專利名稱：一種章魚腸道產蛋白霉菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種章魚腸道產蛋白霉菌株及其應用。
背景技術：
章魚屬軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)JUig(Octopoda)、章魚科(octopodidae)，學名“蛸”，俗稱“八爪魚”、“八帶魚”。其體短，卵圓形，無鰭，頭上生八腕，腕間有膜相連，腕長短相等或不相等，腕上吸盤無柄。廣泛分布世界各海域，從寒帶至熱帶海域均有分布，全球大約有140種，大部分為淺海性種類，也有少數深海性種類。章魚廣泛分布于我國南北沿岸海域，主要有8種，分別為短蛸、卵蛸、雙點蛸、真蛸、環蛸、長蛸、紡錘蛸、嘉庚蛸。最常見為短蛸、長蛸和真蛸[12]。本實驗所選用的章魚為長蛸。長蛾(Octopus variabilis)俗稱長腿蛾、馬蛾、石拒、長爪章,屬軟體動物頭足綱、章魚科、蛸屬[13]。在我國南北各海區均有廣泛分布，其中北部海區略多。長蛸個體大、肉質肥厚鮮美、營養豐富，富含蛋白質和氨基酸，可食用部分占總體的90%以上。肉除鮮食外，還可以加工成干制品，食用方式多種多樣。長蛸具有較高的經濟價值[14]。春季長蛸多在低潮線以上活動，夏秋兩季多在潮間帶中區，冬季則在潮下帶深潛，具有短距離的生殖和越冬洄游習性。其多利用腕足在海底爬行，也能憑借漏斗噴水的反作用短暫游行于底層海水中。長蛸可用其腕足挖洞棲居。天然海區長蛸多將卵產在自挖的洞中孵化，少數產在礁石縫隙及海螺殼中。長蛸食性較兇猛，以蟹類、貝類、蝦類等貝殼類生物為主食，腸道中存在的微生物菌群能夠分泌各種酶類，幫助章魚消化食物，將食物中的蛋白質轉化為自身的蛋白質。

章魚最主要的消費國家和地區為日本、韓國，其次是阿根廷、中國和中國臺灣省、摩洛哥等。近些年，我國對章魚的消費量有了大幅度的提高，隨著中國經濟的快速發展和中國人喜愛海產的飲食習慣，使中國對章魚的消費大有超過日韓的勢頭；同時，由于廉價而高素質的勞動力，使中國成為世界的章魚加工廠，原本在摩洛哥、日本的章魚加工廠，逐漸向中國轉移，我國從事章魚加工的工廠數量有了大幅提高。隨著章魚加工廠規模和數量的增力口,加工過程中產生的下腳料(主要是章魚的內臟)約占個體總重的50% [15]，年產量巨大，僅山東一家水產品公司章魚內臟的年產量達近千噸。而這些內臟常占用企業大量的庫存，最后作為廢棄物丟棄于海中，這不僅造成了海洋環境的污染，而且增加了企業的經濟負擔，這些下腳料中含有豐富的蛋白資源，如果能夠將這些下腳料通過適當的方法轉化成高附加值的產品，不僅解決了環境污染問題，同時能夠為企業創造更大的經濟效益。以往人們用市售蛋白酶對下腳料進行水解以獲得高附加值的產品，成本過高，本研究從章魚自身腸道中分離篩選出高產蛋白酶的菌株，對其進行鑒定，并將菌株應用于發酵章魚下腳料，獲得具有抗氧化活性的多肽，既降低了成本，又可獲得高附加值產品，更具有工業化應用的價值。

發明內容
為了解決上述技術問題，本發明公開了一種章魚腸道內的產蛋白酶菌株。本發明的另一目的在于公開了該菌株在生產用于發酵章魚下腳料的蛋白酶方面的應用。本發明的技術方案如下一種章魚腸道產蛋白酶菌株，其中，所述菌株為Bacillus sp. QDV-3, CGMCCNo. 6561,其16S rRNA序列如序列表I所示,所述Bacillus sp. QDV-3菌株為革蘭氏陽性菌，桿狀，兩端鈍圓，有芽孢；菌落為乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊濕潤的光滑型小菌落。Bacillus sp. QDV-3菌株在生產用于發酵章魚下腳料的蛋白酶方面的應用，Bacillus sp. QDV-3菌株的液體發酵條件為液體培養基中各物質的質量濃度為果糖
O.5 %，蛋白胨O. 5 %，酵母膏O.1 %，磷酸高鐵O. 01 %培養基初始pH8. O,培養溫度30°C的條件下振蕩培養3. 5天。上述技術方案所述的Bacillus sp. QDV-3菌株在生產用于發酵章魚下腳料的蛋白酶方面的應用，其中，培養基中還加入金屬離子Mn2+或Ba2+。本發明具有以下有益效果1、本發明從章魚腸道內篩選了一種產蛋白酶菌株Bacillus sp. QDV-3，有效地發酵章魚下腳料，避免了海洋環境的污染，減輕了企業的經濟負擔。


