一種培育高密度脫氮硫桿菌的方法
【專利摘要】本發明屬于生物工程領域，涉及一種培育高密度脫氮硫桿菌（Thiobacillusdenitrificans，ATCC25259）的方法。所述的培菌方法為：往氣升式生物反應器中按10～100∶1比例注入菌懸液和營養液；通入空氣代替傳統機械式攪拌進行曝氣，曝氣量為800～1200L/h，控制溶解氧濃度水平；維持氣升式生物反應器中營養液的pH值為6～8、溫度在25～35℃，電導率為20～60mS/cm。該培菌方法具有菌種培育與脫硫試驗一體化、操作方便安全、培菌迅速、溶解氧供應充足且穩定、菌種豐富針對性強、馴化方式多樣化等優點。
【專利說明】一種培育高密度脫氮硫桿菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物培育技術，應用于生物工程領域，具體涉及一種培育高密度脫氮硫桿菌的方法。
【背景技術】
[0002]含硫工業廢氣的治理已成為工業“三廢”治理和控制大氣污染物的一項重要任務。目前國內外去除含硫廢氣的脫硫技術主要可分為物理法、化學法和生物法。用傳統的物理法或化學法處理含硫氣體，具有使用設備繁多、工藝復雜、能耗大、二次污染處理過程復雜等缺點。微生物法能夠有效脫硫的原因在于所選微生物不僅對廢氣適應較快，而且可使污染物得到降解和轉化，且具有設備簡單、費用低、不需再生和氣體后處理、能耗少、管理維護方便等特點。因此，生物法已逐漸成為脫除含硫氣體的一個重要研究方向。
[0003]生物脫硫過程主要依靠脫硫菌及菌群的代謝活動，所以高效脫硫微生物及菌群的篩選、培育、構建及其代謝機理是生物脫硫的關鍵與前提。由于生物酶催化反應的專一性，對于不同形態的硫，適用的脫硫細菌不一樣。因此廣泛查找自然界能代謝硫化物的微生物，篩選出高效、廣譜脫臭菌群并進行深入地微生物學研究是現今工作重點之一。目前，常見的應用于H2S脫硫的無機化能自養硫桿菌屬(Thiobacillus)主要有氧化亞鐵硫桿菌(T.ferrooxidans)、脫氮硫桿菌(T.denitrificans)、氧化硫硫桿菌(T.thiooxidans)以及排硫硫桿菌(T.thioparus)等。其中,研究最廣泛地是脫氮硫桿菌和氧化亞鐵硫桿菌。
[0004]一方面，生物脫硫技術存在著菌種生長周期長，繁殖速度慢，不易調試，理論研究與實際應用相脫節 等主要問題；另一方面，現有的微生物培養主要在價格昂貴的發酵罐中進行，造成微生物培養成本增加，阻礙了生物脫硫技術在廢氣廢液處理領域的推廣應用。因此，結合廢氣處理微生物菌劑應用的特點，研究適宜的大規模培養方法，為進行含硫工業廢氣的微生物脫硫奠定物質基礎。

【發明內容】

[0005]為解決現有技術中生物培育時間長、菌種單一、操作困難危險、馴化方式單一等不足，本發明的目的在于提供了一種采用氣升式生物反應器進行氣液兩相培菌及反應器啟動方法，具有培育迅速、菌種豐富針對性強、操作方便安全、馴化方式多樣化等優點。
[0006]本發明培育高密度脫氮硫桿菌的氣升式生物反應器，其特征是反應器內有一同心導流筒，反應器上部設有菌懸液加料口、營養液加液口和尾氣排放口，反應器內部設有溫度探頭、PH探頭、溶解氧探頭、電導率探頭和微孔布氣器，反應器下部設有進氣/液口、空氣曝氣管和營養液廢液出口。溫度探頭、PH探頭、電導率探頭和溶解氧探頭由電控裝置操作控制。
[0007]本發明所述培育高密度脫氮硫桿菌的培菌方法，其特征是包括:
(1)往氣升式生物反應器中按比例注入菌懸液和營養液；
(2)通入空氣代替傳統機械式攪拌進行曝氣，并控制溶解氧濃度水平；(3)控制氣升式生物反應器中pH值、溫度在所述菌種適宜的范圍內；
(4)控制內循環氣升式生物反應器中的電導率，并通過定期排放營養液廢液，并補充新 鮮營養液，維持電導率在一定內范圍。
[0008]本發明培育高密度菌種方法是：先將菌懸液加入到氣升式生物反應器中；然后按 照營養液：菌懸液=1(T100: 1配比，加入滅菌后的營養液，并調節初始pH值為中性。營 養液包括：Na2S203 8?12 g/L, KN03 4?6 g/L, Na2HP04 1 ?2 g/L, KH2P04 1 ?3 g/L, MgS04 0. 2?0. 6 g/L, NaHC03 0. 5?2. 0 g/L, NH4C1 0. 2?0. 8 g/L, CaCl2 0. 02^0. 05 g/L, MnS04 0. 01 ?0. 03 g/L, FeCl3 0. 01 ?0. 03 g/L,微量元素 10?20 mL/L。
