專利名稱：一種寡聚核苷酸的修飾方法，由該方法得到的修飾寡聚核苷酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種寡聚核苷酸的修飾方法，還涉及由該方法制備得到的修飾寡聚核苷酸及其應用。本發明屬于生物技術領域。
背景技術：
基于核酸的一些藥物如反義寡核苷酸、肽核酸以及很有希望的小干擾RNA(SiRNA)要想發展成為有用的治療藥物，提高其跨膜能力以及耐穩定性是必須解決的關鍵問題之一。很多技術已經被用來提高這類化合物的藥代動力學性質，例如，通過寡核苷酸序列上的堿基修飾，糖環修飾以及骨架替換等策略提高其血清穩定性；通過脂質體和納米聚合物包裹等方法提高寡核苷酸的跨膜，這些方法有其優勢也有不足。如脂質體轉運引起不同程度的副作用，骨架修飾導致與靶mRNA結合能力降低，進而導致活性下降。而通過將透膜性肽、膽固醇等疏水性分 子綴合于寡核苷酸的末端來提高其跨膜能力已有很多研究。此外寡核苷酸硫代修飾能夠提高耐酶穩定性也有很多報道。但是將兩種策略進行組合，利用兩種修飾策略的優勢進行組合修飾目前還沒有報道。因此，這里我們提供的策略組合，能夠有效利用兩種策略的優勢，同時避免單種策略的不足，提高寡聚核苷酸的成藥性。

發明內容
本發明提供了一種寡聚核苷酸的修飾方法，即組合末端修飾和中間磷酸部分修飾兩種策略，如將透膜性的多肽或者疏水性分子綴合于寡聚核苷酸末端的同時，對序列進行硫代或硒代修飾。通過這種策略修飾能夠提高寡核苷酸的藥代動力學性質，進而提高其成藥性。本發明的一種寡聚核苷酸的修飾方法，其特征在于包括以下步驟:( I)合成綴合物分子:所述的綴合物分子為功能性分子，包括多肽，醇類、靶向性分子以及人體必需的分子;(2)連接臂的形成綴合物分子與寡聚核苷酸共價綴合的連接臂是通過化學反應形成共價鍵得到；(3)寡聚核苷酸的合成及修飾在合成的連有連接臂的綴合物分子的基礎上進一步合成寡聚核苷酸，并對寡聚核苷酸上磷酸部分非橋聯的氧原子用硫原子或硒原子進行取代，完成目標寡聚核苷酸的修飾。 在本發明中，優選的，步驟(I)中所述的多肽包括透膜性肽序列，所述的醇類包括疏水性的油醇、膽固醇，所述的靶向性分子包括甘露糖、半乳糖，所述的人體必需的分子包括維生素E以及抗體。在本發明中，優選的，步驟(2)中所述的共價鍵包括磷酸二酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、硫醚鍵以及通過Click反應以及Diels-Alder反應構建的共價鍵。在本發明中，優選的，步驟(3)中所述的寡聚核苷酸包括反義寡核苷酸、RNA、適配體、二聚物以及三聚物。在本發明中，步驟(3)中硫代修飾或硒代修飾的數量為寡聚核苷酸中的一個至序列中全部的磷酸被修飾。在本發明中，步驟(3)中綴合修飾的末端位于寡聚核苷酸的3’端、5’端或者同時位于3’端和5’端。進一步的，本發明還提供了由以上任一項所述的方法合成的修飾寡聚核苷酸。采用的本發明的方法制備得到的修飾寡聚核苷酸其由四部分組成，如圖1所示，I為綴合物分子；11為連接臂；111為寡聚核苷酸；IV為修飾位點。在本發明的一個具體實施例中，所述的修飾寡聚核苷酸中綴合物分子為一信號肽序列，寡聚核苷酸為編碼轉化生長因子3型受體mRNA的反義寡核苷酸，且從5’端起第6_16為核苷酸之間的磷酸骨架中非橋聯的氧原子被硫原子取代，所述的信號肽序列與所述的反義寡核苷酸的3’端通過共價鍵綴合。更進一步的，本發明還提供了所述的修飾寡聚核苷酸在制備拮抗轉化生長因子3型受體藥物中的應用。


圖1為本發明的修飾后的寡核苷酸結構示意圖；圖2為本發明實施例的反應流程圖；圖3為修飾反義核酸MlOS顯示劑量依賴性的活性；圖4為天然未修飾反義核酸不具有劑量依賴性。
具體實施例方式下面通過實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。本發明的一種寡聚核苷酸的修飾方法，包括以下步驟:( 1)綴合物分子的合成方法根據本發明，綴合的分子多為一些功能性的分子，如透膜性肽序列，疏水性的油醇、膽固醇，靶向性分子如甘露糖、半乳糖，人體必需的分子如維生素E以及抗體等。這些功能性分子大多可以商業獲得。對于需要合成的分子如透膜性肽等可用成熟的Fmoc，Boc化學制備。(2)連接臂的形成根據本發明，將綴合物分子與寡核苷酸鏈接的連接臂主要通過化學反應形成共價鍵得到。這樣的共價鍵均屬于常規的化學反應，包括但不限于磷酸二酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、硫醚鍵、通過“Click”反應以及Diels-Alder反應(Kui Lu, Qun-Peng Duan等，Bioconjugate Chem.2010, 21, 187 - 202 ；Natarajan Venkatesan and Byeang Hyean Kim,Chem.Rev.2006，106，3712-3761)形成的共價鍵等。(3)寡核苷酸磷酸骨架部分的修飾
磷酸骨架修飾主要包括但不限于硫代，硒代修飾等。以硫代修飾為例，可以采取全部硫代或者部分硫代，通過購買商用的硫代試劑如EDITH，DTD, PADS, DDTT以及Beaucage試劑(結構式如下所示)，在寡核苷酸合成過程中通過對合成儀設置而實現任何單位點、部分或者全部硫代。
O
S-SS-S
o、0丨 DDTTEDITH
Beaocage reagent (sutfurizing reagent 11)
