專利名稱：基于mp基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光pcr檢測方法及探針和引物組合的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測方法，以及在該方法中應用到的檢測用探針和引物組合。
背景技術：
黃瓜綠斑駁花葉病毒{Cucumbergreen mottle moasic virus, CGMMV)隸屬番爺叢矮病毒科{Tombusviridae)煙草花葉病毒屬(TbAaffioriry1S),是嚴重危害葫蘆科作物的重要病毒之一，為典型的種傳病毒。該病毒于1935年在英國的黃瓜上首次發(fā)現(xiàn)并報道，因此命名為黃瓜病毒3 (CV3)和黃瓜病毒4(CV4)，由Anisworth記述。CGMMV株系眾多，包括英國和歐洲早期報道的典型株系{Cucumber green mottle mosaic、黃瓜桃葉珊瑚花葉株系{Cucumber aucuba ,日本報道的西瓜株系(Watermelon strain)和日本黃瓜株系(Japanese cucumber strai/ )、洋東株系(Jodo strain)以及印度C株系{Indian strain C)。韓國報道了 CGMMV-KW、CGMMV_KM4、CGMMV-HY 和 CGMMV-K0W 等株系。近幾年中國也有一些不同地理株系的報道，如分離自廣西、遼寧等地的CGMMV-GX、CGMMV-LN、Liaoning 等。黃瓜綠斑駁花葉病毒在世界范圍內廣泛分布，主要分布于歐洲的英國、德國、荷蘭、丹麥、芬蘭、瑞典、希臘、俄羅斯、羅馬尼亞、西班牙，南美的巴西，亞洲的以色列、巴基斯坦、伊朗、印度、沙特阿拉伯、日本、韓國等國家和地區(qū)。1987年中國臺灣已有該病毒的報道。近年來在我國遼寧、廣西、廣東部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病毒為害，造成西瓜、黃瓜、甜瓜、南瓜等農(nóng)作物不同程度的減產(chǎn)甚至絕收，經(jīng)濟損失非常嚴重。CGMMV的寄主范圍比較窄，包括藜科、茄科和葫蘆科植物，主要侵染葫蘆科的黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜、苦瓜、絲瓜、`西葫蘆和葫蘆等植物。CGMMV侵染引起的癥狀因寄主、環(huán)境及株系的不同而有差異，一般造成植株生長緩慢、矮化，葉片斑駁、凹凸、畸形及水皰，果肉變色、腐爛及纖維化。侵染黃瓜后在新葉上出現(xiàn)黃色的小斑點，后期呈花葉并帶有濃綠色的突起，葉脈間褪色為綠帶狀；植株矮化，果實受損嚴重，表面上產(chǎn)生銀白色條斑，產(chǎn)量可下降15% ;侵染西瓜后表現(xiàn)為輕型葉斑駁，植株矮化，果實成熟期癥狀嚴重，果實表面形成濃綠色圓斑，內部出現(xiàn)果肉變色和腐爛。在甜瓜上造成莖端新葉出現(xiàn)黃斑，但隨葉片老化癥狀減輕。南瓜植株感病后表現(xiàn)為矮化、綠脈和花葉的等癥狀。黃瓜綠斑駁花葉病毒主要存在于花粉、種皮、病苗的胚軸、葉片、果實等組織中。是典型的種傳病毒，黃瓜新鮮種子的傳毒率為8%，保存5個月之后下降到1%，西瓜種子傳毒率為5%，土壤帶毒率很低。黃瓜葉甲有可能是媒介昆蟲，目前沒有蚜傳的報道。介體菟絲子主要包括 C subinclusa 和 C. campestris。CGMMV引起的病毒病在其發(fā)生歷史上造成過嚴重危害。1935年英國最早報道在黃瓜上發(fā)生；1969年日本報道過該病的發(fā)生，當時被稱為“魔芋病”；1974年德國溫室黃瓜受到該病毒的影響面積達5% ;1976年前蘇聯(lián)Georgia地區(qū)黃瓜上的發(fā)病率達到80 100%，導致黃瓜減產(chǎn)30% ；1989年韓國報道該病在大田作物上大面積蔓延，造成巨大經(jīng)濟損失，1998年又在韓國的西瓜和黃瓜上為害，受災面積達到463hm2，引起“西瓜血瓤病”，造成巨大損失。1987年中國臺灣有該病發(fā)生危害的報道；2003年在廣西的溫室南瓜上分離到該病毒；2005年遼中地區(qū)的西瓜上大面積發(fā)生，造成嚴重危害，這是大陸首次在大田發(fā)生該病的報道。2004 2006年廈門出入境檢驗檢疫局多次從日本進境的南瓜種子中截獲該病毒。2009年甘肅局在進口自俄羅斯的黃瓜種子中到截獲該病毒。2007年農(nóng)業(yè)部862號公文《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》將其列為重要的對外檢疫性有害生物。CGMMV為直桿狀病毒，粒子大小約300 X 18nm，核酸為線性單正鏈RNA，基因組長度約為6. 5kb，為單組份。基因組編碼4個蛋白分子，靠近5’端的126kDa和183kDa兩個蛋白與病毒的復制有關，其中183kDa是由126kDa蛋白終止子超讀產(chǎn)生的；另外兩個蛋白分別為約 30kDa 的運動蛋白(Movement protein, MP)和 17. 5kDa 的外殼蛋白(Coat protein,CP)，這兩個蛋白分別由不同的亞基因組RNA表達產(chǎn)生。