圖1為各發酵液的蛋白酶活力圖；圖2為菌株Bacillus sp. QDV-3經革蘭氏染色后圖；圖3為不同碳源對Bacillus sp. QDV-3菌株產蛋白酶的影響；

圖4為不同氮源對Bacillus sp. QDV-3菌株產蛋白酶的影響；圖5為培養基起始pH值對Bacillus sp. QDV-3菌株產蛋白酶的影響；圖6為培養溫度對Bacillus sp. QDV-3菌株產蛋白酶活力的影響；圖7為培養時間對Bacillus sp. QDV-3菌株產蛋白酶活力的影響。菌株保藏信息本發明Bacillus sp. QDV-3，分類命名為彎曲芽孢桿菌Bacillusflexus，已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 6561，保藏日期為2012年9月11日。
具體實施例方式為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對對本發明作進一步的說明。實施例1 jBacillus sp. QDV-3 菌株的制備一、材料與培養基1、材料章魚2、培養基選擇培養基2216E培養基和VNSS培養基，兩個培養基的制備方法見ChristerO.1ntestinal Colonization Potential of Turbot(Scophthalmus maximus)-andDab(Limanda Iimanda)-Associated Bacteria with Inhibitory Effects against VibrioanguiIlarum[J]. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,1992 (58) :551-556.；酪蛋白培養基酪蛋白1%，酵母膏0. 1%，瓊脂1.5%，pH7. 2，海水配制，以上為質量濃度，即酪蛋白為lg/100mL ；液體發酵培養基果糖0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，酵母膏0.1%，磷酸高鐵0.01%，培養基起始PH8. 0，該培養基用海水配制，以上為質量濃度，即果糖為0. 5g/100mL ；固體培養基稱取3. 3g LB營養瓊脂培養基溶解于100ml海水中。二、章魚腸道產蛋白酶菌的篩選選用酪蛋白培養基作為篩選培養基的主要原理是該菌種在酪蛋白培養基中生長時，利用自己產的蛋白酶來水解培養基中的酪蛋白，產生透明圈。因此，以酪蛋白水解透明圈的大小來進行產蛋白酶菌株的篩選。1、初篩將活章魚解剖，取其腸道，用無菌海水沖洗數次，去掉腸道雜物，將腸道剪碎，加入無菌海水研磨，得到菌液原液，將原液稀釋成10—1，10_2濃度梯度，分別涂布于2216E培養基和VNSS培養基上，于25 °C恒溫培養箱中培養。挑取培養基上的單菌落，稀釋劃線培養于固體培養基上，25°C培養ld，得到純的單菌落，將單菌落點種于酪蛋白培養基上，觀察各菌株產透明圈情況。結果酪蛋白培養基上水解透明圈直徑與菌落直徑的比值(D% d值)越大說明產酶能力越強。菌株的初篩結果如表1所示，共得到6株在酪蛋白培養基上產透明圈的菌株，其中VNSS培養基篩選出來的有2株，分別為命名QDV-1和QDV-3。2216E培養基篩選出來的菌株為4株，分別為QDE-1，QDE-2，QDE-5，QDE-7。其中QDV-3和QDE-5菌株所產透明圈直徑和菌落直徑比值較大。表I章魚腸道產蛋白酶菌株初篩結果
權利要求
1.一種章魚腸道產蛋白酶菌株，其特征在于所述菌株為Bacillus sp. QDV-3，CGMCCNo. 6561,其16S rRNA序列如序列表I所示,所述Bacillus sp. QDV-3菌株為革蘭氏陽性菌，桿狀，兩端鈍圓，有芽孢；菌落為乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊濕潤的光滑型小菌落。
2.Bacillus sp. QDV-3菌株在生產用于發酵章魚下腳料的蛋白酶方面的應用，Bacillus sp. QDV-3菌株的發酵條件為液體培養基中各物質的質量濃度為果糖O. 5%，蛋白胨O. 5%，酵母膏O.1 %，磷酸高鐵O. Ol % ;培養基初始pH8. O,培養溫度30°C的條件下振蕩培養3. 5天。
3.根據權利要求2所述的Bacillussp. QDV-3菌株在生產用于發酵章魚下腳料的蛋白酶方面的應用，其特征在于培養基中還加入金屬離子Mn2+或Ba2+。
全文摘要
本發明一種章魚腸道產蛋白酶菌株及其應用，屬于生物工程技術領域。該章魚腸道產蛋白酶菌株Bacillus sp.QDV-3，CGMCC No.6561，為革蘭氏陽性菌，桿狀，兩端鈍圓，有芽孢，菌落為乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊濕潤的光滑型小菌落。該菌株用于章魚下腳料發酵中產蛋白酶方面的應用，其液體發酵條件為液體培養基中各物質的質量濃度為果糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，磷酸高鐵0.01％；培養基初始pH8.0，培養溫度30℃的條件下振蕩培養3.5天。本發明篩選得到的Bacillus sp.QDV-3菌株具有有效地發酵章魚下腳料，避免了海洋環境的污染，減輕了企業的經濟負擔的優點。
文檔編號C12N9/54GK103060226SQ20121040246
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者樸美子, 王鳳舞, 金玉蘭 申請人:青島農業大學