專利名稱：與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域的分子標記，特別涉及兩個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記。
背景技術：
黃瓜(Cucumissativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬(Cucumis) —年蔓生的草本植物，原產溫暖濕潤的喜馬拉雅山南麓的印度北部地區，傳入我國栽培已有2000多年的歷史，我國是黃瓜的次生起源中心。黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一。果實是黃瓜經濟性狀最重要的部分，黃瓜果實屬于瓠果，由子房和花托共同發育 而成。在黃瓜果實上有一個重要的性狀是果瘤,果瘤是黃瓜果實表面的瘤狀突起。果瘤基因的研究始于1913年,有果瘤是黃瓜的野生性狀,果瘤性狀是由Tu (Tuberculate fruit)基因調控，有果瘤(Tu)為顯性，無果瘤(tu)為隱性。2009年張微微等利用247個&群體將果瘤基因初步定位于第五染色體SSR標記16203和SCAR標記C_SC933之間，遺傳距離分別為
I.4cM和 5. 9cM,詳細結果可以參看；Zhang W W等在《Theoretical and Applied Genetics))(理論應用遺傳學)2009年第120卷第3期645-654頁發表的題為《Identificationand mapping of molecular markers linked to the tuberculate fruit gene in thecucumber (Cucumis sativus L.)》(黃瓜果瘤基因緊密連鎖分子標記初步定位)一文,上述標記還存在分析群體相對較小，連鎖距離相對較遠等問題。黃瓜育種中發現黃瓜果實均有刺，但是有些品種果實上沒有果瘤，刺和瘤是兩個不同的性狀，刺的形成是由Gl基因決定的，而Tu基因決定瘤的形成，雖然刺和瘤性狀是由不同的基因決定的，但有研究表明刺對于瘤具有隱性上位作用，曹辰興分離群體的遺傳分析結果表明控制莖、葉、果實表皮毛性狀的無毛基因對控制果瘤性狀的果瘤基因存在隱性上位作用(曹辰興等.黃瓜莖葉無毛性狀與果實瘤刺性狀的遺傳關系.園藝學報，2001，28(6) :565-566)。因此，果瘤基因Tu的研究將有助于揭示黃瓜果刺基因形成的分子機制，為黃瓜遺傳和育種工作奠定基礎。隨著生物技術水平的不斷發展，克隆目的基因的方法也層出不窮，圖位克隆方法利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因定位到染色體的一個具體位置的基礎上，通過構建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標記，不斷縮小候選區域進而克隆該基因。SSR(Simple Sequence Repeats)標記具有穩定性好、多態性高和廣泛適用的優點，找到與果瘤基因Tu緊密連鎖的標記，可為下一步圖位克隆這個基因打下堅實的基礎。隨著人們生活水平的提高，品質育種已提到重要位置。黃瓜果實刺瘤性狀屬于感觀品質范疇。歐美溫室類型的黃瓜為無果瘤、少刺的果皮，稱其為水果黃瓜，其市場價格為普通黃瓜的2-3倍。外觀光滑黃瓜污染少，清洗方便，食用衛生，是無公害蔬菜的理想品種。經檢測表明無瘤少刺黃瓜果肉農藥殘留量比有刺黃瓜低27%，果皮農藥殘留量低18%。黃瓜果瘤基因Tu控制果瘤的形成，它的研究將會推動品質育種進程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標記進行標記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中是十分有效的方法，分子標記是在DNA水平上對目標性狀進行選擇，具有高效、快速、不受環境條件限制等優點，可在苗期進行選擇，加快了育種的進程。

發明內容
本發明的目的，在于克服現有技術的不足，提供兩個與黃瓜果瘤基因Tu更緊密連鎖的分子標記。本發明是通過以下技術方案實現的一個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記，命名為Y32，由SEQ ID NO. I所示的DNA片段和SEQ ID NO. 2所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO. I所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO. 2所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。
