本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域，特別涉及一種核酸檢測的復(fù)合物及其制備方法與核酸檢測的方法。

背景技術(shù)：

眾所周知，核酸與病原基因和遺傳疾病、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡以及癌癥的發(fā)生、發(fā)展存在著重要的聯(lián)系。生物的組織、細(xì)菌、病毒均具有獨特的核酸序列，這些特定序列的檢測在基因分析、疾病診斷、食品污染、法醫(yī)鑒定和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域起著重要作用。研究新的核酸檢測技術(shù)對促進(jìn)生物功能研究、疾病診斷以及相關(guān)基因藥物開發(fā)具有重大意義。

在過去的幾十年中，特定核酸序列的檢測方法具有用時長、操作復(fù)雜、費時費力的技術(shù)缺陷。

伴隨著生物放大技術(shù)和納米技術(shù)的迅速發(fā)展，利用新穎的生物放大技術(shù)和特殊性質(zhì)的納米探針，構(gòu)建基于雙倍信號放大的超靈敏核酸傳感器是當(dāng)前的發(fā)展方向。但是由于核酸序列沒有可顯示的信號，核酸的檢測方法，總要對核酸進(jìn)行復(fù)雜的信號標(biāo)記，這使得檢測變得更為復(fù)雜。因此研發(fā)一種高靈敏的、無標(biāo)記的核酸檢測方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

目前所知的納米粒子具有催化的特殊性質(zhì)，因此，能應(yīng)用于很多有機反應(yīng)。而納米粒子的催化活性完全依賴于其表面性質(zhì)，其表面微小的形態(tài)變化可以影響其催化行為，進(jìn)而影響催化產(chǎn)物的數(shù)量。基于上述原理，利用納米粒子的表面性質(zhì)和催化產(chǎn)物數(shù)量的對應(yīng)關(guān)系，可以作為新的設(shè)計思路研發(fā)一種高靈敏的、無標(biāo)記的核酸檢測產(chǎn)品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種核酸檢測復(fù)合物以及制備方法與核酸檢測的方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種核酸檢測復(fù)合物，包括核酸、金納米粒子和氧化石墨烯；所述核酸負(fù)載在納米粒子修飾的氧化石墨烯上。

作為優(yōu)選，所述核酸為單鏈DNA或RNA。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述核酸檢測復(fù)合物中所述核酸的含量依賴于所述負(fù)載金納米粒子氧化石墨烯的含量，而所述納米粒子的含量依賴于所述氧化石墨烯的含量，以達(dá)到飽和負(fù)載為止。

本發(fā)明還提供了所述核酸檢測復(fù)合物的制備方法，金納米粒子與氧化石墨烯結(jié)合，得到金納米粒子負(fù)載的氧化石墨烯，然后與核酸分子結(jié)合得到核酸檢測復(fù)合物。

本發(fā)明還提供了一種核酸檢測的組合物，包括本發(fā)明上述的核酸檢測的復(fù)合物和3-(羥乙基哌嗪)-2-羥基丙磺酸(HEPPSO)。

本發(fā)明還提供了一種核酸檢測的方法，包括以下步驟：

步驟1，將待測樣品加入緩沖溶液中，得到待測溶液；

步驟2，將權(quán)利要求1所述核酸檢測的復(fù)合物溶液與3-羥乙基哌嗪-2-羥基丙磺酸溶液混合，然后與待測溶液混合，檢測其紫外可見吸收光譜；

其中所述核酸檢測的復(fù)合物中的核酸序列為與待測樣品中的核酸序列特異性結(jié)合的序列。

3-(羥乙基哌嗪)-2-羥基丙磺酸可以吸附于金納米粒子的表面，并被金催化得到具有紫外吸收(340nm)的催化產(chǎn)物-酸酐類衍生物。但當(dāng)核酸序列(單鏈的核酸)吸附于金納米粒子表面時，由于核酸分子和金納米粒子的相互作用，阻止了金納米粒子表面和HEPPSO的作用，沒有催化產(chǎn)物產(chǎn)生。當(dāng)與待測溶液混合時，由于待測溶液中的核酸分子和金納米粒子表面核酸分子的相互作用發(fā)生特異性結(jié)合，形成互補配對結(jié)合的雙鏈核酸，會導(dǎo)致金納米粒子表面的核酸分子脫離下來，使得HEPPSO和金納米粒子表面再發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)催化產(chǎn)物的出現(xiàn)，其紫外吸收強度升高。根據(jù)待測溶液中的核酸分子的數(shù)量與催化產(chǎn)物吸收強度增加的對應(yīng)關(guān)系，可以定量檢測核酸分子。

此外，3-(羥乙基哌嗪)-2-羥基丙磺酸還可以判斷所述核酸檢測的復(fù)合物中的核酸分子和金納米粒子是否充分反應(yīng)，判斷該核酸檢測的復(fù)合物是否可用于核酸檢測。所述核酸檢測的復(fù)合物與HEPPSO反應(yīng)，所述復(fù)合物在340nm不出現(xiàn)吸收峰時，即反應(yīng)充分，可用于核酸檢測。

其中，所述3-羥乙基哌嗪-2-羥基丙磺酸溶液的制備方法為HEPPSO溶解于水中，氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.4-7.5。

