專利名稱：短喙芥脂肪酸延長酶及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和基因工程領域，更具體地，涉及短喙芥 (Brassicaelongata Ehrhart)脂肪酸延長酶(FAE I)及其編碼基因。
背景技術：
芥酸(erucic acid，C22:1)是一種超長鏈不飽和脂肪酸，主要存在于十字花科 (Brassicaceae)和金蓮花科(Tropaeolaceae)植物種子中。作為植物的代謝產物，芥酸還在一定程度上影響植物的生長發育，在植物與環境的相互作用中，參與了生物膜角質或蠟質的合成。從營養價值來說，芥酸是食用油的抗營養成分，不易被人體消化吸收，容易導致冠心病和脂肪肝等病害發生。然而，在工業上，芥酸及其衍生物芥酸酰胺等具有較好的增塑性和疏水性，因此，具有廣泛的用途，是生產潤滑劑、防腐劑、化纖原料和化妝品等化工產品的重要原料。
FAEl (Fatty Acid Elongase I)基因是調控芥酸合成的關鍵基因，雖然自James等最先從擬南芥中克隆到FAEl基因以來，陸續有完整的FAEl基因從各種十字花科植物中被分離出來，但目前對于FAEl基因的克隆僅局限于擬南芥及蕓苔屬少數幾種植物中，而十字花科是芥酸分布的主要種質資源，植物種類多，芥酸含量復雜，是FAEl克隆的合適材料。
本發明通過BeFAEl基因的真核表達，獲得活性蛋白，同時脂肪酸含量檢測分析發現該基因所編碼的蛋白對芥酸合成有催化活性。發明內容
本發明的目的在于提供一種來自于芥酸含量較高的短喙芥中的脂肪酸延長酶 (Fatty Acid Elongase I, FAE1)及其編碼基因。
本發明的短喙芥的FAEl基因由1251個堿基組成，含有一個完整的開放閱讀框，為序列表中的I號序列，將此基因命名為BeFAEl。
本發明的短喙芥FAEl蛋白由506個氨基酸組成，開放閱讀框的起始密碼子為ATG， 終止密碼子為TAA。BeFAEl蛋白的理論分子量為56. 50kDa，等電點為9. 36。
含有上述序列I及其開放閱讀框架的多核苷酸的載體，以及用上述序列I及其開放閱讀框架的多核苷酸轉化的生物細胞，均是本發明需要保護的內容。
本發明基因的發現，使通過轉基因來調控芥酸合成成為可能，對于培育高芥酸的轉基因十字花科作物具有重要意義。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。


圖I為短喙芥基因組DNA
圖2為BeFAEl基因全長PCR擴增產物
圖3為真核表達載體pYES-BeFAEl的構建流程圖
圖4為載體pYES-BeFAEl的酶切圖譜
圖5為酵母中BeFAEl表達產物的Western Blot分析具體實施方式
實施例I、基因BeFAEl的克隆
克隆BeFAEl，具體步驟如下
一、BeFAEl基因的獲得
短喙芥在正常條件下栽培，待真葉長出，采集葉片，從葉片中提取DNA，進行聚合酶鏈式反應，最終獲得BeFAEl基因。
I、短喙芥基因組DNA的提取
取新鮮幼嫩的活體植物葉片約O. 2g，在液氮冷凍條件下充分研磨，轉入I. 5mL的離心管中，加入500 μ L CTAB提取液，65°C水浴45min，期間顛倒混勻3次；加入500 μ L體積比為24 I的氯仿-異戊醇，混合均勻，12000r · HiirT1離心15min ;取上清，加2倍體積無水乙醇，_20°C冰箱中過夜；4000r · mirT1離心15min使DNA沉淀；700 μ L 70%乙醇清洗 2 次，4000r · mirT1 離心 IOmin,再用 700 μ L 無水乙醇清洗 I 次，4000r · mirT1 離心 IOmin, 得DNA沉淀晾干；最后加100 μ L去離子水使沉淀溶解。電泳檢測結果如圖I所示。
2、聚合酶鏈式反應PCR
