一種b族鏈球菌(gbs)核酸檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開一種B族鏈球菌(GBS)核酸檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒含有：單引物等溫擴增反應酶（SPIA）：BstDNA聚合酶，RNaseH；SPIA反應液：dNTPs，引物，Bst酶Buffer，RNaseHBuffer；RIDA反應體系：切刻內切酶選擇Nb.BtsI及探針；SSPIA反應引物：P1．5'-3'UCGAUCAUGTTAGCCGC、5'端后八個堿基是RNA其余堿基是DNA，RIDA探針:5'-3’GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT，內質控SPIA引物：P2.5'-3'CUGUCGAUCGCAATCGG、5'端后八個堿基是RNA其余堿基是DNA，內質控RIDA探針：5'-3'GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC，內質控為插入了人GAPDH基因的質粒DNA。本發明采用SPIA與RIDA技術相結合的方法檢測B族鏈球菌(GBS)核酸序列的方法，具有靈敏，特異，快速的優點。
【專利說明】—種B族鏈球菌(GBS)核酸檢測試劑盒及檢測方法【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，公開了一種B族鏈球菌(GBS)的核酸檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]B族鏈球菌為兼性厭氧的革蘭氏陽性鏈球菌，正常婦女帶菌率達30%左右，屬于條件致病菌，孕婦感染可通過產道傳播給新生兒，引起新生兒的敗血癥、腦膜炎、肺炎等，死亡率極高，是目前引發新生兒感染最主要的致病菌之一。本研究計劃用于檢測生殖道和直腸分泌物樣品中的B族鏈球菌DNA，可用于B族鏈球菌感染的輔助診斷及療效監控。該項檢測的適用人群為妊娠34-37周的孕婦。B族鏈球菌感染的特異性常用診斷方法有兩種，即細菌分離鑒定以及分子生物學技術。細菌的分離培養繁雜費時，無法滿足大量樣本的快速診斷。近年來分子生物學技術尤其以核酸等溫擴增技術為基礎的檢測技術發展迅猛。傳統PCR及實時熒光定量PCR技術在檢測B族鏈球菌核酸時一方面操作耗時，另一方面大量擴增產物DNA容易造成交叉污染，引起后續試驗的假陽性，此外傳統PCR技術對儀器要求比較高，不易在基層醫院進行推廣。本試劑盒首次將單引物等溫擴增(SPIA)與等溫信號方法技術(RIDA)兩種核酸檢測技術進行了結合，兩種技術結合的優勢如下:
第一，單純的擴增反應通過產生大量的核酸產物來實現對目標基因的檢測，該模式容易產生污染，而新方法通過擴增結合信號放大的模式來實現對目標基因的檢測，第一步擴增的過程可以控制在很短的時間內，使產物的量控制在一定范圍之內，然后通過后續的信號放大系統來判定結果。同時由于SPIA擴增產物3’端被RNase H切割后缺失部分序列因而不會作為擴增模板污染后續反應，所以假陽性大大降低。
[0003]第二，通過在RIDA技術之前引入SPIA增強了 RIDA的靈敏度，同時兩種方法的結合相對于單純的擴增反應特異性有了很大提高，即使第一步出現非特異擴增也可以通過第二步信號放大加以糾正。再通過對反應時間的控制(減少第二步反應時間)可以使得第二步反應即使單獨出現非特異也不會有信號顯示從而也最大程度的降低了第二步反應出現非特異的可能性。由于兩步同時出現非特異的可能性非常小，特別是由于第一步擴增產物片段較小，針對擴增產物的信號放大幾乎不可能出現非特異結果。所以這兩種方法的結合是一種互補，既提高了靈敏度也增強了特異性。
[0004]第三，整個反應可以只需一個水浴鍋和一個簡易熒光檢測器即可實現對結果的判定，有利于在基層醫療檢疫機構推廣。相比現有的PCR方法，其具有靈敏度高，反應時間短，不依賴特殊儀器等優勢，可以實現病原微生物的篩選及快速診斷，便于在基層醫院的推廣。我們建立了這一技術可實現對病原微生物簡便，靈敏，特異，高通量的篩選鑒定。
[0005]第四，新方法在反應體系中加入了內質控基因，內質控基因參與樣本的DNA提取過程，從而使得結果的判定更加準確。
[0006]綜上所述，本試劑盒具有靈敏，特異，簡便，快捷，高效，不依賴特殊儀器等優勢，可以實現對B族鏈球菌DNA的篩選及快速診斷，便于在基層醫院的推廣。
【發明內容】

[0007]本發明的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供一種利用SPIA與RIDA相結合的技術并具有特異，靈敏，快速，簡便，高效的B族鏈球菌DNA核酸檢測試劑盒及檢測方法。
[0008]為了實現上述目的本發明采取的技術方案是:提供一種B族鏈球菌DNA核酸檢測試劑盒，該試劑盒含有:
(1)SPIA 反應酶:Bst DNA 聚合酶；RNase H ；
(2)SPIA 反應液:dNTPs，引物，Bst 酶 Buffer, RNase H Buffer ；
(3)RIDA反應體系:切刻內切酶選擇Nb.BtsI
SPIA反應引物:Pl.5’-3’UCGAUCAUGTTAGCCGC 5’端后八個堿基是RNA其余堿基是