上述與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記，由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物擴增得到。該引物由上海生工合成。一個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記，命名為Y46，由SEQ ID NO. 3所示的DNA片段和SEQ ID NO. 4所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO. 3所示的DNA片段與果瘤Tu連鎖，SEQ ID NO. 4所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。上述與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記，由SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物擴增得到。該引物由上海生工合成。本發明利用分子標記和染色體步移法，提供兩個與黃瓜果瘤基因Tu更緊密連鎖的穩定的SSR分子標記，果瘤基因Tu在提供的兩個分子標記之間，遺傳距離在O. 5cM之內，物理距離僅50Kb左右；由于所有兩個分子標記的開發均與已知的黃瓜基因組序列相關，由此而獲得的兩個分子標記之間的物理圖譜將有利于Tu基因的最終克隆，便于分子標記輔助育種體系的建立。本發明的分子標記可簡便、快速、高通量地應用于育種實踐。


圖I是Y32的PCR擴增結果標記圖；S52為有瘤親本；S06為無瘤親本R代表兩親本雜交后代；F2隨機擴增代表在F2群體中隨機挑選的19有瘤或無瘤植株PCR擴增結果。下面的條帶代表與果瘤基因Tu連鎖，上面的條帶代表與無瘤基因tu連鎖。圖2是Y46的PCR擴增結果標記圖；S52為有瘤親本；S06為無瘤親本R代表兩親本雜交后代；F2隨機擴增代表在F2群體中隨機挑選的19有瘤或無瘤植株PCR擴增結果。下面的條帶代表與果瘤基因Tu連鎖，上面的條帶代表與無瘤基因tu連鎖。圖3是黃瓜果瘤基因Tu的染色體步移示意圖Y32與Υ46代表與Tu基因緊密連鎖的分子標記，SSR16203與C-SC933代表已經公布的標記。拼接用到的是已經公布的黃瓜品種基因組序列(http://cucumber, vcru. wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html)使用的是 gyl4 品種的 Scaffold02633、Scaffold00154 和 9930 品種的 Scaffold000083、Scaffold000234中的序列，拼接后的序列總長度為1300kb。X代表F2群體剩余的交換株。
具體實施方式
一、遺傳分離群體的構建與交換單株的鑒定UF2群體的構建歐洲溫室類型自交系S06(母本)，表面光滑無果瘤，白刺較細小；華南類型自交系S52(父本)，表面有果瘤，黑刺較粗大，S06自交系和S52自交系已在《自然科學進展》2005年“黃瓜SRAP遺傳連鎖圖的構建及始花節位的基因定位”一文中公開(潘俊松等.黃瓜SRAP遺傳連鎖圖的構建及始花節位的基因定位.自然科學進展，2005，15，167-172)。本實施例利用這兩個親本配制了雜交組合，F1為有果瘤，黑刺較粗大，F1代自交產生F2代群體。在2200株F2個體中，鑒定有/無果瘤表型,卡方分析法進行驗證。2、交換單株的篩選 2. I黃瓜基因組DNA的提取常規方法一CTAB法提取親本及F2分離群體的葉片總DNA。2. 2標記掃描F2分離群體利用已經公開的與Tu基因連鎖的分子標記SSR16203和SCAR標記C_SC933和本發明中開發的兩個分子標記(Y32、Y46)掃描上述獲得的F2分離群體，尋找標記基因型(通過分析顯隱親本獲得)與性狀表現型(有瘤/無瘤)的差別單株，獲得標記與Tu基因的交換單株。PCR 體系基因組 DNA 30ng，引物 O. 2ymol/L，200ymol/L dNTPs, 2mmol/L MgCl2,I X Taq緩沖液，O. 5U TaqDNA聚合酶，總反應體系為10 μ L，其中TaqDNA聚合酶購于Promega公司。PCR擴增程序為-MV 5min ；35cycles,94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。上述PCR產物檢測方法為標記C_SC933使用3%瓊脂糖凝膠電泳顯示結果；其余(SSR16203、Y32、Y46)PCR產物使用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液為lXTBE，50W恒功率，電泳lh。電泳后進行銀染。銀染方法為將帶膠的玻璃板放入固定液中，在搖床上輕輕搖動至指示劑顏色褪去，其中固定液的組成為冰醋酸、無水乙醇、蒸餾水的體積比為I : 10 100 ;用超純水洗Imin 3min ;將沖洗后的膠板放入染色液中搖動半小時，其中染色液的組分為2g/L硝酸銀；將染色后的膠板放入超純水中漂洗5s后放入裝有顯影液的塑料盒中，輕輕搖動至條帶清晰，放入自來水中沖洗3min;室溫下干燥，干燥后拍照，其中顯影液是在IL蒸餾水中加入15gNaOH和3ml甲醛混勻得到的。2. 