專利名稱：與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記、其獲得方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程和小麥抗病遺傳育種領(lǐng)域，具體地涉及與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記、其獲得方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由條型柄鎊菌(Pucciniastriiformis West.f.sp.tritici, Pst)引起的小麥條銹病是世界性氣傳葉部病害，病原菌可通過氣流在高空遠(yuǎn)距離傳播，導(dǎo)致該病害在不同的小麥生產(chǎn)區(qū)域流行，特別是在冷涼或高海拔地區(qū)危害尤為嚴(yán)重，造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)。中國是世界上最大且相對獨(dú)立的小麥條銹病流行區(qū)。新毒性小種的產(chǎn)生和流行更加劇了條銹病成災(zāi)趨勢，使中國小麥再度處于條銹病大流行的威脅中。因此，迫切需要尋找并引入新的抗病基因，增強(qiáng)小麥栽培品種的抗性，以滿足生產(chǎn)需要?？共⌒禄虻陌l(fā)掘及鑒定是育種工作的基礎(chǔ)，也是解決抗性喪失這一難題的根本途徑。研究表明，小麥條銹病的抗性主要由主基因控制。目前，我國小麥抗條銹病育種面臨嚴(yán)峻局面，一方面我國小麥主栽品種或骨干親本完全喪失抗性；另一方面，我國目前的主栽品種抗性遺傳基礎(chǔ)狹隘，抗源單一。這一現(xiàn)狀已經(jīng)構(gòu)成小麥抗條銹病育種的瓶頸。因此，發(fā)掘抗條銹新病基因并高效轉(zhuǎn)育到現(xiàn)有品種中已經(jīng)成為我國小麥抗條銹病育種中的重要任務(wù)。利用分子標(biāo)記對抗性基因進(jìn)行精確定位，將有助于抗源的有效利用。利用分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位具有簡單、快速、精確等優(yōu)點(diǎn)。目前，主要利用RAPD、SSR、AFLP、RGAP、RFLP等幾種DNA分子標(biāo)記技術(shù)在50個正式命名的抗條銹病主效基因和暫定名的抗條銹主效基因中已經(jīng)找到了與48個抗條銹基因連鎖的分`子標(biāo)記。在所有的標(biāo)記技術(shù)中，利用SSR和RGAP技術(shù)進(jìn)行條銹病抗性基因定位已成為兩種主要方式。其中，由于SSR標(biāo)記技術(shù)具有數(shù)量豐富、多態(tài)性、遺傳上通常為共顯性、操作簡便、結(jié)果可靠和易于交流等優(yōu)點(diǎn)，目前利用該技術(shù)已成功篩選和鑒定多個條銹病抗性基因(如Yr2、Yr5等)。另外，一種基于抗病基因保守序列設(shè)計引物，進(jìn)而擴(kuò)增植物抗病基因的一種分子標(biāo)記技術(shù)——RGAP (抗病基因類似序列擴(kuò)增多態(tài)性)已日漸成為標(biāo)記條銹病抗性基因的主要技術(shù)手段，利用該技術(shù)已對Yr5、Yr9、Yr39、Yr43、Yr44、YrExpl、YrExp2、等基因進(jìn)行了標(biāo)記。但基于單一或少數(shù)組合的分離群體而得到的條銹病抗性基因連鎖標(biāo)記，通用性常受品種背景的限制；而且多數(shù)標(biāo)記距目標(biāo)基因較遠(yuǎn)，導(dǎo)致這些標(biāo)記在育種中的應(yīng)用不多。引自國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)的小麥新種質(zhì)HRMSN-81，經(jīng)多年多點(diǎn)田間條銹病抗性鑒定表明，該種質(zhì)對我國目前條銹病菌流行生理小種具有良好抗性。遺傳分析表明，HRMSN-81含有一對抗我國條中31、32和33混合生理小種的顯性基因。因此，篩選該抗性基因連鎖分子標(biāo)記，可望直接應(yīng)用于小麥抗病品種的選育，以提高選擇效率和加快小麥抗病育種進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本申請的發(fā)明人提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供及與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的再一目的是提供獲得上述與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用。本發(fā)明針對上述研究背景，以HRMSN-81/臺長29的F2群體為作圖群體，通過抗病性鑒定結(jié)果和RGAP標(biāo)記數(shù)據(jù)間的連鎖分析，獲得了與小麥條銹病抗性基因連鎖的標(biāo)記Xwgp-16_，該標(biāo)記可應(yīng)用于小麥條銹病抗病品種的輔助選擇育種。根據(jù)本發(fā)明的與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記，通過使用簡并引物:上游引物:5’ -AAGTGGAACAAGGTTACG-3’;下游引物:5’ -GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’ 擴(kuò)增而得，所述分子標(biāo)記的大小為160bp，其定位在小麥2D短臂上，遺傳距離為3.4cM。