病毒基因組5’端和3’端分別含有一段非編碼區(qū)(Noncoding region，NCR)，5’端含帽子結構，3’端有一個可以接受組氨酸的類似tRNA狀結構。半個世紀來，現(xiàn)代病毒學研究水·平不斷提高，病毒的檢測技術也在不斷發(fā)展和改進。目前病毒的檢測方法主要包括枯斑和指示植物檢測法，血清學檢測法，酶標免疫吸附法(ELISA)，電鏡負染檢測法，免疫電鏡檢測法，電鏡超薄切片法以及常規(guī)PCR檢測方法。C. Varveri 米用 DAS_ELISA( Double-antibody sandwich ELISA)和F(ab’)2-ELISA兩種酶聯(lián)免疫吸附法對希臘分離物進行檢測，并比較了兩種方法的檢測靈敏度，后者比前者靈敏性高出IO3倍；Shim用DAS-ELISA方法對來自葫蘆上表現(xiàn)CGMMV癥狀的樣品進行了定性檢測；Choi等將RIPA (Radioimmunoprecipitation Assay,放射免疫沉淀檢測法)發(fā)展為mult1-RIPA技術，并同時檢測西瓜、黃瓜、西葫蘆和瓠子上的CGMMV，mult1-RIPA 檢測 CGMMV 的最低量為 5OngAil ；Kawai 等使用 M-ELISA ( modified ELISA)檢測黃瓜種子，結果比標準ELISA更靈敏，其靈敏度相當于檢測到800粒健康種子中的I粒病種。血清學方法是目前普遍運用的常規(guī)檢測方法，可操作性強，檢測結果相對可靠。但是該方法成本較高，周期性長，且靈敏度有限，難以檢測含量很少的病毒。RT-PCR是反轉錄RNA和利用單鏈寡核苷酸弓I物對特異性DNA片段進行體外快速擴增的方法。張永江等(2008)對葫蘆、西瓜、甜瓜3種作物的不同種質資源以及同種種質資源的不同處理進行了 DAS- EL IS A和RT-PCR檢測，結果顯示受侵染的不同種質資源均可帶毒，而RT-PCR方法的靈敏度遠高于ELISA，并且建立了直接從葫蘆種子中檢測CGMMV的技術方法。黃靜等(2007)用該方法檢測了黃瓜、葫蘆、南瓜三種作物的病葉和莧色藜枯斑中的CGMMV病毒，均可以擴增到650bp的目的條帶，但是條帶清晰度一般，說明檢測水平有限。此外，保存于_20°C中的冷凍黃瓜病葉經(jīng)多次試驗均無目的條帶，不能對試驗條件下保存的樣品進行準確檢測是該方法的一大缺陷。李紅霞等(2007)運用RT-PCR方法對采自甘肅的南瓜果實進行檢測，檢測結果證明果實中存在CGMMV病毒。Slavokhotov等(2007)針對CP基因設計引物，采用RT-PCR方法檢測到了分離自俄羅斯的兩個CGMMV病毒株系。Chang等(2005)采用RT-PCR方法從韓國西瓜葉片中檢測出CGMMV病毒，得到646bp的CP基因，明確為 CGMMV-HYI 株系。鄧叢良等(2008)將納米磁珠(Magnetic Nano Particles, MNP)和RT-PCR結合，建立了檢測CGMMV的新方法。用納米磁珠提取陽性材料中的RNA，用三組引物分別進行RT-PCR擴增，檢測CGMMV并進行靈敏度測定，結果發(fā)現(xiàn)該方法可以檢測出IOng植物葉組織中的CGMMV，靈敏度是常規(guī)檢測方法的1/10。雖然在RNA提取過程中節(jié)省了時間和步驟，但是該方法依賴高靈敏度的抗體，提高了成本，且在檢測靈敏度并沒有良好的改觀，所以普及和運用受到限制。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種針對CGMMV的運動蛋白基因(MP gene)設計一對特異性檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物和熒光探針，并優(yōu)化反應體系和反應程序，建立了實時熒光RT-PCR快速檢測CGMMV病毒的方法。特異性測試結果表明該方法具有很強的特異性，可以從TMV屬中10多種病毒中特異性檢出CGMMV病毒，并且可同時檢測四個CGMMV的不同分離物。該方法靈敏性遠高于常規(guī)RT-PCR方法的檢測結果，同時該方法也可直接運用于葫蘆科帶毒種子的檢測，大大縮短了檢測時間，檢測結果準確可靠。1996年美國Applied Biosystems公司推出實時突光定量PCR技術(Real - timefluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q - PCR)，即在PCR檢測過程中加入熒光染料或熒光基團，利用熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR反應過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。該技術實現(xiàn)了 PCR方法從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有靈敏度高、特異性強、重現(xiàn)性強、快速高效、成本低廉、自動化程度高、有效解決PCR污染問題等特點，現(xiàn)已廣泛運用于 人類疾病、動物病毒、及動植物疾病檢測和預防等諸多領域。本發(fā)明所采用的技術方案是該基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測用探針和弓I物組合包括上游弓I物MMV-Fl、下游引物MMV-Rl和熒光探針MMV-1，其序列分別如下
