專利名稱：一種用于小麥條銹病抗病新基因Yr50輔助選擇的分子標記及其用法的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物分子遺傳學和小麥種質創新技術領域，涉及抗小麥條銹病新基因的分子標記開發及其定位方法，具體涉及一種用于小麥條銹病抗病新基因輔助選擇的分子標記及其用法。
背景技術：
由條銹菌(A striiformis f. sp. iriiici)引起的小麥條銹病是一種世界性的小麥重要病害，而我國又是該病的流行區，其發病面積和成災頻率均居小麥病害之首。自20世紀50年代至今，我國曾發生15次中度流行和4次大流行。最近I次的大面積流行發生于2002年，由于條中31號(CYR31)和條中32號(CYR32)等新毒性小種的出現和流行，導致除Yr5、YrlO、Yrl5、Yr24和Yr26外的大多數抗條銹基因喪失抗性。其發病面積在I億畝以上，造成小麥減產131萬噸(萬安民，等.2002年我國小麥條銹病發生回顧植物保護.2003,29:5-8)。最近幾年，我國條銹病每年發生面積均在6000萬畝左右(何中虎，等.小麥條銹病和白粉病成株抗性研究進展與展望.中國農業科學，2011,44(11) :2193-2215),嚴重威脅著我國小麥安全生產。對于小麥條銹病的防治，抗性基因的利用是最為經濟、安全、有效的途徑。自1962年在小麥中發現第一個抗條銹基因(7r7)以來，已在43個位點(7r7-7r妨)上正式定名了51個抗條銹基因和20多個暫命名基因，它們分布于除1A、4A、4B和7A的其他17個小麥染色體上(McIntosh 等· Catalogue of Gene Symbols for Wheat, 2008-2011)。然而，寄主抗性與病原菌毒性小種的共進化，導致小種專化性基因在生產利用不久便喪失抗性。在我國，因小麥-黑麥1RS/1BL易位系(含Yr9)和“繁6”衍生系等主要抗源的大面積使用導致新致病小種CYR31和CYR32的出現而爆發了 1996、2002年的條銹病大流行就是明證。因此，抗病新基因的發掘與利用對有效防控小麥條銹病的流行和為害至關重要。抗源多樣化是解決抗性喪失的重要途徑。但目前僅有的幾個對我國強優勢生理小種條中31、32號表現高抗的抗性基因中，7r5、7r70來自斯卑爾脫小麥(7 spelta album),Yr15源于野生二粒小麥(71. dicoccoides), Yr26源于圓錐小麥。研究還發現,Yr5位于2BL上(Sun 等.Plant Breeding, 2002, 121: 539-541 )，7r70、和 Zr激位于小麥的IBS 上(Wang 等· Euphytica, 2002, 124:71-73; Sun 等· Theoretical and AppliedGenetics, 1997，95: 622-628; Ma 等· Euphytica, 2001, 120: 219-226)。顯然，僅靠這幾個有限的抗病基因難以實現小麥條銹病抗源多樣化。中減懷復—穹■ iThinopyrumintermedium，2n=&=A2，JJsS)是小麥的一個多年生野生近緣植物，由于其蘊含著許多對改善小麥品質、增強小麥抗性的有益基因，已成為小麥遺傳改良的重要基因資源之一。最近有研究發現中間偃麥草的IS染色體上含有免疫條中31、32號小種的新基因(Hu等· Euphytica, 2011, 177:169-177)，但未見有關將偃麥草抗條銹基因整合到小麥基因組中并對其進行標記定位的研究報道。