本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記在鑒定小麥抗條銹病方面的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例方式，以抗病品種HRMSN-81與感病品種川農(nóng)16為親本的雜交組合的高代(F5)單個小麥株系(L1-L5)對象，通過檢測其特異分子標(biāo)記Xwgp_16(lbp的帶型數(shù)據(jù)，結(jié)合田間抗病鑒定表型數(shù)據(jù)，可以預(yù)測該株系對小麥條銹病的抗性。根據(jù)本發(fā)明的鑒定小麥抗條銹病的方法包括使用簡并引物:上游引物:5’ -AAGTGGAACAAGGTTACG-3’ ；下游引物:5’ -GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’ 進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法，所述方法包括以下步驟:(I)以感病小麥品種臺長29為母本，抗病品種HRMSN-81為父本，構(gòu)建&遺傳作圖群體，構(gòu)建的F2群體為抗條銹病基因遺傳作圖群體；(2)用提取小麥親本幼苗及其F2群體單株DNA ；(3)采用抗病基因類似序列多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行小麥條銹病抗性分子標(biāo)記的篩選，其中，使用簡并引物:上游引物:5’ -AAGTGGAACAAGGTTACG-3’ ；下游引物:5’ -GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’擴(kuò)增抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體得到RGAP特異分子標(biāo)記Xwgp-16(lbp，經(jīng)過連鎖性鑒定，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與小麥條銹病抗性基因連鎖。根據(jù)本發(fā)明的獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法，其中，采用RGAP分子標(biāo)記進(jìn)行篩選與小麥抗條銹病基因相連鎖分子標(biāo)記的方法是:(I)使用RGAP引物在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體中進(jìn)行DNA多態(tài)性分析；(2)分子標(biāo)記的連鎖性分析:對HRMSN-81與感病親本臺長29雜交獲得的F2單株抗性進(jìn)行田間鑒定，調(diào)查F2單株抗病性，分別提取F2單株DNA，用與步驟(I)同樣的反應(yīng)體系、引物及程序進(jìn)行單株P(guān)CR擴(kuò)增，統(tǒng)計抗、感單株標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計算交換值計算標(biāo)記與抗條銹病基因之間的遺傳距離。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明所提供的與小麥條銹病抗性基因連鎖的RGAP標(biāo)記Xwgp_16(lbp,是通過以下方法獲得的:I)以感病小麥品種臺長29為母本，抗病品種HRMSN-81為父本，構(gòu)建F2遺傳作圖群體，分單株收獲F2:3家系的種子用于抗性鑒定；2)以SDS方法提取親本、抗病基因池、感病基因池及F2代的DNA。3)根據(jù)Shi等在2001年發(fā)表的引物相關(guān)信息(2001，Genome 44 =509-516)合成RGAP引物，PCR后采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)；4)利用條中31、32和條中33條銹病生理混合小種對HRMSN-81與感病親本臺長29雜交、自交獲得的F2單株抗性進(jìn)行田間鑒定，條銹病接種在兩葉一心的小麥苗，將條銹病菌人工接種至病害鑒定圃的誘發(fā)行上，通過自然傳播接種，當(dāng)誘發(fā)行完全發(fā)病時，測定F2單株抗病性，調(diào)查級別分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、感(S)和高感(HS)五級。其中，測定病級為高抗(HR)、抗(R)或中抗的單株確定為抗病，而測定病級為中感或高感的單株確定為感病。5)利用條中31、32和條中33條銹病生理混合小種對HRMSN-81與感病親本臺長29雜交、自交獲得的F2:3株系抗性進(jìn)行田間鑒定，條銹病接種在分蘗期的小麥苗，將條銹病菌人工接種至病害鑒定圃的誘發(fā)行上，通過自然傳播接種，當(dāng)誘發(fā)行完全發(fā)病時，測定F2:3株系各單株抗病性，調(diào)查級別分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、感(S)和高感(HS)五級。其中，測定病級為高抗(HR)、抗(R)或中抗(MR)的單株確定為抗病，而測定病級為感(S)或高感(HS)的單株確定為 感病。6)結(jié)合4)和5)結(jié)果，確定F2單株抗病性及攜帶抗病基因雜合性。