MMV-Fl :5’ - CACCTTTATGTCACATTGTTG-3’ ；
MMV-Rl :5’ - GAATGCATCCTTGTGTCAAC -3’ ；
MMV-1 :5’ -FAM-CTACAGGATTCCGGTACGTTCCAT-TAMRA-3’。所述基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測方法包括以下步驟
(1)取待測樣品提取植物組織總RNA；
(2)以總RNA為模板，引入所述下游引物MMV-Rl進行反轉錄模板cDNA的合成；
(3)將所述上游引物MMV-Fl、所述下游引物MMV-Rl和所述熒光探針MMV-1置于熒光PCR儀中進行實時熒光PCR擴增反應；
(4)反應結束后，熒光PCR儀讀取CT值并判斷檢測結果。在上述步驟(2)中進行反轉錄模板cDNA的合成時，其反應體系為Total RNA
2.5 ii L，5 X PCR 緩沖液 2iiL，dNTP I y L，下游引物 MMV-Rl (10 u mol/L) 2 y L，反轉錄酶
0.L，加 ddH20 至總體系 IOii L ;反應條件37°C 15min，85°C 5sec，16°C 30sec，反應結束后將模板于_4°C保存?zhèn)溆谩Ｔ谏鲜霾襟E(3)中的實時熒光PCR反應體系為2Xpremix Taq(Real Time)混合反應液 10 u L，上下游引物(MMV-F1, MMV-Rl, 10 u mol/L)各1. 25 y L，熒光探針MMV-1 I u L，模板 cDNA 2iiL，加 ddH20 補足到 20iiL;反應條件為95° C，30s;95。C 5s,60° C 30s，45個循環(huán)。上述步驟中，所述上游引物MMV-Fl和所述下游引物MMV-Rl的使用濃度范圍為
0.1 0. 8 u mol/L。進一步地，所述上游引物MMV-Fl和所述下游引物MMV-Rl的使用濃度均為
0.5 u mol/L。所述熒光探針MMV-1的濃度范圍為0. 05 0. 5 ii mol/L。更進一步地，所述熒光探針MMV-1的濃度范圍為0. 25 U mol/L。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明針對檢疫性有害生物黃瓜綠斑駁花葉病毒(.Ccucumber green mottle mosaic virus，CGMMV),設計了特異性引物和突光探針,建立了實時熒光PCR快速檢測CGMMV的方法，并將該方法直接運用于帶毒種子的檢測。該方法具有快速準確、靈敏度高、并且全程閉管，無需電泳檢測等優(yōu)點，減少了有毒試劑的接觸，檢測時間也縮減到2個小時之內，極大的提高了效率。整個過程采用熒光信號放大及計算機全程控制，減少人為誤差，提高了靈敏度，試驗證明該方法比體系優(yōu)化過的普通RT-PCR靈敏度要高近100倍，適用于病毒低含量的檢測。


圖1是實時熒光PCR檢測CGMMV特異性檢測結果分析示意圖，其中，C4 :來自廣東雷州的黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-GD-LZ)，D4 :來自廣東高州的黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-GD-GZ), E4 :來自廣州陸豐的黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-( -LF)，E5 :來自Agdia的黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-DIA)，F(xiàn)4 :番茄花葉病毒(ToMV)，G4 :齒舌蘭環(huán)斑病毒(0RSV)，H4 :番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)，F(xiàn)5 =Kyuri綠斑駁花葉病毒(KGMMV)，G5 :小西葫蘆綠斑駁花葉病毒(ZGMMV)，H5 :煙草花葉病毒(TMV)，F(xiàn)6 :西瓜花葉病毒2號(WMV-2)，G6 :辣椒輕斑駁病毒(PMMV)，H6 :車前草花葉病毒(RMV)，F(xiàn)7 :土傳小麥花葉病毒(WSBMV)，G7 :標準對照組，H7 :水對照組；
圖2是帶毒種子中CGMMV病毒檢測結果分析示意圖，其中，D7:黃瓜帶毒種子I(CGMMV-Cul ),D8 :黃瓜帶毒種子 2 (CGMMV_Cu2)，D9 :黃瓜帶毒種子(CGMMV-Sq)，DlO :西葫蘆帶毒種子(CGMMV-Pu)，GlO :黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-GD-LZ)對照組，Gll :標準對照組，Dll :水對照組；
圖3是所述實時熒光PCR檢測CGMMV靈敏度的動力學曲線，其中，1-2 :CGMMV病毒10倍稀釋液；3_4 102倍稀釋液；5-6 103倍稀釋液；7-8 IO4倍稀釋液；9_10 105倍稀釋液；11-12 :1O6倍稀釋液；13-14 :1O7倍稀釋液；