3多態性片段的回收、克隆和測序將多態性片段從聚丙烯酰胺凝膠上切下，置于離心管中，用槍頭搗碎，加入超純水沖洗三遍，然后加入IOul超純水95°C水浴15min，快速離心取上清液，用相對應的SSR引物進行PCR擴增，PCR反應體系為目標條帶DNA 5ul，引物O. 5 umol/L，200umol/L dNTPs,IXTaq Buffer, I. 5mmol/L MgCl2, 2U Taq DNA 聚合酶，總反應體系為 50ul，其中 TaqDNA聚合酶購于Promega公司。目標條帶PCR擴增程序為94°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；50°C 30s ；72°C Imin ；72°C 5min。將 PCR 產物中加入 goldview 熒光染料 3ul，4°C 下放置IOmin讓染料同DNA結合，然后加入上樣緩沖液2ul，混勻后通過I %瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下目標片段放入I. 5ml的離心管中，用DNA回收試劑盒回收，其中DNA回收試劑盒為上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，產品號為Cat. No. SK1132。將回收產物與載體連接采用上海申能博彩公司的PUCm-T vector系統。用電擊法將連有目標片段的T-vector轉化進入E. coli DH5 α感受態細胞，將菌液均勻涂布于LB固體培養基的平板上，涂好的平板倒置于37°C培養箱培養過夜，挑菌、搖菌及PCR菌液檢測，進行相關序列的測定。二、染色體步移與標記開發I、黃瓜基因組序列的兼并拼接利用已經公布的黃瓜品種9331和gyl4黃瓜基因組序列(http://cucumber, vcru.wise, edu/wenglab/gy 14-9930/index, html),將 SSR 分子標記 16203 序列掃描黃瓜基因組9930數據庫中得到Scaffold000083，將Scaffold000083的末端序列掃描黃瓜基因組gyl4數據庫得到Scaffold02633，將Scaffold02633的末端序列掃描黃瓜基因組9930數據庫得到Scaffold000234，將Scaffold000234的末端序列掃描黃瓜基因組gyl4數據庫得到 Scaffold00154。Scaffold00154 序列中含有 SCAR 標記 C_8C69 序列，用 DNAMAN 軟件對這4個Scaffold序列比對，兼并拼接得到SCAR標記C_SC69和SSR標記16203之間總長度1300Kb的序列。·
2、遺傳分子標記的開發本發明通過SSR分析軟件對獲得的1300Kb序列進行掃面分析，對獲得的SSR位點用弓I物設計軟件Primer Premier5. O對設計引物,在兩親本間進行PCR擴增并使用6 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。找出具有多態性的標記，再次篩選用SSR標記16203和SCAR標記C_SC933獲得的2200株群體里的交換株。位于基因兩側的多態性標記向交換株逐漸減少的方向步移，最后距尚果瘤基因Tu兩側最近的2個SSR位點在兩未本間廣生差異(圖I和圖2)，隨后對其進行測序并獲得SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 4中的序列信息，這兩個標記分別命名為Y32和Y46，標記Y32和Y46在2200株大群體中剩余的交換株分別剩余4株和2株。所有SSR標記PCR反應體系均為；黃瓜DNA 20ng,雙向引物各0.2“11101/1，20(^11101/1(1見138，211111101/11%(12，1\了&9緩沖液，0· 5UTaqDNA聚合酶，總反應體系為10 μ 1，其中TaqDNA聚合酶購于Promega公司。擴增程序為94°C 3min ；35cycles,94°C 20s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C 5min。以上兩個新開發的分子標記經過分離群體驗證，均與Tu基因位點緊密連鎖(圖3，圖中X表示剩余的交換株)。由于都是特異性PCR擴增，故這些標記具有高穩定。利用這些標記構建的高密度遺傳和物理圖譜，將有助于黃瓜果瘤基因Tu的最終克隆。本發明利用果瘤親本S52和無果瘤親本S06雜交獲得F1, F1再自交獲得2200株F2分離群體。利用已經公布的黃瓜品種9930和gyl4黃瓜基因組序列(http://cucumber,vcru. wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html)，能夠將 SCAR 標記 C_SC933 和 SSR 標記16203之間的序列兼并拼接。拼接所用的gyl4黃瓜基因組序列有Scaffold02633、Scaffold00154，拼接所用的 9930 黃瓜基因組序列有Scaffold000083、Scaffold000234,拼接后的序列總長度為1300kb。首先用已經公布的SCAR標記C_SC933和SSR標記16203篩選該擴大的群體，找出交換株。