手段。RT-PCR (reverse transcription 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))，指將逆轉(zhuǎn)錄(ReverseTranscription, RT)反應(yīng)和 PCR (Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)組合在一起的方法。RT- PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了ー種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。然而，RT-PCR在臨床檢測(cè)應(yīng)用方面，存在很大的改進(jìn)空間，主要問題是(1)依賴于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，且2步酶促反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄和PCR)的最優(yōu)反應(yīng)條件是有差異的，體系優(yōu)化受到限制；(2)需要嚴(yán)格預(yù)防和抑制RNA酶的污染，需要提取純化RNA，前處理的過(guò)程復(fù)雜，操作要求高，步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)；(3)容易受到各種抑制物質(zhì)的影響，容易受到假陽(yáng)性的困擾；(4)逆轉(zhuǎn)錄酶的價(jià)格居高不下，操作成本很難降下來(lái)；(5)對(duì)于低豐度RNA的檢測(cè)靈敏度不夠高的時(shí)候，需要采用非常復(fù)雜和容易污染的套式PCR。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供ー種操作簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)的用于端粒酶催化亞基(hTERT)檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
ー種端粒酶催化亞基(hTERT) mRNA的預(yù)備模板PCR檢測(cè)試劑盒，主要包括(I)管內(nèi)固定有探針A的錨定PCR管；所述探針A核苷酸序列如下5’ -GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3，；探針A是與目標(biāo)RNA上一段序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸DNA，這段序列位于下面所述的探針B互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域之外；探針A的錨定可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，用于錨定探針A的固體介質(zhì)，可以是塑料離心管，也可以是磁珠，凝膠顆粒或其他可以吸附結(jié)合核酸的固體介質(zhì)；(2)探針 B，其核苷酸序列如下5’ -CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGITTCGGCG-3’ ；探針 B 是包含與目標(biāo) RNA 上另一段序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸DNA，其結(jié)構(gòu)為兩端是特異的PCR引物序列，中間為與目標(biāo)RNA序列的互補(bǔ)序列；(3) PCR 引物NTPl :5，- CCGGAGGAAAGCGTGGACACC -3，NTP2 :5’ - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3，；(4)裂解液；所述裂解液為本領(lǐng)域常規(guī)含有表面活性劑(如吐溫20、NP-40等)、用于細(xì)胞裂解的緩沖液；

(5) PCR緩沖液；所述緩沖液為PCR反應(yīng)常規(guī)緩沖液；(6)洗滌液；所述洗滌液可為本領(lǐng)域常規(guī)含有表面活性劑(如吐溫20、NP_40等)的緩沖液。該試劑盒的原理如下(1)預(yù)先制備好與目標(biāo)RNA上一段序列互補(bǔ)的錨定探針——探針A ;探針A被固定在PCR管壁，磁珠或其他可吸附結(jié)合核酸的固體介質(zhì)上，作用是通過(guò)特異性地結(jié)合目標(biāo)RNA,將目標(biāo)RNA選擇性地吸附在固體介質(zhì)上；(2)與目標(biāo)RNA上另一段序列互補(bǔ)的模板探針——探針B ;探針B兩端帶有PCR引物序列，使用時(shí)是添加在裂解液中的；當(dāng)細(xì)胞被裂解后，探針B通過(guò)部分雜交與目標(biāo)RNA結(jié)合，這樣探針B也就被選擇性地吸附在上述固體介質(zhì)上；(3)在雜交反應(yīng)之后，經(jīng)過(guò)反復(fù)清洗，只有能與探針A互補(bǔ)雜交結(jié)合的目標(biāo)RNA分子及與該RNA雜交結(jié)合的探針B留在反應(yīng)管中；(4)由于探針B兩端帶有PCR引物序列，這樣加入PCR反應(yīng)液后，以探針B為模板，不需要RT，可直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。