專利名稱：與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，涉及黃瓜常規雜交育種、分子標記輔助育種的方法與技術，特別涉及與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段。
背景技術：
1999年秋天在45株黃瓜育種材料中發現了 3株具“無毛”性狀的突變體，遺傳研究表明，無毛性狀是由一對核基因控制的隱性性狀，與曹辰興(1999年)的研究結果相一致。黃瓜無毛突變體與普通黃瓜相比，幼苗的各種性狀均沒有明顯變化，整株任何地方均無短剛毛，手感光滑，無扎手感覺，此特點在幼苗子葉展平時就可以與普通黃瓜苗區分。 黃瓜無毛突變體最早由Robinson和Mishanec (1964)報道(通過福射誘變產生)，表現為莖、葉、卷須、花萼、子房均沒有表皮毛，果實表面也沒有果刺和果瘤，并將該隱性突變基因命名為glabrous (gl)。Whelan (1973)、曹辰興和郭紅蕓(1999)也先后發現黃瓜無毛突變體。Inggamer&Ponti (1980)報道的葉片無毛突變體(gl_2)黃瓜NCG-042表現為果柄、花柄、花萼上有稀疏的絨毛，果實上有稀少的果瘤，但是莖、葉及葉柄光滑無毛。研究表明，無毛基因對果瘤基因存在隱性上位作用，參與黃瓜果瘤的形成(曹辰興等，2001 )。關媛(2008)利用棉花和擬南芥TTGl基因對黃瓜進行同源克隆，得到一個黃瓜TTGl-Iike基因——CsTTGl，功能驗證表明CsTTGl可以互補擬南芥ttgl突變體的表型，但是表達分析證明引起gl突變的基因不是黃瓜TTGl-Iike基因。張弛等(2009)以曹辰興和郭紅蕓發現的無毛突變體和普通有毛黃瓜為親本，獲得了兩個與gl基因連鎖的SRAP標記ME6EM5和ME230D15，遺傳距離分別為3. 6cM和12. 9cM。苗晗等(2011)以黃瓜有毛野生類型‘9110Gt’ (Pl)和無毛突變體‘NCG-042’ (P2)(含有葉片無毛基因gl_2)為試材，明確了黃瓜的有毛、無毛性狀(gl-2)由一對核基因控制，有毛對無毛為顯性。并以F2為作圖群體，構建了包含18個SSR標記的gl-2基因的SSR連鎖群，并將該基因定位在黃瓜第2條染色體上，兩側最近的連鎖標記為SSR10522和SSR13275，遺傳距離分別為O. 6cM和3. 8cM。由于無毛性狀是由一對核基因控制的隱性性狀，非常適合作為形態標記、純度鑒定的標記性狀。因此，對黃瓜無毛性狀的研究，特別是確定與黃瓜有毛基因緊密連鎖的SSR片段對黃瓜生產和育種都具有重要的理論和實踐意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段。本發明的第二個目的是提供一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段的用途。本發明的技術方案概述如下一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段，所述基因片段是SEQ ID No. I所述的序列。上述基因片段在對黃瓜種質資源進行有毛性狀篩選或對黃瓜有毛性狀進行分子標記輔助育種的用途。
利用本發明的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段對構建的F2代分離群體和黃瓜種質資源進行有毛性狀評價，其結果與表型鑒定符合率達100% (數據見表1)，在黃瓜育種中進行資源有毛性狀篩選和利用具有很大的應用價值。以這些序列為依據，可以進行有毛性狀分子標記輔助選擇、育種；可以為進行黃瓜有毛基因定位、作圖與克隆，通過基因工程改良黃瓜品種的性狀奠定基礎。


圖I是本發明的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段的獲得圖譜其中A(M)為指示DNA標準條帶的Marker ^(P1)為母本F80有毛基因片段；1_5為有毛單株；6_10為無毛單株，M為DNA標準。圖2是F80 XF80WM雜交后代F2代分離情況圖譜其中A (M)為DNA標準；C為F2群體中有毛基因片段，I 32、42 53、78 93為有毛單株，33 41、54 77為無毛單株。
具體實施例方式本發明是在對黃瓜有毛親本F80和無毛親本F80WM及其雜交后代F1、F2、BC1群體進行人工觀察鑒定，獲得黃瓜無毛種質的基礎上，采用SSR技術分離與黃瓜有毛基因連鎖的基因片段，進行測序、分析，為種質資源的篩選、分子標記輔助育種奠定基礎。為了實現以上目的，本發明采用SSR (Simple sequence repeat)分子標記技術，采用BSA法對黃瓜種質F80的有毛相關基因和黃瓜種質F80WM的相關基因進行了分子標記研究。獲得與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因DNA片段I個，對這個片段測序后，其大小為164bp (SEQ ID No. I所述的核苷酸序列)。