作為優(yōu)選，所述核酸檢測的復(fù)合物的工作濃度為0.5mg/mL-1mg/mL，所述3-(羥乙基哌嗪)-2-羥基丙磺酸的工作濃度為25mmol/L。

作為優(yōu)選，所述核酸檢測的方法中，所述待測樣品為體液或血清。

所述待測樣品中的核酸包括但不限于病毒核酸或細(xì)菌核酸，還可以為疾病的標(biāo)志物的核酸。如腫瘤標(biāo)志物的核酸。

進(jìn)一步，所述待測樣品中的核酸為單鏈DNA或RNA。

作為優(yōu)選，所述單鏈DNA或RNA的濃度為1.0×10^-11mol/L-2.5×10^-7mol/L。

本發(fā)明所述核酸檢測的方法中所述檢測波長優(yōu)選為340nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的核酸檢測復(fù)合物及核酸檢測的組合物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，同時在室溫條件下可長時間保存，應(yīng)用方便。本發(fā)明提供的核酸檢測的方法無需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，操作簡單、識別靈敏度高，廣泛適用于醫(yī)院臨床疾病和健康狀況診斷。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實施例2中核酸復(fù)合物中加入核酸后催化產(chǎn)物的紫外可見吸收光譜圖，吸收強度隨著分析物濃度的增加而增強；

圖2示實施例2中核酸復(fù)合物對核酸檢測的濃度范圍曲線圖。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種核酸復(fù)合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供的一種核酸檢測的復(fù)合物及其制備方法與核酸檢測的方法，其中所用原料及試劑均可由市場購得。

HEPPSO溶液的配制：將HEPPSO溶解在二次蒸餾水中，利用摩爾濃度為6mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH,得到濃度為100mmol/L，pH值為7.5的HEPPSO溶液

下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實施例1：核酸檢測的復(fù)合物的制備：

將濃度為6nmol/L Au納米粒子與濃度為0.5mg/mL的氧化石墨烯充分反應(yīng)，然后離心純化，最后得到負(fù)載有Au納米粒子的石墨烯復(fù)合物，最終其濃度調(diào)節(jié)為0.5mg/mL，再把濃度為1μmol/L與待測核酸反向互補的核酸序列(序列為5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’，SEQ ID NO.1)負(fù)載到所述納米粒子氧化石墨烯的復(fù)合結(jié)構(gòu)上，離心2次去除多余核酸分子，得到核酸檢測的復(fù)合物。

將制得的核酸檢測的復(fù)合物與濃度為25mmol/L的HEPPSO反應(yīng)，若所述復(fù)合物在340nm不出現(xiàn)吸收峰，則該復(fù)合物中的金納米粒子和核酸分子充分反應(yīng)，可用于核酸檢測。

實施例2：檢測核酸分子：

將待測核酸(序列為5’-AACTCTGCTCGACGGATT-3，SEQ ID NO.2)溶于緩沖溶液中，配成0.01mol/L的核酸儲備溶液，用緩沖溶液將所述待測核酸儲備液分別稀釋為1.0×10^-11，5.0×10^-11，1.0×10^-10，5.0×10^-10，1.0×10^-9，5.0×10^-9，1.0×10^-8，5.0×10^-8，1.0×10^-7，5.0×10^-7，1.0×10^-6，2.5×10^-6，1.0×10^-5，2.0×10^-5，3.0×10^-5和1.0×10^-4mol/L。取17份實施例1制備的核酸復(fù)合物，編號為1-17，每份180μL，向第2-17份核酸復(fù)合物中分別加入20μL上述各個濃度的核酸儲備溶液，第1份核酸復(fù)合物中添加20μL緩沖溶液，混勻放置1小時后，將各溶液在6000rmp下離心15分鐘，取上清液，測定各上清液的吸收光譜，結(jié)果參見圖1。圖1為本發(fā)明實施例提供的試劑混合液中加入核酸以后催化產(chǎn)物的紫外可見吸收光譜圖。

參見圖1，圖1中的曲線由下到上分別為空白的上清液、含1.0×10^-12mol/L、5.0×10^-12mol/L、1.0×10^-11mol/L、5.0×10^-11mol/L、1.0×10^-10mol/L、5.0×10^-10mol/L、1.0×10^-9mol/L、5.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、5.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L、2.5×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、2.0×10^-6mol/L、3.0×10^-6mol/L和1.0×10^-5mol/L待測核酸的核酸復(fù)合物的上清液的紫外可見吸收光譜圖。由圖1可知，吸收強度隨著分析物濃度的增加而增強。當(dāng)核酸濃度達(dá)到5.0×10^-12mol/L時，催化產(chǎn)物吸收光譜在340nm開始出現(xiàn)；隨著核酸濃度的增加，催化產(chǎn)物吸收光譜的增加程度更加明顯；當(dāng)濃度達(dá)到1.0×10^-5mol/L時，吸收光譜最強。因此，本發(fā)明提供的核酸復(fù)合物檢測核酸的靈敏度可達(dá)5.0×10^-12mol/L，靈敏度較高。

參見圖2可知，從1.0×10^-11mol/L-2.5×10^-7mol/L可以很好的線性擬合，因此本發(fā)明提供的核酸復(fù)合物檢出核酸的濃度線性范圍為1.0×10^-11mol/L-2.5×10^-7mol/L。

綜上所述，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測特定核酸序列的費時費力的技術(shù)問題。本發(fā)明提供的檢測方法無需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，操作簡單、識別靈敏度高。同時，本發(fā)明提供的核酸檢測復(fù)合物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫條件下可長時間保存，應(yīng)用方便，可用于醫(yī)院臨床疾病和健康狀況診斷。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機械與物理研究所

<120> 一種核酸檢測的復(fù)合物及其制備方法與核酸檢測的方法

<130> MP1621579

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<170> PatentIn version 3.3

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