優(yōu)選的，所述裂解液組成如下l%(w/vol)SDS, 500mmol/L NaCl, 2mmol//L MgCl2,10mmol/L 2-疏基こ醇，0. lmg/ml 魚精 DNA (市購(gòu))，0.1% (vol/vol) Tween20,1% (w/vol)脫脂奶粉，溶劑為10mmol/L、pH7· 5的Tris_HCl。優(yōu)選的，所述PCR 緩沖液組成如下50mmol/L KCl, I. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/LdNTP，5% (vol/vol)DMS0,0. 05%(vol/vol) Tween20,0. 4XSYBR Green I(濃度 0.4X 的含義是，其中各組分在反應(yīng)液中的終濃度為IXSYBR Green I中的0. 4倍，市購(gòu)Miroprobe原液濃度為10000X，使用時(shí)按體積比稀釋至PCR緩沖液中終濃度為0. 4X即可)，0. 5U/20ulTaq 酶，溶劑為 10mmol/L、ρΗ9· O 的 Tris-HCl。優(yōu)選的，所述洗滌液為TBST緩沖液，其終濃度組成為150 mmol/L NaCl, 0. 05%Tween 20，溶劑為 10 mmol/L、pH 7.5Tris_HCl。本發(fā)明還涉及利用所述試劑盒檢測(cè)端粒酶催化亞基mRNA的方法，所述方法包括
(I)取待測(cè)樣本，加入探針B和裂解液(裂解液中探針B添加濃度為O. Inmol/L 100nmOl/L)，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置20min，4°C離心，取上清液，得到裂解上清液；待測(cè)樣本可來(lái)自組織或細(xì)胞，或者臨床標(biāo)本如痰液、血液等；待測(cè)樣本來(lái)自痰液時(shí)，裂解上清液獲得方法如下I飛ml痰液+ 5^10 ml痰融液,37°C振蕩IOmin, 4°C、5000 rpm離心IOmin,棄上清,取沉淀+ 200 ul裂解液(其中探針8濃度為1鹽01/1)，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm離心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液組成PBS+0. 1% (w/vol) DTT0待測(cè)樣本來(lái)自細(xì)胞時(shí)，裂解上清液獲得方法如下24孔板細(xì)胞培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，+ 200ul裂解液(其中探針B濃度為lnmol/L)，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm離心20min，取上清，得到裂解上清液； 1.5 ml離心管中，+ 200ul裂解液(其中探針B濃度為lnmol/L)，用吸頭搗碎組織，室溫振蕩IOmin,4°C>15000 rpm離心20min，取上清，得到裂解上清液；(2)取步驟(I)裂解上清液20uL至錨定PCR管中，6(T70°C保溫進(jìn)行雜交反應(yīng)5 15min，反應(yīng)結(jié)束后吸干管內(nèi)液體，以洗滌液洗滌T9次，吸干，加入20uL由PCR緩沖液和PCR引物(PCR反應(yīng)液中引物對(duì)濃度為0. 2umol/L)配制的PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SYBR熒光定量分析；在雜交反應(yīng)之后，通過(guò)多次反復(fù)的洗滌，在洗去未雜交結(jié)合的核酸的同時(shí)，也洗去了其他可能干擾PCR反應(yīng)的物質(zhì)，從而保證了 PCR反應(yīng)的特異性和成功率;(3)以空白裂解液作為陰性對(duì)照，按照步驟(I)和(2)方法進(jìn)行處理和分析，以空白裂解液Ct值減去樣本Ct值的差值大于或等于1，判斷樣品為陽(yáng)性。所述PCR擴(kuò)增條件如下93°C預(yù)變性3min ;然后93°C 3s、66°C 30s, 35個(gè)循環(huán)。本發(fā)明采用最新的預(yù)備模板PCR (Template-Ready PCR，TRPCR)技術(shù)，整個(gè)PCR的前處理流程被簡(jiǎn)化成裂解保溫洗滌等3步簡(jiǎn)單操作，耗時(shí)由常規(guī)的4個(gè)小時(shí)以上，減少到50分鐘以下，不需要純化RNA，不需要去除DNA，不需要對(duì)RNA進(jìn)行特別的保護(hù)，不需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因此，操作簡(jiǎn)單，快速，標(biāo)準(zhǔn)化程度高。由于RNA的利用率高，引物是特別優(yōu)化設(shè)計(jì)，且通過(guò)洗滌步驟能去除各種干擾因素，PCR的特異擴(kuò)增效率得到了很大的增強(qiáng)。