本發明獲得的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因序列的具體操作步驟如下I. F2分離群體的構建及表型鑒定利用黃瓜有毛親本F80和無毛親本F80麗雜交獲得F1, F1自交獲得F2。田間種植F2群體，正常管理。第2真葉時肉眼觀察并借助顯微鏡觀察F2單株分離情況。2. DNA提取及SSR分析體系剪取黃瓜幼嫩小葉，采用CTAB法單株提取DNA，_20°C保存。PCR 反應體系為 20 μ I，黃瓜基因組 DNA20ng、SSR 引物各 50ng、dNTPO. 2mM、Mg2+1. 5mM、l倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶I. 6單位；反應條件為94°C預變性300秒，94°C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，35個循環，再72 °C延伸350秒。3. SSR弓丨物篩選和驗證在抗感親本間篩選1164對SSR引物和29對EST-SSR引物，在雙親間產生多態性的引物15對，其中引物SSRO1647在兩親本以及F2極端個體單株進行PCR擴增，獲得了一個顯性SSR標記，用該引物組合分別對組外的其它F2單株以及育種和生產上的有毛高代自交系進行擴增，進一步確認所篩選到的標記。結果表明有毛親本和有毛單株擴增出164bp的特異片段，無毛親本和無毛單株未擴增出該特異片段。經組外其余F2單株和育種自交系分析，所篩選到的標記與目標基因一黃瓜有毛性狀相關基因緊密連鎖，符合率為100%。所用SSR引物SSRO1647的堿基序列為
Pl:5，-CACCCTCTCACTTGTAGCCC-3 丨(SEQ ID No.2)P2 5' -CGATCAGAAGGGGGAAAAA-3 ; (SEQ ID No. 3)4. PCR產物的回收和測序將擴增產物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95°C變性300秒，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在可見光下觀察。采用煮沸法將目的片段從銀染膠上回收、擴增，送至北京三博遠志生物工程公司進行測序。5.序列分析根據測序結果，與黃瓜有毛基因緊密連鎖的特異片段有164個堿基(SEQ ID No. I·所示)。下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例I采用BSA法，以黃瓜有毛親本F80和無毛親本F80WM及其184株F1代分離群體為試材，采用CTAB法提取黃瓜基因組DNA。以1164對SSR引物和29對EST-SSR引物進行PCR擴增，根據特異DNA片段在F2代分離群體中的表現情況，對照以上的苗期人工表型鑒定結果，獲得與黃瓜有毛基因緊密連鎖的SSR標記SSR01647以及與有毛基因緊密連鎖的DNA片段(SEQ ID No. I 所示)。實施例2用保存于天津科潤黃瓜研究所育種一室的有毛黃瓜種質資源W43、G5、XL6_1_2、Q12、P57-1、P59-1-1、P60-1-1、P62-l-l、66、F51、Q6、Q21 等。根據實施例 I 獲得的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的SSR特異弓I物SSRO1647，對上述黃瓜材料基因組DNA進行PCR擴增，凡擴增產物出現164bp的特異片段的材料，為有毛黃瓜資源；凡未擴增出164bp產物特異片段的材料，為無毛黃瓜資源。表IF2單株表型及標記分離統計
權利要求
1.一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段，其特征是所述基因片段是SEQ ID No. I所述的序列。
2.權利要求I所述基因片段在對黃瓜種質資源進行有毛性狀篩選或對黃瓜有毛性狀進行分子標記輔助育種的用途。
全文摘要
本發明公開了一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段及用途，所述基因片段是SEQ ID No.1所述的序列。利用本發明的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段對構建的F2代分離群體和黃瓜種質資源進行有毛性狀評價，其結果與表型鑒定符合率達100%，在黃瓜育種中進行資源有毛性狀篩選和利用具有很大的應用價值。以這些序列為依據，可以進行有毛性狀分子標記輔助選擇、育種；可以為進行黃瓜有毛基因定位、作圖與克隆，通過基因工程改良黃瓜品種的性狀奠定基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102757959SQ20121026013
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年7月25日
發明者李淑菊, 楊瑞環, 王惠哲, 管煒 申請人:天津科潤農業科技股份有限公司