以上述得到的短喙芥基因組DNA為模版，以分別帶有KpnI與BamHI酶切位點的T FK (5 ' CGGGGTACCGCAATGACGTCCGTTAAC 3 ')與 TRB(5' CGCGGATCCGGACCGACCGTTTTGGAC)為引物，按以下反應擴增出BeFAEl基因。反應體系如下
DNA 模版1·0μ1(2.0μβ) IO X PCR Buffer (含 Mg2+) 2.0 μ dNTP
引物 TFGpmol·!/1) 引物 TRPpmolvL;1)0.3 μ (10 mM each)2.0μ 2.0μ ExTaq DNA polymerase 0.2 μ (5 U/μΙ)ddH2012.5 μ
按以下程序進行擴增反應 先94°C預變性3min ;然后94°C變性30sec，53°C退火 30sec，72°C延伸lmin，35個循環；最后72°C延伸5min。電泳檢測PCR產物，如圖2所示，有一大小約1500bp大小的條帶,與理論值相符。
回收1500bp的條帶，將該DNA片段連接到pMD18_T載體上，生成pMD_BeFAEl重組載體，轉化大腸桿菌DH5，經測序后在GenBank中進行Blastn比較，結果表明，該DNA與多種植物FAEl基因有較高的同源性，因此推測所擴增的DNA為一個FAEl基因。測序后進行BLAST檢索，結果表明已分離得短喙芥FAEl基因序列。
二、BeFAEl基因的同源性分析及二級結構分析
為將短_芥的FAEl基因的蛋白序列與其他聞等植物的FAEl基因編碼的蛋白進行同源性分析，從NCBI網站上檢索到擬南芥(Arabidopsis thaliana),芥菜(Brassica juncea),歐洲油菜(Brassica napus),花椰菜(Brassica oleracea),完青(Brassica rapa), Camelina hispida, Cardamine graeca,海甘藍(Crambeabyssinica),蔣藍(Isatis tinctoria),綠獨行菜(Lepidium campestre),銀扇草(Lunaria annua),白芥(Sinapis alba),中歐芥(Teesdalia nudicaulis)等植物同源基因的蛋白序列。通過Megalign軟件分析結果表明短喙芥FAEl蛋白的氨基酸序列與白芥中FAEl蛋白的同源性達96. 6%，與其它幾種植物的同源性在80% -90%左右，與Cardamine graeca的FAEl蛋白同源性最低， 僅為81. 1%。
Pfam結果顯示BeFAEl基因所編碼蛋白具有典型的FAEl蛋白特有的FAE1_CUT1_ RppA 與 ACP_syn_III_C 結構域。
實施例2、BeFAEl基因的功能驗證
一、BeFAE I基因在酵母中的高效表達
為了表明BeFAEl基因的編碼功能，本發明將BeFAEl基因克隆到Invitrogen公司的pYES2/NT C的BamHI和KpnI位點之間，并轉化酵母菌株InvScl，獲得了高效表達。
本發明是利用Invitrogen公司的pYES2/NT C高效表達載體的多克隆位點來實現 BeFAEl的高效表達的。本實驗采用的酶切位點使pYES2/NT C表達載體表達出的產物5’端附加6個連續His的融合蛋白，這6個連續的His構成了 i-NTA凝膠特異結合的位點，因此可利用親和層析來純化表達產物。
將攜帶BeFAEl基因的pMD_BeFAEl重組載體與pYES2/NT C表達載體用相同的酶 (BamHI和KpnI)酶切后，再連接，將連接產物轉化酵母InvScl菌株，并用添加了 2% (w/v) 葡萄糖但不含脲嘧啶的培養基上(SC-ura)培養并選擇。載體的構建流程見圖3。經質粒酶切鑒定(如圖4所示)，1，2為質粒pYES-BeFAEl用BamHI和KpnI酶切后，再經過PCR鑒定后，將篩出的連接正確的重組子進行測序，證明插入載體的DNA序列的閱讀框架是正確的。 把構建成帶有BeFAEl基因的表達載體，命名為pYES-BeFAEl，用于誘導表達分析。