圖I為本發(fā)明原理示意圖；A:探針A;B:探針B;C:固定介質(zhì)；P1/P2:引物對(duì)；RNA:目標(biāo)RNA; IIII:雙鏈互補(bǔ)雜交結(jié)合。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :洗滌去除非固定的探針B用于檢測(cè)hTERT mRNA 的探針 B : 5’ -CAGGAGCAGCATTCCATCACGCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG-3’，陰影部分為與 mRNA 結(jié)合的互補(bǔ)序列，兩端為 PCR 引物序列。PCR 引物TABl CAGGAGCAGCATTCCATCACG, TAB2 CCTTCTCTGGACCTGCGACG。肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞于24孔板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，1000個(gè)細(xì)胞/孔，過(guò)夜培養(yǎng)后，吸去培養(yǎng)液，+ 200ul裂解液B (裂解液添加探針B濃度為lnmol/L)，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移到I. 5ml離心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm離心20min，取上清，得到細(xì)胞裂解上清液；裂解液B組成如下1%SDS,500mmol/L NaCl,2mmol/L MgCl2,10mmol/L 2-巰基こ醇，O. lmg/ml 魚精 DNA (Sigma 公司)，O. 1% Tween20,1% 脫脂奶粉，lnmol/L 探針 B，溶劑為10mmol/L、pH7.5 的 Tris-HCl ；取50ul的上述的細(xì)胞裂解液上清，其中含有l(wèi)nmol/L的探針B，加到0. 2ml的PCR薄壁管中，66°C保溫lOmin，再吸干管內(nèi)液體，以TBST緩沖液洗滌1，3，5，7，9或12次，加入50ul PCR反應(yīng)液(50ul PCR緩沖液+引物對(duì)0. 2umol/L)，進(jìn)行PCR程序(94°C 3min預(yù)變性，然后40個(gè)循環(huán)的94°C 3s,66°C 30s，ニ步法)，以SYBR green I熒光定量分祈，結(jié)果顯示洗滌次數(shù)達(dá)到及超過(guò)5次，探針B不再有強(qiáng)于空白対照的擴(kuò)增信號(hào)(Ct值與空白相當(dāng))，表明洗滌步驟可以徹底洗掉不結(jié)合的探針DNA。
洗滌次數(shù)Ct-空白対照Ct-探針B
I29.1115.15
328.2421.33
528.5427.25
728.7328.31
929.3128.63
1228.7128.32空白対照的Ct值(來(lái)源于引物ニ聚體)在28. 2Γ29. 31之間。當(dāng)洗滌次數(shù)達(dá)到及超過(guò)5次，探針B的Ct值為27. 25 28. 63，與空白対照的值相當(dāng)，說(shuō)明不再有特異擴(kuò)增。TBST 緩沖液組成150 mmol/L NaCl, 0. 05% Tween 20，溶劑為 10 mmol/L、pH7.5Tris-HCl ；PCR 反應(yīng)液(SYBR 熒光定量)組成50mmol/L KC1，I. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/LdNTP，5% DMS0,0. 05% Tween20,0. 4X SYBR Green 1,0. 5U/20ul Taq酶，0. 2umol/L引物對(duì)，溶劑為 10mmol/L、pH9. 0 的 Tris-HCl。實(shí)施例2 :磁珠法制作錨定管用于錨定hTERT mRNA 的探針 A : 5，- GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA。TBST緩沖液20ul，含有IOug Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠和2pmol生物素化的探針A (生物素化的探針A由合成時(shí)直接修飾加在5’端)，裝入O. 2ml的PCR薄壁管中，室溫lhr，以磁鐵將磁珠吸附在管壁內(nèi)，吸干管內(nèi)液體，加50ul TBST緩沖液，打勻，吸干，如此反復(fù)洗滌共6次，最后吸干；加50ul TE緩沖液，備用。細(xì)胞裂解24孔板細(xì)胞培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，+ 200ul裂解液B (同實(shí)施例I )，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移到I. 5 ml離心管中，冰上20min, 4°C> 15000 rpm離心20min,取上清,得到細(xì)胞裂解上清。然后以磁鐵將磁珠吸附在管壁內(nèi)，吸干管內(nèi)液體，加入20ul細(xì)胞裂解上清，其中含有探針B，66°C保溫5min，再以磁鐵將磁珠吸附在管壁內(nèi)，吸干管內(nèi)液體，以TBST緩沖液洗滌6次，加入20ul PCR反應(yīng)液(SYBR熒光定量)，進(jìn)行PCR程序(95°C 2min預(yù)變性，然后40個(gè)循環(huán)的95°C 3s,66°C 30s, ニ步法)，SYBR熒光定量分析。用這種方法，對(duì)1(Γ10000個(gè)A549細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，可以得到陽(yáng)性結(jié)果(細(xì)胞裂解液上清的Ct值小于空白裂解液的Ct值)。