[0009]所述培育高密度菌種方法中，利用硫代硫酸鹽（S2032_)為能源，培養時間為廣3天， 培養溫度為25?35°C，培養pH為6?8，電導率為20?60 mS/cm,曝氣量QAIK為800?1200 L/ h0
[0010]本發明所述的脫氮硫桿菌為脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans),革蘭氏 染色陰性，光學顯微鏡下觀察為短桿狀，單個、成對或短鏈狀排列；專性無機化能自養型，能 在好氧和厭氧條件下以硫代硫酸鹽和S2_作為能源進行生長。30°C恒溫培養箱中固體平板 培養，培養基表面上出現菌落，白色，透明，光滑，呈圓形，直徑0. 2?lmm。
[0011]本發明的優點是：
用氣升式生物反應器進行脫氮硫桿菌的培養，脫氮硫桿菌的培育密度可更快達到較高 水平，反應器能夠給菌種提供更充足的溶解氧，且溶解氧的變化較穩定，培育系統具有啟動 迅速、菌種豐富針對性強、操作方便安全、馴化方式多樣化等優點。因此可見，氣升式生物反 應器在脫氮硫桿菌的培養方法具有明顯的技術優勢。
[0012]本發明的脫氮硫桿菌培育的新型裝置和工藝，整合集成多項高新技術，建立具有 我國自主知識產權的生物反應器式脫氮硫桿菌的高密度培育技術體系。而且氣升式生物反 應器還將在廢水廢氣處理、氣體凈化或分離等化工領域展現出良好的應用前景。該試驗對 提高我國脫硫菌種培育技術與工藝水平，為將來脫硫菌種培育企業的技術改造與革新進行 必要的尖端技術儲備與新型生物反應器的研發與升級均具有重要指導意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發明實施例中氣升式生物反應器的結構示意圖。
[0014]圖中，1空氣曝氣管，2營養液廢液排出口，3進氣口，4菌懸液加料口，5尾氣 排放口，6營養液加液口，7控溫夾套，8固定條，9導流筒，10溶解氧電極，11 pH電極， 12電導率電極,13溫度探頭，14微孔布氣器。
[0015]圖2培養時間對脫氮硫桿菌生長活性影響。
[0016]圖3培養溫度對脫氮硫桿菌生長活性影響。
[0017]圖4 pH值對脫氮硫桿菌生長活性影響。
[0018]圖5曝氣量對脫氮硫桿菌生長活性影響。
【具體實施方式】
[0019]下面通過實施例和附圖，對本發明加以詳細描述。
[0020]如附圖1所示，本發明實施通過氣升式生物反應器來實現的，氣升式生物反應器內部有一導流筒9，通過上下兩個固定條8，固定于反應器中心，導流筒下端距微孔布氣器14處10~30cm。反應器上部設有菌懸液加料口 4、營養液加液口 6、尾氣排放口 5。反應器下部設有進氣/液口 3,底部設有空氣曝氣管1,曝氣管1與微孔布氣器14相通,并有營養液廢液排出口 2 ;為控制溶解氧濃度、pH值和電導率值，反應器還設有在線檢測的溶解氧電極10、pH電極11和電導率電極12，反應器的溫度通過溫度探頭13測定，由反應器外部的控溫夾套7來維持穩定。
[0021]所用分析測試方法為:脫氮硫桿菌生長曲線中生長指標OD (Optical Density)值采用7230G型分光光度計測定。
[0022]實施例1
按配方配備所需的營養液，置入三角瓶包扎后放入蒸汽滅菌鍋中，進行高壓濕熱滅菌，在121℃~123°C、0.12 MPa下，滅菌20~30 min,取出冷卻至室溫。
[0023]使用上述滅菌營養液，以S2032_為能源，溫度為30 V，pH=7,脫氮硫桿菌接種量為 10%，進行培養，分別在 Oh, 5 h, 15 h, 20 h, 25 h, 30 h, 40 h, 45 h, 50 h, 55h, 65h, 70 h，75 h，90 h，100 h取樣測OD42tl，用未接種營養液作為對照。