抗病基因的分子標記及連鎖圖譜建立是對目標基因進行精細遺傳定位及圖位克隆抗病基因的基礎，同時更是分子標記輔助育種的有力工具，近年來，分子標記已廣泛應用于小麥目標性狀標記定位和性狀間連鎖關系的確定。但由于小麥的遺傳基礎相對狹窄，在常用的分子標記體系中，RFLP操作復雜、多態性較低，因而在一定程度上限制了小麥RFLP標記的篩選和應用。而微衛星(Microsatellite)或簡單序列重復(SSR)以其數量豐富、多態性高、共顯性遺傳、操作簡單、結果穩定可靠等優點而用于種質鑒定、目標基因的分子標記及定位。迄今，14個正式命名的抗條銹基因已獲得連鎖的SSR標記,包括免疫或高抗條中32 號小種的 7r5\7r70、7r75·、和 7r激(Sun 等.Plant Breeding, 2002,121 :539-541 ；ffang等· Euphytica, 2002，124 :71-73 ;Sun等· Theoretical and Applied Genetics, 1997，95 :622-628 ;Ma等· Euphytica，2001，120 :219_226)。而且，有些緊密連鎖的SSR標記已用于抗病基因的標記輔助選擇(Murphy等· Crop Science, 2009,49 :1786-1790)及其圖位克隆(Fu等.Science，2009，323 :1357-1360)。因此，利用SSR分子標記定位和開發與連 鎖的分子標記對于克隆和利用抗條銹基因Yr50具有重要意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于小麥抗條銹病基因Yr50連鎖的分子標記及其用法。本發明是通過以下技術方案實現的
本發明提供的輔助篩選用于小麥條銹病抗病基因兩個引物對，具有如下所示的核苷酸序列
標記 Xbarc1096:
上游5’ -GCGTTCGCATATACGTCGTATACAT-3’，
下游5’-GGTGGTGAAGAGGCATGCCCAACAAA-3’ ；
標記 Xmnc310:
上游5’ -TGTGAGGCTGGGAGGAAAAGAG-3’，
下游5’ -GCTAGGTTGTGTCCCACAATGC-3’。所述標記油與小麥條銹病抗性基因Yr50的遺傳距離為6. 9 cM，標記Xwmc310與Yr50的遺傳距離為7. 2 cM。所述的輔助篩選的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對barcl096進行PCR擴增，檢測擴增產物，擴增產物中有132bp條帶的待測小麥為候選的抗條銹病小麥；用所述引物對wmc310進行PCR擴增，檢測擴增產物，擴增產物中有188bp條帶的待測小麥為候選的抗條銹病小麥。所述的分子標記用于SSR標記篩選時的反應程序為
(1)PCR 反應體系為 20 μ L，含 IOX buffer2 μ LUO mM Tris -HCl, pH 8. 3,50 mMKC1、1.5 mM MgCl2,2 mM dNTP、0. 25 μ M 分子標記引物、IU TaqDNA 聚合酶、100 ng 基因組DNA，去離子水補足至20 μ L ；
(2)擴增程序為94°C預變性 5min;94 °C變性在 51 HXbarcl096 電52 °C 復性 45s，72 °C 延伸 lmin，35 個循環；72 °C 延伸 10min，4 °C保存；
(3)電泳為8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將4μ L PCR產物和4 μ L上樣緩沖液混合點樣，150V電泳2h，硝酸銀染色拍照。
其中所述的8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，Acr:Bis=29:1,所述的上樣緩沖液含O. 4g/ml鹿糖，I mg/ml溴酹藍和I mg/ml 二甲苯青。抗條銹病基因及其連鎖標記的物理定位，用中國春小麥第4部分同源群的缺體-四體系和端體系對與抗病基因連鎖的SSR標記進行染色體和染色體臂的物理定位，通過比較中國春與其端體系的擴增帶型，將每個連鎖標記定位到染色體臂上。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
