黃瓜抗西瓜花葉病毒基因wmv的Indel標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明“黃瓜抗西瓜花葉病毒病基因wmv的Indel標記及其應用”，涉及生物技術輔助育種領域。黃瓜西瓜花葉病毒病(WMV)抗性基因wmv緊密連鎖的Indel標記，其中所述標記的引物的核苷酸序列為：wmvIndel3-F/wmvIndel3-R:AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG；所述Indel標記擴增的與黃瓜WMV感病基因WMV連鎖的特征條帶為173bp，核苷酸序列見Seq ID No.1；所述Indel標記擴增的與黃瓜WMV抗病基因wmv連鎖的特征條帶為169bp，核苷酸序列見Seq ID No.2所示；采用本發明獲得的Indel標記，可以在黃瓜候選材料的任何階段判斷其是否對WMV具有抗性，該標記具有高效、限制少的優點，對選育抗WMV的黃瓜育種材料提高了效率，縮短了育種周期。
【專利說明】黃瓜抗西瓜花葉病毒基因 wmv的Indel標記及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術輔助育種【技術領域】，特別涉及一種黃瓜中抗西瓜花葉病毒基 因 wmv的Indel標記及其在黃瓜育種材料選擇中的應用。

【背景技術】
[0002] 病毒病是影響黃瓜生產的主要病害之一，病原種類繁多，難以防治。其中西瓜花葉 病毒（Watermelon mosaic virus, WMV)就是引起該病的一種主要病原。WMV屬于馬鈴薯Y 病毒屬病毒，該病毒屬世界各地均有分布。在自然界，主要以非持久性方式經蚜蟲傳播，也 可以經汁液的機械接種傳染，可侵染葫蘆科、豆科、藜科等多種植物種類。感病植株葉片表 現花葉、畸形、新生葉片扭曲，植株生長受阻，果實畸形。
[0003] 目前，在黃瓜上已經挖掘了一些抗WMV的種質資源，而且前人也利用了其中一些 抗病材料對黃瓜WMV抗性遺傳規律及分子標記進行了初步研究，Cohen等（1971)研究發 現黃瓜栽培種Kyoto 3 Feet中存在抗WMV的顯性基因 ；Wai (1995a)和Grumet (1995b)在 TMG-I中發現WMV的抗性分兩種基因控制：一種是在子葉和全株均表現抗性的wmv-2,另一 種是只在真葉表現抗性的2個相互作用的上位基因 wmv-3和wmv-4。張海英等（2005)以感 病親本自交系歐洲八號和抗病親本自交系秋棚構建的RILs群體為材料，對WMV進行了抗病 性鑒定，研究表明抗病性狀是受隱性單基因控制的，但同時也存在微效基因的修飾。目前報 道的與WMV抗性相關的遺傳連鎖標記有AFLP、RAPD、SSR標記，但是這些標記與抗病基因連 鎖距離較遠，并不能有效地應用于實際育種工作中。


【發明內容】

[0004] 基于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供了一種與黃瓜中抗WMV基因 wmv緊密連鎖的Indel標記，并提供了該標記在篩選對WMV抗病或感病的黃瓜種質資源上的 應用。
[0005] 本發明的技術方案如下：
[0006] 一種與黃瓜抗西瓜花葉病毒基因 wmv連鎖的Indel標記，其特征在于：所述標記的 引物的核苷酸序列如下：
[0007] 碰vIndel3_F/VmvIndel3-R :
[0008] AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG
[0009] 所述引物擴增的與黃瓜感西瓜花葉病毒基因 WMV連鎖的特征條帶為173bp，其核 苷酸序列如Seq ID No. 1所示；
[0010] 所述引物擴增的與黃瓜抗西瓜花葉病毒基因 wmv連鎖的特征條帶為169bp，其核 苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0011] 所述Indel標記在篩選具有抗西瓜花葉病毒基因 wmv的黃瓜種質資源中的應用， 其特征在于，包括如下步驟：
[0012] (1)采用所述Indel標記的引物對待選黃瓜材料的基因組DNA進行PCR擴增；所 述標記的引物的核苷酸序列如下：wmvIndel3-F/wmvIndel3-R :
[0013] AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG ；