DNA
RIDA 探針:5’-3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT
內質控SPIA引物P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG 5’端后八個堿基是RNA其余堿基是DNA
內質控 RIDA 探針:5’ -3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC
內質控為插入了人GAPDH基因的質粒DNA，內質控同被檢測樣本同時參與DNA提取過程。
[0009](4 )空白對照為DEPC水
(5)陰性對照為甲型溶血性(草綠色)鏈球菌DNA，大腸桿菌DNA
(6)陽性對照為B族鏈球菌(GBS)DNA。
[0010]該試劑盒，其檢測探針5'端標記熒光基團為FAM，3'端標記熒光猝滅基團為TAMARA。內質控探針Y端標記熒光基團為TET，3 ^端標記熒光猝滅基團為TAMARA。
[0011]采用上述試劑盒檢測B族鏈球菌(GBS)核酸的檢測方法，包括以下步驟:
(I)DNA提取:DNA提取采用TAKARA細菌核酸提取專用試劑盒，提取方法參照說明書
進行。提取到的核酸樣本利用紫外分光光度計測量濃度，經過換算得到每微升拷貝數。內質控同被檢測樣本同時參與DNA提取過程。
[0012](2)引物設計:從Genebank下載核酸序列，選擇B族鏈球菌(GBS)保守基因(CAMP),設計合成SPIA引物，引物的5’端后八個堿基是RNA其余堿基是DNA。
[0013]Pl: 5，-3，UCGAUCAUGTTAGCCGC
RIDA探針:根據前一步SPIA擴增后的單鏈靶序列設計，探針序列:5’ -3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT, 5 '端標記熒光基團為FAM，3 '端標記熒光猝滅基團為TAMARA。探針序列下劃線部分為切刻內切酶N.BstNBI對應的識別位點。內質控為插入了人GAPDH基因的質粒DNA。內質控SPIA引物P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG，5’端后八個堿基是RNA其余堿基是DNA。
[0014]內質控RIDA 探針:5’ _3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC 5 '端標記熒光基團為TET，3'端標記熒光猝滅基團為TAMARA。
[0015]弓丨物和探針由TAKARA公司合成。
[0016](3)反應體系:在 15yLSPIA 混和物(包含 Immo I/L dNTPs, 0.5 μ mol/L 反應引物，0.5ymol/L 內質控引物，I μ IRNase H Buffer, 0.08U RNase H, 2U Bst DNA 聚合酶，1μ I Bst DNA聚合酶Buffer)中加入I μ L包含檢測標本和內質控的DNA，混勻后在水浴鍋上60°C加熱30min，反應結束后再加入I μ L 50pmol/L反應探針及內質控探針，2 μ LNEB buffer3，5UN.BstNBI酶(NEB公司)。總反應體積達到20 μ L。在水浴鍋上55°C繼續反應15min后取出反應管放置在紫外下觀察顏色變化。
[0017](4)結果判定:含有樣本核酸模板的反應管在紫外下發出黑色熒光(FAM綠色熒光加紫色熒光的混合色)，此時樣本可判定為陽性。如含有樣本的反應管為紫色，此時樣本可判定為陰性。如樣本反應管發出淡紅色熒光則提示樣本提取過程中存在抑制反應的成分，結果無效。
【具體實施方式】
[0018](I)DNA提取:DNA提取采用TAKARA細菌核酸提取專用試劑盒，提取方法參照說明書進行。提取到的核酸樣本利用紫外分光光度計測量濃度，經過換算得到每微升拷貝數。內質控同被檢測樣本同時參與DNA提取過程。
[0019](2)引物設計:從Genebank下載核酸序列，選擇B族鏈球菌(GBS)保守基因(CAMP),設計合成SPIA引物，引物的5’端后八個堿基是RNA其余堿基是DNA。
[0020]Pl:5，-3，UCGAUCAUGTTAGCCGC
RIDA探針:根據前一步SPIA擴增后的單鏈靶序列設計，探針序列:5’ -3’GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT 端標記熒光基團為FAM，端標記熒光猝滅基團為TAMARA。探針序列下劃線部分為切刻內切酶N.BstNBI對應的識別位點。內質控為插入了人GAPDH基因的質粒DNA。內質控SPIA引物P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG 5’端后八個堿基是RNA其余堿基是DNA。
[0021 ]內質控 RIDA 探針:5’ -3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC 5'端標記熒光基團為 TET, 端標記熒光猝滅基團為TAMARA。
[0022]弓丨物和探針由TAKARA公司合成。