1、在國際上首次發現源于偃麥草的抗小麥條銹病新基因并獲與其連鎖的分子標記本發明利用846對SSR引物中5個與抗條銹病新基因連鎖的分子標記，其中，標記Xbarc1096與Yr50的遺傳距離為6. 9 cM,標記與Yr50的遺傳距離為7. 2 cM,上述兩個標記均與Yr50緊密連鎖，皆可用于該基因的分子標記輔助育種；
2、利用本發明的條銹病分子標記輔助育種選擇目標明確，可節約成本傳統的白粉病抗病育種首先要利用優異白粉病抗源為親本進行雜交，然后對后代群體進行白粉病抗病性接種鑒定，該方法易受環境氣候影響，選擇準確性較低，因此傳統抗病育種不但費時、費工，而且效率低、成本高。利用本發明的分子標記與條銹病抗性新基因緊密連鎖的特點，在苗期就可快速、高通量地鑒定出含有條銹病抗性新基因Yr50的分離群體和高代品系，在降低了成本的同時還可大幅度地提高選擇效率，此外本發明的兩個標記均為SSR標記，較之其他類型標記使用更為簡便、快速；
3、利用經典遺傳學、中國春缺體一四體定位和分子標記方法，將Yr50定位在小麥4B染色體的長臂(4BL)上，這是迄今國內外首次定位在小麥4B染色體上的唯一的抗小麥條銹病新基因，本發明不僅為小麥抗條銹病育種提供了新抗源，而且進一步圖位克隆該基因奠定了材料和技術基礎；
4、獲得與目的基因緊密連鎖的分子標記是成功進行植物分子育種和基因圖位克隆的關鍵，但由于野生植物與其栽培物種的部分同源染色體缺乏高頻率的配對和重組，使得外源目標基因的標記定位及其圖位克隆極為困難(Cao等· Proc Natl Acad Sci USA, 2011,108(19) : 7727-7732)，本發明進行基因標記所用材料為自育的小麥-異源抗病滲入系(聞金龍等.植物保護學報，2010，37 (5): 419-424)。由于它不含大的外源染色體片段，且能與小麥染色體正常配對，因而避免了前人因易位染色體片段過長而造成雙親間染色體的配對和重組受到抑制，從而實現了外源抗病基因的分子標記與定位。


圖I 為 5 個共顯性 SSR 標記 Ββγ(1096、《τ]Κ3310、《τ]Κ347、gpw7272 及 gwm540 對臺長29XCH223 F2代部分單株的擴增結果；
圖中ΚΗ223、Α ..臺長HBr .-DNA抗池、.-DNA感池、/ ..抗病純合體、..抗病雜合體、義感病純合體、辟、S*和Se* 重組體基因型；
圖2為在4BL染色體上Yr50的圖譜位置；
圖3為5個SSR標記在中國春第4部分同源群缺體-四體材料和端體材料Dt4BS的擴
增結果；
圖4為Xbarc1096和Xmnc310在SY95-71 X CH223 F2代部分單株的擴增結果；圖中-.Pr :01223、&:5￥95-71、7 :抗病純合體、1 :感病純合體。
具體實施例方式中間偃麥草中蘊含許多改良小麥品質、增強小麥抗性的有益基因，如目前正式命名的抗白粉病基因中，/ 必(Luo等· Theoretical and Applied Genetics,2009, 118:1059-1064)和作幻(He 等· Theoretical and Applied Genetics, 2009,118:1173-1180)均來自中間偃麥草。通過利用目前流行的條銹病小種條中29、31、32和33接種鑒定發現，中間偃麥草、八倍體小偃麥-TAI7047及從“晉麥33/TAI7047 Il 2*京411" BC2F6后代材料中選育出的CH223品系對四個小種都表現為免疫(表2)，說明中間偃麥草中蘊含優良的抗條銹病基因。為更好的利用中間偃麥草中的抗條銹病基因改良小麥，我們對CH223中的抗條銹病基因進行定位和分子標記的開發，以實現分子標記輔助選擇育種(Marker-assisted selection, MAS)。
一、苗期抗性鑒定及抗條銹性基因來源