[0014] (2)對擴增結果進行凝膠電泳檢測；
[0015] (3)從檢測結果中篩選出現與抗西瓜花葉病毒基因 wmv連鎖的Indel標記特征條 帶一致的材料，所述抗西瓜花葉病毒基因 wmv連鎖的Indel標記特征條帶為169bp，其核苷 酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0016] 所述PCR擴增的反應體系為：1. 5ng/μ I DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/ μ 1，0· 5 μ 1/μ I Go Taq? Green Master Mix，其余為雙蒸水。
[0017] 所述PCR擴增的反應程序為：94°C預變性4分鐘；94°C變性15秒，55 °C退火15秒， 72 °C延伸30秒，35個循環；72 °C保溫5分鐘，16 °C保存。
[0018] 所述凝膠電泳檢測，指采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于150V恒功率電泳分 離，最后銀染顯色。
[0019] 本發明以感WMV高代自交系65G與抗WMV高代自交系02245為親本構建F1J 2群體 及F2:3家系，通過苗期人工接種鑒定和ELISA檢測，對黃瓜WMV抗性基因 wmv進行了遺傳規 律分析。以F2群體為作圖材料，利用BSA法和SSR及Indel標記技術，實現wmv基因在染色 體上的遺傳定位，并獲得緊密連鎖的Indel標記wmv-Indel3,與wmv的遺傳距離為I. 3cM。 所述Indel標記特異性引物擴增的與黃瓜WMV感病基因 WMV連鎖的特征條帶為173bp，核苷 酸序列如Seq ID No. 1 ;所述Indel標記特異性引物擴增的與黃瓜WMV抗病基因 wmv連鎖 的特征條帶為169bp，核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0020] 本發明通過利用54份不同遺傳背景的黃瓜資源進行驗證，結果表明wmv-lndel3 驗證的正確率為83. 3% ·
[0021] 本試驗不僅為黃瓜抗WMV基因 wmv的精細定位和分子克隆奠定了基礎，同時也為 利用分子標記輔助選育具有抗WMV基因的黃瓜新品種提供了高效途徑。本發明基于開發的 Indel標記引物提供用于輔助篩選具有特定WMV抗性的黃瓜新品種的方法，該方法中，采用 所述Indel標記的特異性引物擴增待測材料的DNA，然后對擴增產物進行電泳檢測，擴增產 物可能出現三種情況：第一種是僅僅出現一條169bp條帶，這種為隱型純合材料（抗WMV); 另一種是169bp條帶和173bp條帶都出現，這種是顯性雜合材料（感WMV);第三種是僅僅 出現173bp條帶，這種為顯性純合材料（感WMV)。通過本發明提供的方法，可以在黃瓜候選 材料的任何階段對其進行WMV抗性鑒定和篩選，具有高效、限制少、準確的優點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1.采用本發明所述的wmvlndel3標記的特異性引物驗證54份不同遺傳背景的 黃瓜材料的電泳檢測結果；
[0023] 黑體加粗字體對應的泳道為表型與標記條帶驗證不一致的單株。

【具體實施方式】
[0024] 下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細說明，但并不限制本發明的范 圍。如無特殊說明，下述實施例中使用的操作均為常規方法，所采用的試劑均可以商購獲 得。
[0025] 牛物材料的來源和記載出處
[0026] 本研究所用的試驗材料為黃瓜高代自交系65G和02245。以65G為母本，02245為 父本雜交，獲得F1，自交獲得F2群體及F2:3家系。
[0027] 黃瓜高代自交系65G(Pi):由中國農業科學院蔬菜花卉研究所選育的歐洲溫室型 黃瓜雌性系，生長勢強，連續座果多，瓜長20多厘米，表面光滑無刺瘤，無苦味，抗黑星病， 感西瓜花葉病毒病（WMV)。為現有已知品種，在顧興芳等人于2006年在《園藝學報》第3期 第690頁上發表的文章《黃瓜新品種'中農19號'》中也有記載。本實驗室有保存，保證自 申請日起二十年內向公眾發放用于驗證實驗。