[0023](3)反應體系:在 15 μ L SPIA 混和物(包含 I mmol/L dNTPs, 0.5 μ mol/L 反應引物，0.5ymol/L 內質控引物，1μ I RNase H Buffer, 0.08U RNase H, 2U Bst DNA 聚合酶，I μ I Bst DNA聚合酶Buffer)中加入I μ L包含檢測標本和內質控的DNA，混勻后在水浴鍋上60 °C加熱30 min,反應結束后再加入I μ L 50 pmol/L反應探針及內質控探針，2 μ L NEB buffer3, 5U N.BstNBI酶(NEB公司)。總反應體積達到20 μ L。在水浴鍋上55°C繼續反應15min后取出反應管放置在紫外下觀察顏色變化。
[0024](4)結果判定:含有樣本核酸模板的反應管在紫外下發出黑色熒光(FAM綠色熒光加紫色熒光的混合色)，此時樣本可判定為陽性。如含有樣本的反應管為紫色，此時樣本可判定為陰性。如樣本反應管發出淡紅色熒光則提示樣本提取過程中存在抑制反應的成分，結果無效。
【權利要求】
1.一種B族鏈球菌(GBS)核酸檢測試劑盒，其特征在于， 該試劑盒含有: SPIA 反應酶:Bst DNA 聚合酶；RNase H ； SPIA 反應液:dNTPs，引物，Bst 酶 Buffer, RNase H Buffer ； RIDA反應體系:切刻內切酶選擇Nb.BtsI ； SPIA反應引物:Pl.5’-3’UCGAUCAUGTTAGCCGC 5’端后八個堿基是RNA，其余堿基是DNA,
RIDA 探針:5’-3’ GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT, 內質控SPIA引物:P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG 5’端后八個堿基是RNA，其余堿基是 DNA，
內質控 RIDA 探針:5’ -3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC, 內質控為插入了人GAPDH基因的質粒DNA，內質控同被檢測樣本同時參與DNA提取過程; 空白對照為DEPC水； 陰性對照為甲型溶血性(草綠色)鏈球菌DNA，大腸桿菌DNA ； 陽性對照為B族鏈球菌(GBS) DNA。
2.根據權利要求1所述的B族鏈球菌(GBS)核酸檢測試劑盒，其特征在于，檢測探針 端標記熒光基團為FAM，3^端標記熒光猝滅基團為TAMARA，內質控探針Y端標記熒光基團為TET，3,端標記熒光猝滅基團為TAMARA。
3.一種利用權利要求1或2所述的試劑盒檢測B族鏈球菌(GBS)核酸的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)DNA提取:DNA提取采用TAKARA細菌核酸提取專用試劑盒，提取到的核酸樣本利用紫外分光光度計測量濃度，經過換算得到每微升拷貝數，內質控同被檢測樣本同時參與DNA提取過程； (2)引物設計:從Genebank下載核酸序列，選擇B族鏈球菌(GBS)保守基因(CAMP)，設計合成SPIA引物，引物的5’端后八個堿基是RNA，其余堿基是DNA，
Pl:5，-3，UCGAUCAUGTTAGCCGC， RIDA探針:根據前一步SPIA擴增后的單鏈靶序列設計，探針序列:5’ -3’GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAAT 端標記熒光基團為FAM，端標記熒光猝滅基團為TAMARA，探針序列下劃線部分為切刻內切酶N.BstNBI對應的識別位點，內質控為插入了人GAPDH基因的質粒DNA，內質控SPIA引物P2.5’-3’CUGUCGAUCGCAATCGG 5’端后八個堿基是RNA，其余堿基是DNA; 內質控 RIDA 探針:5’ -3’ GACCGAGTCTATCGGCCAGCTAC 5'端標記熒光基團為 TET, 3'端標記熒光猝滅基團為TAMARA ； (3)反應體系:在15μ L SPIA混和物(包含I mmol/L dNTPs, 0.5 μ mol/L反應引物，0.5 μ mol/L 內質控引物，I μ I RNase H Buffer, 0.08 U RNase H, 2 U Bst DNA聚合酶，I μ I Bst DNA聚合酶Buffer)中加入I μ L包含檢測標本和內質控的DNA,混勻后在水浴鍋上60 °C加熱30 min,反應結束后再加入I μ L 50 pmol/L反應探針及內質控探針，2 μ L NEB buffer3，5U N.BstNBI酶，總反應體積達到20 μ L，在水浴鍋上55 V繼續反應15 min后取出反應管放置在紫外下觀察顏色變化； (4)結果判定:含有樣本核酸模板的反應管在紫外下發出黑色熒光(FAM綠色熒光加紫色熒光的混合色)，此時樣本可判定為陽性，如含有樣本的反應管為紫色，此時樣本可判定為陰性，如樣本反應管發出淡紅色熒光，則提示樣本提取過程中存在抑制反應的成分，結果無效。
【文檔編號】C12Q1/14GK103725761SQ201210384976
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月12日 優先權日:2012年10月12日
【發明者】郭興中, 陳文 , 呂校祥 申請人:江蘇默樂生物科技有限公司