7)用SDS法提取小麥親本幼苗及其F2群體單株DNA ;并根據(jù)6)結(jié)果，分別篩選15個抗病基因純合F2單株和15個感病基因純合F2單株等量DNA混合，構(gòu)建抗病基因池和感病基因池。8)采用RGAP分子標(biāo)記方法進(jìn)行小麥條銹病抗性基因分子標(biāo)記的篩選，其具體獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法是:(I) RGAP引物在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及其它們的F2單株間DNA多態(tài)性分析:用RGAP標(biāo)記技術(shù)篩選，根據(jù)Shi等在2001年發(fā)表的RGAP引物序列合成的引物(2001，Genome 44:509_516)，在 AB1-9700PCR 儀上進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:25ng/y I 小麥基因組 DNA 2.5 μ I, 10XPCR Buffer 2.5 μ l,25mM MgCl23 μ 1,2.5mMdNTP1.5μ 1，100μΜ 引物 0.5μ 1，2.5υ/μ I Taq DNA 聚合酶 0.6 μ 1，ddH20 14.4 μ 1，總體系25 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 V變性5分鐘，94 V變性30秒，45 V退火45秒，72 V延伸I分鐘，45個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；產(chǎn)物檢測:8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，點(diǎn)擊緩沖液為1XTBE，恒定功率90瓦。凝膠染色采用硝酸銀染色；照相并在白光燈箱上記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)分子標(biāo)記的連鎖性鑒定:根據(jù)連鎖遺傳定律，按照MapmakerEXP3.0b軟件要求，將抗病親本HRMSN-81和抗病基因池相同的帶型賦值為“A”，與感病親本臺長29和感病基因池相同的帶型賦值為“B”，同時擴(kuò)增出抗病親本、抗病基因池和感病親本、感病基因池兩種帶型的賦值為“H”，帶型不清楚或缺失的賦值為結(jié)合4)田間抗病性鑒定結(jié)果，用Kosambi函數(shù)算出遺傳距離。9)篩選出一個RGAP分子標(biāo)記Xwgp_16(lbp，由抗病基因類似序列簡并引物(上游引物:AAGTGGAACAAGGTTACG ;下游引物:5’ -GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’)擴(kuò)增抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體，發(fā)現(xiàn)在160bp處存在一標(biāo)記，經(jīng)過連鎖性鑒定，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與小麥條銹病抗性基因連鎖。進(jìn)而，將上述與小麥條銹病抗性基因相連鎖RGAP分子標(biāo)記Xwgp_16一定位于小麥2D染色體短臂上，其具體定位的方法是:(I)以SDS方法提取抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及一套小麥缺體-四體(包括:N1AT1D、N1BT1D、N1DT1B、N2AT2D、N2BT2D、N2DT2A、N3AT3D、N3BT3D、N3DT3A、N4AT4D、N5AT5D、N5DT5A、N6AT6D、N6BT6D、N7AT7D、N7BT7D、N7DT7A)及 2D 染色體雙端體(Dt2DS 和 Dt2DL)遺傳材料 DNA。(2)分子標(biāo)記Xwgp_16一在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及一套小麥缺體-四體及2D染色體雙端體遺傳材料間DNA多態(tài)性分析:抗病基因類似序列簡并引物(上游引物:5’ -AAGTGGAACAAGGTTACG-3’ ；下游引物:5’ -GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’)，在 AB1-9700PCR 儀上進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:25ng/y I 小麥基因組 DNA 2.5 μ I, 10XPCR Buffer 2.5 μ 1, 25mMMgCl23 μ 1, 2.5mM dNTP1.5μ Ι,ΙΟΟμΜ 引物 0.5μ 1，2.5υ/μ I TaqDNA 聚合酶 0.6μ I，ddH20 14.4μ1，總體系25 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 V變性5分鐘，94 V變性30秒，45 V退火45秒，72 V延伸I分鐘，45個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；產(chǎn)物檢測:8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，點(diǎn)擊緩沖液為1XTBE，恒定功率90瓦。