xn^s^syn'-
PADS °OTD 0為了更好地理解本發明，通過實例進行說明。實施例1以氨化的CPG樹脂為載體，首先通過Spacer增加樹脂的溶脹性及降低反應空間位阻。然后米用Boc方法合成/[目號妝序列，合成的彳目號條序列為Lys-Ala-Leu-Leu-Ala-Leu,脫除末端氨基Boc保護基，與2，2- 二甲基-3-甲氧基三苯甲氧基丙酸縮合，最后用標準亞磷酰化法在ABI 394合成儀上合成目標寡核苷酸，該目標寡核苷酸為靶向miR-328的反義寡核苷酸，其具體序列為5’ -ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3’，miR-328能夠使靶轉化生長因子3型受體(TGFiiRIII)的表達下 降，通過反義寡聚核苷酸沉默miR-328從而使受體蛋白表達增加。合成規模為I μ mol，堿基偶聯時間為30秒，重復偶聯3次。硫代序列合成時，用硫代試劑苯乙酰二硫化物(PADS，0.2M)代替12液，并延長氧化時間由15秒延長至600秒，反應流程圖2所示。利用上述實例我們制備了反義核酸3’端肽綴合修飾且從5’端起第6-16位核苷酸之間的磷酸骨架硫代修飾的寡核苷酸修飾物(MlOS)，蛋白水平實驗表明，這種修飾物有明顯的劑量依賴性，而未修飾的天然序列則沒有顯示劑量依賴性的特點，如圖3、圖4所示。本文顯示并詳細描述的信息足以實現本發明的上述目的，因此本發明的優選實施方案代表本發明的主題，該主題為本發明所廣泛涵蓋。本發明的范圍完全涵蓋其它對本領域技術人員來說顯而易見的實施方案，因此，本發明的范圍不被除所附權利要求之外的任何內容所限制，其中除了明確說明外，所用元素的單數形式并不是指“一個和唯一”，而是指“一個或更多”。對本領域一般技術人員來說，所有公知的上述優選的實施方案和附加實施方案部分的結構、組成和功能上的等價物因此引入本文作參考，而且試圖被本發明的權利要求所涵蓋。此外，不需要某種設備或方法來表達本發明所解決的每個問題，因為它們都已包括在本發明的權利要求之內。另外，無論本發明公開事實中的所有部分、成分，或者方法步驟是否在權利要求中被明確敘述，它們都沒有貢獻給公眾。但是，對本領域普通技術人員來說，很明顯在不背離如所附權利要求中所闡明的本發明的實質和范圍的前提下，可以在形式、試劑和合成細節上做出各種改變和修飾。
權利要求
1.一種寡聚核苷酸的修飾方法，其特征在于包括以下步驟: (1)合成綴合物分子 所述的綴合物分子為功能性分子，包括多肽，醇類、靶向性分子以及人體必需的分子； (2)連接臂的形成 綴合物分子與寡聚核苷酸共價綴合的連接臂是通過化學反應形成共價鍵得到； (3)寡聚核苷酸的合成及修飾 在合成的連有連接臂的綴合物分子的基礎上進一步合成寡聚核苷酸，并對寡聚核苷酸上磷酸部分非橋聯的氧原子用硫原子或硒原子進行取代，完成目標寡聚核苷酸的修飾。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述的多肽包括透膜性肽序列，所述的醇類包括疏水性的油醇、膽固醇，所述的靶向性分子包括甘露糖、半乳糖，所述的人體必需的分子包括維生素E以及抗體。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的共價鍵包括磷酸二酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、硫醚鍵以及通過Click反應以及Diels-Alder反應構建的共價鍵。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的寡聚核苷酸包括反義寡核苷酸、RNA、適配體、二聚物以及三聚物。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中硫代修飾或硒代修飾的數量為寡聚核苷酸中的一個至序 列中全部的磷酸被修飾。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中綴合修飾的末端位于寡聚核苷酸的3’端、5’端或者同時位于3’端和5’端。
7.由權利要求1-6任一項所述的方法合成的修飾寡聚核苷酸。
8.如權利要求7所述的修飾寡聚核苷酸，其特征在于所述的修飾寡聚核苷酸中綴合物分子為一信號肽序列，寡聚核苷酸為編碼轉化生長因子3型受體mRNA的反義寡核苷酸，且從5’端起第6-16位的核苷酸之間的磷酸骨架中非橋聯的氧原子被硫原子取代，所述的信號肽序列與所述的反義寡核苷酸的3’端通過共價鍵綴合。
9.權利要求8所述的修飾寡聚核苷酸在制備拮抗轉化生長因子3型受體藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種寡聚核苷酸的修飾方法，由該方法得到的修飾寡聚核苷酸及其應用。本發明的目的是通過這種修飾改善目的寡聚核苷酸的藥代動力學性質和成藥性。本發明的一種寡聚核苷酸修飾方法，結合了寡核苷酸末端修飾和骨架修飾兩種策略，能夠有效解決寡聚核苷酸藥物的一些不足，具有潛在的藥物開發前景。本發明的一種寡聚核苷酸的修飾方法，方法簡單，容易操作，便于規模化制備。
文檔編號C12N15/113GK103243086SQ20121040783
公開日2013年8月14日 申請日期2012年10月23日 優先權日2012年10月23日
發明者楊振軍, 王曉鋒, 初文峰, 楊寶峰 申請人:北京大學