[0024]試驗結果圖2表明:脫氮硫桿菌生長迅速，在15 h內保持在延滯期，菌體數目略有增長，然后細菌進入對數生長期，在此階段(15h-30 h)，細菌生長活躍，大量繁殖。30 h后菌種進入穩定期，穩定期能夠維持較長時間，生長70 h后，由于營養元素的逐漸消耗，細菌的生長進入衰亡期。
[0025]實施例2
使用上述滅菌營養液，以s2 032_為能源，脫氮硫桿菌接種量為10%，pH=7，在溫度為2(T40°C范圍內分別進行培養，取樣測0D.，用未接種營養液作為對照。
[0026]試驗結果圖3表明:脫氮硫桿菌的最佳生長溫度為25~35°C，30°C為脫氮硫桿菌最合適生長溫度。低于25°C的培養溫度對脫氮硫桿菌抑制生長顯著；高于40°C的培養溫度，脫氮硫桿菌生長亦受到顯著的抑制。
[0027]實施例3
使用上述滅菌營養液，以s2 032_為能源，溫度為30 V，脫氮硫桿菌接種量為10%，在PH=3-11范圍內分別進行培養，取樣測0D.，用未接種營養液作為對照。
[0028]試驗結果圖4表明:脫氮硫桿菌在pH值為5、時，尤其是在61范圍內，菌種的OD值能維持在較高濃度，這是由于脫氮硫桿菌的最佳生長pH范圍為6~8，而偏酸或偏堿都會對脫氮硫桿菌生長產生抑制。
[0029]實施例4
使用上述滅菌營養液，以s2032_為能源，溫度為30 V，pH=7,脫氮硫桿菌接種量為10%，分別改變不同曝氣量Qaik(Qaik=200，、500、1000、1500、2000 L/h)，進行培養，取樣測OD420，用未接種營養液作為對照。
[0030]試驗結果圖5表明:隨著Qaik的增大,溶解氧濃度逐漸增大；當脫氮硫桿菌的OD值在曝氣量為1000 L/h時，達到較高水平，說明曝氣量在達到1000 L/h時的溶解氧水平能夠滿足菌種生長的需要。在此基礎上溶解氧的增加已不能大幅度提高菌種的生長，反而增加了物耗和能耗。
【權利要求】
1.一種培育高密度脫氮硫桿菌的方法，其特征在于按照以下步驟進行: (O往氣升式生物反應器中注入菌懸液和營養液； (2)通入空氣代替傳統機械式攪拌進行曝氣，通過曝氣量調節溶解氧濃度水平； (3)控制氣升式生物反應器中pH值為6~8、溫度為25~35°C； (4)控制氣升式生物反應器中的電導率，并通過定期排放營養液廢液，并補充新鮮營養液，維持電導率20~60 mS/cm。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是先將菌懸液加入到氣升式生物反應器中，然后按營養液:菌懸液=10-100:1配比，加入營養液，并調節混合液初始pH值為中性。
3.如權利要求1所述的方法，其特征是所述營養液包括=Na2S2O38^12 g/L、KNO3 4飛g/L、Na2HPO4 2 g/L、KH2PO4 I~3 g/L、MgSO4 0.2~0.6 g/L、NaHCO3 0.5~2.0 g/L,、NH4Cl0.2~0.8 g/L、CaCl2 0.02~0.05 g/L、MnSO4 0.θ1-θ.03 g/L、FeCl3 0.Ο1-Ο.03 g/L 和微量元素10~20 mL/Lo
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于培養時間為1-3天。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于曝氣量Qaik為80(Tl200L/h。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于利用硫代硫酸鹽(S2O32O為能源。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的營養液滅菌后使用，滅菌溫度121。。~123°C、壓力 0.12 MPa，滅菌時間 20~30 min。
【文檔編號】C12R1/01GK103773706SQ201210402040
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月22日 優先權日:2012年10月22日
【發明者】郝愛香, 毛松柏, 孔京, 朱燕 申請人:中國石油化工股份有限公司, 南化集團研究院