凝膠染色采用硝酸銀染色；照相并在白光燈箱上記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(3)分子標(biāo)記Xwgp_16(lbp在染色體上的定位鑒定:在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及一套小麥缺體-四體及2D染色體雙端體遺傳材料間擴(kuò)增出的DNA譜帶中找到一條160bp大小的多態(tài)性帶紋，該譜帶在一套小麥缺體-四體及2D染色體 雙端體遺傳材料中表現(xiàn)缺失的染色體或染色體臂即被定位到相應(yīng)的染色體和染色體臂上。10)分子標(biāo)記Xwgp_16一在抗性基因輔助選擇的應(yīng)用，其具體的方法是:(I)利用條中31、32和條中33條銹病生理混合小種對抗病品種HRMSN-81與感病品種川農(nóng)16為親本的雜交組合的高代^5)5個小麥株系化1-1^5)、11個與抗病品種HRMSN-81無親緣關(guān)系的小麥育成品種(包括:內(nèi)麥8號、內(nèi)麥9號、科成麥2號、川麥47、川麥42、川農(nóng)16、綿麥4號、綿陽3號、綿陽26、綿陽29、川輻5號)抗性進(jìn)行田間鑒定，條銹病接種在兩葉一心的小麥苗，將條銹病菌人工接種至病害鑒定圃的誘發(fā)行上，通過自然傳播接種，當(dāng)誘發(fā)行完全發(fā)病時，測定F2單株抗病性，調(diào)查級別分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、感(S)和高感(HS)五級。其中，測定病級為高抗(HR)、抗(R)或中抗的單株確定為抗病，而測定病級為中感或高感的單株確定為感病。(2 )用SDS法提取(I)提及小麥材料DNA ；(3)分子標(biāo)記Xwgp_16(lbp在(2) DNA多態(tài)性分析:抗病基因類似序列簡并引物(上游引物:5’ AAGTGGAACAAGGTTACG-3’ ；下游引物:5’ -GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’)，在 AB1-9700PCR 儀上進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:25ng/y I 小麥基因組 DNA 2.5 μ I, 10XPCR Buffer 2.5 μ l,25mM MgCl23 μ 1,2.5mM dNTP1.5μ Ι,ΙΟΟμΜ 引物 0.5μ 1，2.5υ/μ ITaq DNA 聚合酶 0.6 μ I，ddH20 14.4μ1，總體系25 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 V變性5分鐘，94 V變性30秒，45 V退火45秒，72 V延伸I分鐘，45個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；產(chǎn)物檢測:8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，點(diǎn)擊緩沖液為1XTBE，恒定功率90瓦。凝膠染色采用硝酸銀染色；照相并在白光燈箱上記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(4)利用分子標(biāo)記Xwgp_16(lbp對抗性基因的鑒定:在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及抗病品種HRMSN-81與感病品種川農(nóng)16為親本的雜交組合的高代(F5)5個小麥株系(Ll-L5)、ll個與抗病品種HRMSN-81無親緣關(guān)系的小麥育成品種(包括:內(nèi)麥8號、內(nèi)麥9號、科成麥2號、川麥47、川麥42、川農(nóng)16、綿麥4號、綿陽3號、綿陽26、綿陽29、川輻5號)材料間擴(kuò)增出的DNA譜帶中找到一條160bp大小的多態(tài)性帶紋，該譜帶在感病親本、感病基因池和11個與抗病品種HRMSN-81無親緣關(guān)系的小麥育成品種(包括:內(nèi)麥8號、內(nèi)麥9號、科成麥2號、川麥47、川麥42、川農(nóng)16、綿麥4號、綿陽3號、綿陽26、綿陽29、川福5號)中表現(xiàn)缺失，而在抗病親本、抗病基因池及抗病品種HRMSN-81與感病品種川農(nóng)16為親本的雜交組合的高代(F5)5個抗病小麥株系(L1-L5)中表現(xiàn)存在，結(jié)合田間表型抗性鑒定結(jié)果，從而證實(shí)該抗性基因特異分子標(biāo)記Xwgp_160bp可以預(yù)測抗性基因在小麥材料中的存在。本發(fā)明的積極性效果及應(yīng)用如下:1、本發(fā)明使用的PCR體系，不需要特殊的PCR儀器和特殊的反應(yīng)試劑，普通商業(yè)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品均能達(dá)到要求。2、本發(fā)明獲得的與條銹病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，是在對我國條銹病高抗的小麥新種質(zhì)HRMSN-81及其遺傳作圖群體中獲得的新的標(biāo)記，該標(biāo)記與抗性基因遺傳距離近，PCR擴(kuò)增重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，可以用于小麥條銹病品種鑒定和小麥抗病后代的分子輔助選擇，進(jìn)而加快抗病品種的育種進(jìn)程。3、為克隆小麥抗條銹病基因、基因序列分析以及轉(zhuǎn)抗條銹病基因小麥研究奠定了良好的基礎(chǔ)。