[0028] 黃瓜1?代自受系02245 (P2):由中國農業科學院蔬菜花舟研究所選育的露地耐熱 抗病自交系，華北型黃瓜，耐熱性突出，分枝性強，腰瓜長約35厘米，刺瘤密，抗西瓜花葉病 毒病（WMV)，抗霜霉病，白粉病，枯萎病。為現有已知品種，在顧興芳等人于2008年在《中國 蔬菜》第6期第31-33頁發表的文章《耐熱黃瓜新品種中農106號的選育》中也有記載。本 實驗室有保存，保證自申請日起二十年內向公眾發放用于驗證實驗。
[0029] 54份不同遺傳背景的黃瓜材料的具體來源和出處詳見Zhang等于2010年在 ((Journal of the American Society for Horticultural Science〉〉第 135 期第 53-58 頁 發表的文章 《Genetic Mapping of the Scab Resistance Gene in Cucumber》。其中 29 份 為抗性材料，25份為感病材料。
[0030] 重測序的基因組信息詳見Qi等在《Nature Genetics》雜志2013年發表的論文 ((A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity))
[0031] Indel標記引物是本實驗室基于兩親本重測序的基因組信息、利用primer 3. 0軟 件設計得到。
[0032] 豐要試劑
[0033] SSR引物來自國際黃瓜基因組計劃（ICUGI) ;PCR實驗使用Shanghai PromeGa公 司的 GoTaq Green Master Mix ;
[0034] 凝膠電泳使用康潤公司的40%非變性聚丙烯酰胺，將其稀釋至6%后使用。
[0035] 實施例1.與黃瓜抗WMV基因 wmv連鎖的wmvlndel3標記的獲得
[0036] 步驟1.黃瓜WMV苗期抗性鑒定
[0037] 本試驗以黃瓜高代自交系65G(感病）和02245(抗病）為母本和父本，自交獲得 FpF2群體及F2:3家系。2013年秋，在中國農業科學院蔬菜花卉研究所病理課題組人工氣候 室對F1及137個F2:3家系進行WMV苗期人工摩擦接種，其中每個家系種植15株，待第一片 真葉展平時，進行接種鑒定。
[0038] 待第一次接種20天后，進行調查，將病情劃分為6個等級，分別為：0級，無癥狀；1 級，心葉明脈或輕花葉；3級，心葉及中部葉片花葉；5級，心葉及中部葉片花葉，少數葉片畸 形、皺縮；7級，重花葉，多數葉片畸形、皺縮；9級，重花葉，葉片明顯畸形，植株矮化，甚至死 亡。同時為了檢測接種植株中病毒的含量，在調查后，采用了酶聯免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)方法對黃瓜植株的心葉中的病毒含量進行檢測。根據調查 及ELISA檢測結果判斷植株對WMV是否有抗性，然后使用Microsoft Excel 2007及SAS9. 2 軟件進行數據統計分析，判斷分離比。
[0039] 結果顯不：后代F1均表現感病；由F2:3豕系鑒定結果，可推斷在F 2群體中，感病植 株有110株，抗病植株有27株。經卡方檢測，符合3:1比例，表明在該群體中WMV抗性是受 一對隱性基因控制。
[0040] 步驟2. DNA提取和分子標記分析
[0041] 取黃瓜植株的嫩葉，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨）法提取親本及群體 各單株的基因組DNA。
[0042] PCR反應體系為：總反應體系IOyL, 3μ L DNA(5. Ong · μ Γ1)，正向和反向引物 (50ng · yL1)各 lyL，5yL Go "Taq? Green Master Mix (Promega 公司產品）。
[0043] 引物使用黃瓜全基因測序開發的SSR引物（Ren et al. ,2009 ;Cavagnaro et al.， 2010)。
[0044] PCR 擴增程序為：94°C預變性 4min ;94°C變性 15s，55°C退火 15s，72°C延伸 30s，35 個循環；72°C保溫 5min，16°C forever。
[0045] 擴增產物用6 %非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳緩沖液為0. 5 X TBE，150V恒功 率電泳分離I. 5h，電泳后銀染顯色，統計帶型。