為分析CH223抗條銹性基因的來源，于2007-2008年在山西省農業科學院作物科學研究所溫室和成都電子科技大學邛崍病圃對小偃麥抗病滲入系及其雜交親本TAI7047、京411、晉麥33及TAI7047的親本中間偃麥草、太原768和晉春5號進行苗期抗性鑒定，銘賢169為感病對照。幼苗期分小種接種，待第1-2片葉充分展開后，用掃抹法接種預先繁殖好的新鮮菌種。條銹菌接種后的幼苗置于保濕桶中10°C結露保濕24h。溫室溫度控制在18/120C (白天/晚上)、光照12 14h/d，光強大于ΙΟΟΟΟΙχ。接種后16 18d，當感病對照品種“銘賢169”充分發病時，按0、0;、1、2、3、4的分級標準調查、記載其條銹病的侵染型，其中0-2的侵染型為抗病，3-4的侵染型為感病(劉孝坤.植物保護學報，1988，15 (I):33-39 )?？剐栽u價標準見表I。表I本發明所用抗條銹病評價標準
權利要求
1.種用于小麥條銹病抗病新基因Yr50輔助選擇的分子標記，其特征在于擴增該分子標記的引物具有如下所示的核苷酸序列標記 Xbarc1096:上游5’ -GCGTTCGCATATACGTCGTATACAT-3’， 下游5’ -GGTGGTGAAGAGGCATGCCCAACAAA-3， 或標記Xwmc310:上游5’ -TGTGAGGCTGGGAGGAAAAGAG-3’，下游5’ -GCTAGGTTGTGTCCCACAATGC-3’。
2.根據權利要求I所述的用于小麥條銹病抗病新基因Yr50輔助選擇的分子標記，其特征在于所述標記油與小麥條銹病抗性基因Yr50的遺傳距離為6. 9 cM,標記Xwmc310與Yr50的遺傳距離為7. 2 cM。
3.—種權利要求I所述的用于小麥條銹病抗病基因輔助選擇的分子標記的用法，其特征在于將所述的分子標記用于SSR標記篩選時的反應程序為 (1)PCR 反應體系為20 yL，含 IOX buffer2 μ L、2 mM dNTP、0. 25 μΜ 分子標記引物、IU TaqDNA聚合酶、100 ng基因組DNA，去離子水補足至20 yL，其中IOX buffer2 μ L為 10 mM Tris-HCl, pH 8. 3，50 mM KCl, I. 5 mM MgCl2 ； (2)擴增程序為94°C預變性 5min ；94 °C變性 45s，Xwmc310 在 51 Xbarc 1096在52 °C復性45s，72 °C延伸lmin，35個循環；72 °C延伸10min，4 °C保存； (3)電泳為8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將4μ L PCR產物和4 μ L上樣緩沖液混合點樣，150V電泳2h，硝酸銀染色拍照。
全文摘要
本發明公開了一種用于小麥條銹病抗病新基因Yr50輔助選擇的分子標記及其用法，屬于植物分子遺傳學和小麥種質創新技術領域，涉及抗小麥條銹病新基因的分子標記開發及其定位方法。用于小麥條銹病抗病新基因Yr50輔助選擇的分子標記為標記Xbarc1096、標記Xwmc310，標記Xbarc1096與小麥條銹病抗性基因Yr50的遺傳距離為6.9cM，標記Xwmc310與Yr50的遺傳距離為7.2cM。本發明在國際上首次發現源于偃麥草的抗小麥條銹病新基因Yr50，并獲與其連鎖的分子標記，利用本發明的條銹病分子標記輔助育種選擇目標明確，可節約成本，不僅為小麥抗條銹病育種提供了新抗源，而且進一步圖位克隆該基因奠定了材料和技術基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102618638SQ201210065009
公開日2012年8月1日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者張叢卓, 張曉軍, 李欣, 楊足君, 暢志堅, 詹海仙, 賈舉慶 申請人:山西省農業科學院作物科學研究所