圖1顯示RGAP標(biāo)記Xwgp_16(lbp在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及其F2群體中的擴(kuò)增。(RP為抗病親本HRMSN-81 ；SP為感病親本臺長29 ；RB為抗病基因池；SB為感病基因池；R為抗病表型；S為感病表型；“ + ”為具有特異標(biāo)記為無特異標(biāo)記帶；箭頭表示RGAP標(biāo)記Xwgp_16(lbp)。圖2顯示RGAP標(biāo)記Xwgp_16(lbp在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及小麥缺體-四體和2D雙端體遺傳材料中的PCR擴(kuò)增。(RP為抗病親本HRMSN-81 ；SP為感病親本臺長29 ；RB為抗病基因池；SB為感病基因池；黑色實(shí)心箭頭表示RGAP標(biāo)記Xwgp_16一 ；白色空心箭頭表示特異標(biāo)記帶缺失染色體或染色體臂)。圖3顯示RGAP標(biāo)記Xwgp_16(lbp在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及抗病品種HRMSN-81與感病品種川農(nóng)16為親本的雜交組合的高代(F5)5個小麥株系(L1-L5)、11個與抗病品種HRMSN-81無親緣關(guān)系的小麥育成品種(包括:內(nèi)麥8號、內(nèi)麥9號、科成麥2號、川麥47、川麥42、川農(nóng)16、綿麥4號、綿陽3號、綿陽26、綿陽29、川輻5號的PCR擴(kuò)增。(RP為抗病親本HRMSN-81 ；SP為感病親本臺長29 ； RB為抗病基因池；SB為感病基因池；黑色實(shí)心箭頭表示RGAP標(biāo)記Xwgp_16(lbp)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:與小麥條銹病抗性基因連鎖的RGAP分子標(biāo)記Xwgp_16(lbp的獲得1、供試材料植物材料:以感病品種臺長29為母本，抗病新種質(zhì)HRMSN-81為父本，構(gòu)建F2遺傳作圖群體。2010年正季將F2群體的148個單株種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)溫江試驗(yàn)基地病害鑒定圃，用于抗性鑒定。苗期取各單株的部分葉片，用于RGAP分析。成熟時，收獲F2:3家系的種子，晾干保存，2011年用于抗性鑒定。條銹病菌混合生理小種:用于F2群體及F2:3家系抗性鑒定的條銹病菌混合生理小種由條中31、32和33三個小種等量混合組成。2、抗性鑒定田間試驗(yàn)設(shè)計:2010年及2011年正季，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)溫江試驗(yàn)基地病害鑒定圃分別將感病品種臺長29、抗病新種質(zhì)HRMSN-81及其F2群體和F2:3家系單粒播種，行長2.0m,行距20cm，每行播種10粒，每間隔20行設(shè)置一行感病對照品種SY95-71，在鑒定圃周圍分別種植I行用于條銹病誘發(fā)感病品種SY95-71和Taichung29?？剐澡b定:采用人工接種方式進(jìn)行田間抗性鑒定。當(dāng)小麥幼苗長至二葉一心時用涂抹法對條銹病誘發(fā)感病品種SY95-71和感病親本Taichung29進(jìn)行單株人工接種。待感病親本臺長29發(fā)病充分后，記載抗病性。按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行條銹病抗性鑒定:`
高抗(HR):無可見侵染；抗(R):僅產(chǎn)生枯死斑點(diǎn)或失綠反應(yīng),無夏孢子堆；中抗(MR):夏孢子堆較小，周圍有枯死或失綠反應(yīng)；感(S):夏孢子堆中等，周圍無枯死或失綠反應(yīng)；高感(HS):夏孢子堆大，周圍無枯死或失綠反應(yīng)。鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2群體中表現(xiàn)為感病的有35株，其后代F2:3株系表現(xiàn)均為感??；F2表現(xiàn)為抗病的有113株，其對應(yīng)的F2:3中全部植株表現(xiàn)為抗性的有38個株系，而表現(xiàn)為抗感分離的株系有75個。F2群體抗感分離比符合3:1，F(xiàn)2:3株系抗感分離比符合1:2:1，說明抗病新種質(zhì)HRMSN-81攜帶了一個顯性主效抗條銹病基因。3、基因組DNA提取采用CTAB法提取基因組DNA。取2g新鮮幼嫩葉片，液氮研磨成細(xì)粉后加預(yù)熱至65。。的 2XCTAB 提取液(2%CTAB,1.4M NaCl,0.1MTris-HCl (ρΗ8.0),0.1M EDTA (ρΗ8.0),臨用前加2%β -巰基乙醇15ml，混勻。65°C水浴30_45min，其間輕搖混勻。冷卻至室溫后加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，輕輕混勻至上清液呈牛奶狀，4000rpm 離心 lOmin。取上清液，加等體積異丙醇，置于冰浴沉淀DNA。勾出DNA，用70%酒精洗2次，無水乙醇洗一次，氣干DNA，溶于適量pH8.0的TE溶液中。