[0046] 步驟3.初步定位的SSR分子標記篩選、數據統計及連鎖圖構建
[0047] 共顯性標記的統計方法：與母本（65G) -致的帶型記為a，與父本（02245) -致的 帶型記為b，雜合的帶型記為h。顯性標記的統計方法：若母本為顯性標記，則分離群體中和 母本帶型一致的單株記為d，和父本帶型一致的記為b ;若父本為顯性標記，則分離群體中 和母本帶型一致的單株記為a，和父本帶型一致的記為c，未擴增出的或模糊不清的記為u。
[0048] 結果顯示：
[0049] 用1288對SSR引物對P1 ^5G)和P2 (02245)進行篩選，其中在兩個親本間表現多 態的引物有296對，多態率23. 0%。結合BSA法建池，進一步篩選得到了 8個SSR多態性標 記。
[0050] 利用篩選出的多態性標記對65GX02245組合的F2群體進行分析，結合調查性狀 數據利用J〇inmap4. 0構建連鎖圖。結果8個標記和目標性狀（抗WMV)基因 wmv被定位在 同一連鎖群上（L0D = 10)。
[0051] 將本試驗得到的連鎖圖與已發表的黃瓜遺傳圖譜（Zhang et al.，2012)比較，發 現本連鎖群的8對標記均分布在第6染色體，據此將wmv基因定位在第6染色體上。
[0052] 步驟4. Indel標記開發及wmv連鎖群分子標記加密
[0053] 針對初定位的染色體區段，結合黃瓜基因組序列和兩親本重測序的數據，利用 primer 3. 0軟件在目標區段（約2. 01M)共設計了 130對SSR標記引物和20對Indel標記 引物，對連鎖群進行分析標記加密。用雙親篩選出有多態性的有8對標記。上群體后得到 一個總長度為19. OcM包含12個標記（初定位的其中4對+新設計的8對）的連鎖群，獲 得與黃瓜抗WMV基因 wmv連鎖距離為I. 3cM的Indel標記wmvlndel3。
[0054] 步驟5. PCR擴增所得差異片段的回收純化及測序
[0055] (1)目的片段的回收
[0056] 采用煮沸法。具體操作為：先從膠上將目標條帶挖下來裝入I. 5mL的Eppendorf 管內，向管內加入100 μ L超純水，加水量視膠帶顏色深淺而定；常溫下浸泡24h，轉入95°C 水浴鍋（或PCR儀）中煮30min后，5000rpm離心3min。產物即可取上清3 μ L做模板進行 PCR擴增，剩余產物置-20°C保存備用。
[0057] (2)目的片段的純化
[0058] 用PCR產物直接純化方法。在PCR產物中加入2倍體積的無水乙醇，_20°C過夜放 置，1，2000rpm離心5min就可以得到純化產物。
[0059] (3)目的片段與載體的連接
[0060] 反應體系為 10 μ L :PMD18_T VectorL 0 μ L ;Ligation buffer I 5. 0 μ L ;目的片 段 4· Ομ L。
[0061] 在超凈工作臺上加樣，混勻反應物，短暫離心，16°C連接約lh，過夜也不影響連接 效率。
[0062] (4)連接產物的轉化
[0063] 1)取出感受態細胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化；
[0064] 2)感受態（50 μ L) +5 μ LSolutionA+4 μ LSolutionB+46 μ L 預冷去離子水；
[0065] 3)用冷卻的無菌槍頭將上述懸浮液分裝到I. 5mL離心管，每管加入105 μ L，再加 入5 μ L的目的DNA，輕旋混勻；
[0066] 4) 42°C水浴熱激90s，注意不要晃動離心管；
[0067] 5)快速將管轉移到冰浴器中，使細胞冷卻3?5min ;
[0068] 6)加入500 μ L LB液體培養基。在37°C，150rpm搖床上預培養Ih ;
[0069] 7)將菌液涂布到含有 100 μ g .Hir1Amp、25 μ g .Hir1IPTG 和 40 μ g .Hir1X-GAL 的 LB 固體培養基上，用無菌的彎頭玻璃棒輕輕的將菌液均勻涂開，置于室溫直至液體被吸收；
[0070] 8)倒置平板，37°C培養12?16h。
[0071] (5)重組質粒的藍白斑篩選
[0072] 經37°C培養后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出現少量藍色菌落和較多的白色 菌落，其中白色菌落為重組克隆子。挑取白色單菌落涂抹在劃好方格的LB液體培養基中， 37°C，150rpm過夜培養。