權(quán)利要求
1.ー種端粒酶催化亞基(hTERT) mRNA的預(yù)備模板PCR檢測(cè)試劑盒，主要包括 (1)管內(nèi)固定有探針A的錨定PCR管；所述探針A核苷酸序列如下5’-GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3’ ； (2)探針B，其核苷酸序列如下5，-CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGTTTCGGCG-3，； (3)PCR 引物NTPl :5，- CCGGAGGAAAGCGTGGACACC -3，NTP2 :5， - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3，； (4)裂解液; (5)PCR緩沖液； (6)洗滌液。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述裂解液組成如下1%SDS,500mmol/LNaCl, 2mmol/L MgCl2,1Ommol/L 2-疏基乙醇,O. lmg/ml 魚精 DNA, 0.1% Tween20,1% 脫脂奶粉，溶劑為 10mmol/L、pH7. 5 的 Tris-HCl。
3.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述PCR緩沖液組成如下50mmol/LKCl,I. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/L dNTP，5% DMS0,0. 05% Tween20,0. 4XSYBR Green I,0.5U/20ul Taq 酶，溶劑為 10mmol/L、pH9. 0 的 Tris-HCl。
4.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述洗滌液為TBST緩沖液。
5.利用如權(quán)利要求I所述試劑盒檢測(cè)端粒酶催化亞基mRNA的方法，所述方法包括 (1)取待測(cè)樣本，加入探針B和裂解液，反復(fù)吸打，轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置20min，4°C離心，取上清液，得到裂解上清液； (2)取裂解上清液20uL至錨定PCR管中，6(T70°C保溫5 15min，吸干管內(nèi)液體，以洗滌液洗滌3、次，吸干，加入20uL由PCR緩沖液和PCR引物配制的PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SYBR熒光定量分析； (3)以空白裂解液作為陰性對(duì)照，按照步驟(I)和(2)方法進(jìn)行處理和分析，以空白裂解液Ct值減去樣本Ct值的差值大于或等于1，判斷樣品為陽(yáng)性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增條件如下93°C預(yù)變性3min；然后93°C 38、66で308，35個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種端粒酶催化亞基(hTERT)mRNA的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，所述試劑盒主要包括(1)管內(nèi)固定有探針A(SEQ ID No.1)的錨定PCR管；(2)探針B(SEQ ID No.2)；(3)PCR引物(SEQ ID No.3/4)；(4)裂解液；(5)PCR緩沖液；(6)洗滌液。本發(fā)明與采用傳統(tǒng)的RT-PCR方法的試劑盒相比，采用本試劑盒不需要純化抽提RNA，不需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將原本長(zhǎng)達(dá)3個(gè)小時(shí)以上的PCR前處理過(guò)程縮短為約50分鐘，因此，操作簡(jiǎn)便快速易行，具有較高的RNA檢測(cè)的靈敏度和特異性，適合對(duì)各種來(lái)源的細(xì)胞， 包括從組織，痰液，血液等標(biāo)本中收集的細(xì)胞進(jìn)行hTERT mRNA的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851387SQ20121036976
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者陳燃, 伍迪, 金曉錚 申請(qǐng)人:浙江今復(fù)康生物科技有限公司