然后再用SSR分析軟件找出SSR位點，設計引物軟件，對1300kb序列分析設計了大量引物，找出親本間有多態性的引物，對交換株進行篩選和染色體步移，最后確定最近的兩側標記在Tu/tu基因位點間分別還有4和2個交換單株。上述黃瓜染色體步移的詳細情況如圖3所示。本發明中涉及的分子標記SSR標記16203和SCAR標記C_SC933已公開。詳細參看Zhang W W 等在《Theoretical and Applied Genetics))(理論應用遺傳學)2009 年第 120卷第 3 期 645-654 頁發表的題為《Identification and mapping of molecular markerslinked to the tuberculate fruit gene in the cucumber (Cucumis sativus L.)))(黃瓜果瘤基因緊密連鎖分子標記定位)一文。本發明中PCR產物克隆測序中所使用的E. coli DH5 α菌株已在文獻《李欣，等。電轉化法制備高轉化效率的Ε. coli感受態細胞研究。食品與生物技術學報，2007，26 (6) 48 51》中公開；本發明中涉及的Ε. coli DH5a菌株可通過公開市售的商業渠道取得，購于寶生物工程(大連)有限公司，公司地址大連經濟技術開發區東北二街19號。
權利要求
1.一個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記，命名為Y32，由SEQ ID NO. I所示的DNA片段和SEQ ID NO. 2所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO. I所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO. 2所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。
2.根據權利要求I所述的與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記，其特征在于由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物擴增得到，其PCR擴增程序為94°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
3.一個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記，命名為Y46，由SEQ ID NO. 3所示的DNA片段和SEQ ID NO. 4所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO. 3所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO. 4所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。
4.根據權利要求3所述的與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記，其特征在于由SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物擴增得到，PCR擴增程序為 940C 5min ；35cycles,94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
全文摘要
兩個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標記，第一個命名為Ｙ32，由SEQ ID NO.1所示的DNA片段和SEQ ID NO.2所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO.1所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO.2所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。第二個命名為Ｙ46，由SEQ ID NO.3所示的DNA片段和SEQ ID NO.4所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO.3所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO.4所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。本發明的兩個分子標記Y32和Y46與已經公開的SCAR標記C_SC69和SSR標記16203相比，與Tu基因位點的連鎖更加緊密，已經將Tu基因定位在50Kb區間，對關于有瘤/無瘤的黃瓜分子標記輔助育種體系的建立更有幫助。
文檔編號C12N15/11GK102925435SQ201210382890
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者楊緒勤, 潘俊松, 何歡樂, 蔡潤, 李月 申請人:上海交通大學