[0073] (6)菌落PCR的檢測
[0074] 吸取1 μ L菌液作為模板進行PCR擴增。取4 μ L PCR產物，經1. 5%瓊脂糖凝膠電 泳檢測，與PCR Marker標準分子量相比較檢測插入片段的大小，與插入目的片段大小一致 的克隆即為陽性克隆。
[0075] (7)克隆后載體的測序與分析
[0076] 取3個陽性克隆菌液在甘油（330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液）中各保存兩份， 一份-20°C保藏，一份送去測序。
[0077] 其中wmvlndel3標記引物wmvIndel3_F/wmvIndel3-R擴增出的與黃瓜感WMV基因 WMV連鎖的特征片段的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示；與黃瓜抗WMV基因 wmv連鎖的特 征片段的核苷酸序Seq ID No. 2所示。
[0078] 實施例2.與黃瓜wmv基因連鎖的wmvlndel3標記的驗證
[0079] 用對實施例1獲得的與wmv基因連鎖的Indel標記wmvlndel3對54份不同遺傳 背景的黃瓜材料進行驗證，以確定該標記用于分子標記輔助選擇的準確性。驗證采用實施 例1中步驟2中的PCR擴增和檢測方法。
[0080] 結果發現，在這54份材料中共有45個株系的帶型反映的表型數據與田間調查結 果一致，經計算準確率為83. 3%，見圖1。
【權利要求】
1. 一種與黃瓜抗西瓜花葉病毒基因 wmv連鎖的Indel標記，其特征在于：所述標記的 引物的核苷酸序列如下： wmvIndel3-F/wmvIndel3-R ： AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG 所述引物擴增的與黃瓜感西瓜花葉病毒基因 WMV連鎖的特征條帶為173bp，其核苷酸 序列如Seq ID No. 1所示； 所述引物擴增的與黃瓜抗西瓜花葉病毒基因 wmv連鎖的特征條帶為169bp，其核苷酸 序列如Seq ID No. 2所示。
2. 權利要求1所述Indel標記在篩選具有抗西瓜花葉病毒基因 wmv的黃瓜種質資源中 的應用，其特征在于，包括如下步驟： (1) 采用所述Indel標記的引物對待選黃瓜材料的基因組DNA進行PCR擴增；所述 標記的引物的核苷酸序列如下：wmvIndel3-F/wmvIndel3-R :AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/ TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG ； (2) 對擴增結果進行凝膠電泳檢測； (3) 從檢測結果中篩選出現與抗西瓜花葉病毒基因 wmv連鎖的Indel標記特征條帶一 致的材料，所述抗西瓜花葉病毒基因 wmv連鎖的Indel標記特征條帶為169bp，其核苷酸序 列如Seq ID No. 2所示。
3. 根據權利要求2所述的應用，其中，所述PCR擴增的反應體系為：1. 5ng/μ I DNA模 板，所述引物正向和反向各5ng/μ 1，0· 5 μ 1/μ I Go Taq? Green Master Mix,其余為雙蒸 水。
4. 根據權利要求2或3所述的應用，其中，所述PCR擴增的反應程序為：94°C預變性4 分鐘；94°C變性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35個循環；72°C保溫5分鐘，16°C保 存。
5. 根據權利要求2-4任一所述的應用，其中所述凝膠電泳檢測，指采用6 %的非變性聚 丙烯酰胺凝膠，于150V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372085SQ201410608279
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】顧興芳, 張圣平, 苗晗, 田桂麗, 王燁, 楊宇紅, 謝丙炎 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所