圖4是所述實時熒光PCR檢測CGMMV靈敏度的標準曲線。
具體實施例方式下面對本發(fā)明做詳細的說明。該基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測方法包括以下步驟
一、選擇供試驗材料。本發(fā)明采用的供試驗的病毒樣品見表I。表I供試驗病毒樣品
權利要求
1.一種基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測用探針和引物組合，其特征在于，它包括上游引物MMV-F1、下游引物MMV-Rl和熒光探針MMV-1，其序列分別如下MMV-Fl :5’ - CACCTTTATGTCACATTGTTG-3’ ；MMV-Rl :5’ - GAATGCATCCTTGTGTCAAC -3’ ；MMV-1 :5’ -FAM-CTACAGGATTCCGGTACGTTCCAT-TAMRA-3’。
2.一種基于MP基因的利用如權利要求1所述的探針和引物組合對黃瓜綠斑駁花葉病毒進行實時熒光PCR檢測的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)取待測樣品提取植物組織總RNA； (2)以總RNA為模板，引入所述下游引物MMV-Rl進行反轉錄模板cDNA的合成； (3)將所述上游引物MMV-Fl、所述下游引物MMV-Rl和所述熒光探針MMV-1置于熒光PCR儀中進行實時熒光PCR擴增反應； (4)反應結束后，熒光PCR儀讀取CT值并判斷檢測結果。
3.根據(jù)權利要求2所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，在所述步驟(2)中進行反轉錄模板cDNA的合成時，其反應體系為Total RNA2. 5u L, 5父？0 緩沖液21^，(1見13 I yL，下游引物 MMV-Rl (10umol/L) 2 y L，反轉錄酶0. L，加 ddH20 至總體系 IOii L ;反應條件37°C 15min，85°C 5sec，16°C 30sec，反應結束后將模板于_4°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權利要求2所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，在所述步驟(3)中的實時熒光PCR反應體系為2Xpremix Taq(Real Time)混合反應液IOii L，上下游引物(MMV-F1,MMV-R1,10 u mol/L)各1. 25 y L，熒光探針MMV-1luL，模板 cDNA L，加 ddH20 補足到 20ii L ;反應條件為95° C，30s;95。C 5s，60。C30s, 45個循環(huán)。
5.根據(jù)權利要求2至4任一項所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述上游引物MMV-Fl和所述下游引物MMV-Rl的使用濃度范圍為0.1 0. 8iimol/L，所述熒光探針MMV-1的濃度范圍為0. 05 0. 5 y mol/L。
6.根據(jù)權利要求5所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述上游引物MMV-Fl和所述下游引物MMV-Rl的使用濃度均為0. 5 y mol/L。
7.根據(jù)權利要求6所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述熒光探針MMV-1的濃度為0. 25 u mol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于運動蛋白基因(MovementProtein,MP)的黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemoasicvirus,CGMMV)快速分子鑒定的PCR檢測方法及在該方法中應用到的引物和探針組合。本發(fā)明采用的引物和探針序列分別為上游引物MMV-F1、下游引物MMV-R1和熒光探針MMV-1；本發(fā)明方法包括以下步驟(1)取待測樣品提取植物組織總RNA，(2)以總RNA為模板，引入所述下游引物MMV-R1進行反轉錄模板cDNA的合成，(3)將所述上、下游引物和所述熒光探針置于熒光PCR儀中進行實時熒光PCR擴增反應，(4)反應結束后，通過收集的熒光曲線CT值與標準曲線CT值比較，判斷檢測結果。本發(fā)明可應用于生物物種分子診斷領域。
文檔編號C12N15/11GK103060476SQ201310026978
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權日2013年1月25日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 廖力, 王嵐, 梁玉英, 權永兵, 遲遠麗, 徐淼鋒 申請人:張衛(wèi)東, 廖力, 王嵐, 梁玉英, 權永兵, 遲遠麗, 徐淼鋒