0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。紫外分光光度法測定各樣品DNA濃度，將各樣品DNA稀釋至25ng/ μ I備用。4、RGAP 分析從Shi等在2001年發(fā)表論文的引物相關(guān)信息(2001，Genome 44:509-516)獲得13條引物序列(由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成)，這些引物共組成78對引物組合。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照Shi等(2001)的方法，具體如下:I) PCR 反應(yīng)體系(25 μ I)
權(quán)利要求
1.與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，使用簡并引物:上游引物:5’ -AAGTGGAACAAGGTTACG-3’ ；下游引物:5’ -GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’ 擴(kuò)增而得。
2.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在鑒定小麥抗條銹病方面的應(yīng)用。
3.一種鑒定小麥抗條銹病的方法，其特征在于，所述方法包括使用簡并引物:上游引物:5’ -AAGTGGAACAAGGTTACG-3’ ；下游引物:5’ -GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’ 進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。
4.一種獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)以感病小麥品種臺長29為母本，抗病品種HRMSN-81為父本，構(gòu)建F2遺傳作圖群體，構(gòu)建的F2群體為抗條銹病基因遺傳作圖群體； (2)用提取小麥親本幼苗及其F2群體單株DNA； (3)采用抗病基因類似序列多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行小麥條銹病抗性分子標(biāo)記的篩選，其中，使用簡并引物:上游引物:5’ -AAGTGGAACAAGGTTACG-3’ ；下游引物:5’ -GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’擴(kuò)增抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體得到RGAP特異分子標(biāo)記Xwgp-16(lbp，經(jīng)過連鎖性鑒定，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與小麥條銹病抗性基因連鎖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，采用RGAP分子標(biāo)記進(jìn)行篩選與小麥抗條銹病基因相連鎖分子標(biāo)記的方法是: (1)使用RGAP引物在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體中進(jìn)行DNA多態(tài)性分析； (2)分子標(biāo)記的連鎖性分析:對HRMSN-81與感病親本臺長29雜交獲得的F2單株抗性進(jìn)行田間鑒定，調(diào) 查F2單株抗病性，分別提取F2單株DNA，用與步驟(I)同樣的反應(yīng)體系、弓丨物及程序進(jìn)行單株P(guān)CR擴(kuò)增，統(tǒng)計抗、感單株標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計算交換值計算標(biāo)記與抗條銹病基因之間的遺傳距離。
全文摘要
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程和小麥抗病遺傳育種領(lǐng)域，具體地涉及與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記、其獲得方法及應(yīng)用。所述與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記是通過使用簡并引物上游引物5’-AAGTGGAACAAGGTTACG-3’；下游引物5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’擴(kuò)增而得。該標(biāo)記可用于小麥抗條銹病的輔助選擇育種，可克服常規(guī)育種中小麥條銹病抗性鑒定易受環(huán)境影響、穩(wěn)定性和重復(fù)性較差、工作量大、費(fèi)時費(fèi)力、育種周期長等缺點(diǎn)，進(jìn)而加快小麥抗條銹病品種的育種進(jìn)程。
文檔編號C12N15/11GK103074333SQ20121040796
公開日2013年5月1日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者鄭有良, 陳國躍, 陳時盛, 魏育明, 劉亞西, 蒲至恩, 鄧梅 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)