將篩選并經鑒定確認的重組子，接種到添加了 2% (w/v)葡萄糖的SC-ura液體培養基中，在28°C下振蕩培養過夜。用添加了 2% (w/v)半乳糖的SC-ura液體培養基將過夜培養物稀釋到0D600值為O. 02，并繼續振蕩培養到0D600值為I. 4。收集菌體，按凱基公司提供的方法提取細胞總蛋白，然后用HisBind resin純化并進行10% SDS-PAGE電泳檢測， 結果如圖5所示，從圖中可以看出，BeFAEl基因在InvSc中得到了高效表達。
二、功能鑒定
為檢測BeFAEl基因的功能，本發明采用對轉化有pYES-BeFAEl質粒的酵母細胞的芥酸含量進行測定，BeFAEl基因促進了芥酸合成，芥酸在酵母細胞中得到累積。
本發明所采用的酵母菌株InvSc的脂肪酸延長酶活性很低，只合成微量的超長鏈脂肪酸，因此是研究FAEl編碼蛋白活性的常用體系。將步驟一中篩選并經鑒定確認的重組子，接種到添加了 2% (w/v)葡萄糖的SC-ura液體培養基中，在28°C下振蕩培養過夜。用添加了 2% (w/v)半乳糖的SC-ura液體培養基將過夜培養物稀釋到0D600值為O. 02，并繼續振蕩培養到0D600值為I. 4。收集菌體，用超純水洗滌。酵母細胞在80°C氫氧化鉀-甲醇溶液(10% (w/v)Κ0Η, 5% (v/v)H20 in methanol)中皂化2h。皂化后，樣品置于冰上冷凍，然后用正己烷洗滌，以去除未皂化物。剩余的水相用6mol/L HCl酸化。自由脂肪酸被萃取在正己烷中，抽真空去除溶劑。自由脂肪酸在2ml含1% H2S04的甲醇溶液中60°C甲基化Ih。 酵母脂肪酸甲酯(FAMEs)被萃取在正己烷中，抽真空去除溶劑，剩余物溶解在正己烷中用于氣相色譜分析。結果顯示，轉化有PYES-BeFAEl質粒的酵母中芥酸含量為I. 52±0. 13%, 作為對照的空質粒PYES2/NT C無芥酸累積。結果證實了 BeFAEl基因編碼蛋白的體外活性。
權利要求
1.一種脂肪酸延長酶多肽，該多肽選自 (a)具有序列2氨基酸序列的多肽； (b)將序列2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加形成的具有脂肪酸延長酶功能的多肽。
2.根據權利要求I所述脂肪酸延長酶的編碼基因，其特征在于所述脂肪酸延長酶的基因cDNA為下述核苷酸序列之一 (a)序列表中序列I的核苷酸序列； (b)與多核苷酸(a)互補的核苷酸序列； (c)編碼序列表中序列2蛋白氨基酸序列的核苷酸序列。
3.含有權利要求2任一所述的基因的重組表達載體。
4.含有權利要求2任一所述的基因的轉基因細胞系。
5.含有權利要求2任一所述的基因的工程菌。
6.權利要求I任一所述的蛋白在培育脂肪酸改良植物中的應用。
7.權利要求2任一所述的基因在培育脂肪酸改良植物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種來源于短喙芥的脂肪酸延長酶及其編碼基因BeFAE1。將該基因導入酵母，重組酵母芥酸含量達1.52土0.13％。本發明的蛋白及其編碼基因對于植物芥酸遺傳調控機制的研究以及提高植物的芥酸含量和相關性狀的改良具有重要的理論和實際意義，將在植物的芥酸基因基因工程改良中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N5/10GK102978174SQ20121041294
公開日2013年3月20日 申請日期2012年10月24日 優先權日2012年10月24日
發明者孫小芹, 杭悅宇, 李瑩, 李密密, 龐慧, 郭建林, 嚴琴琴 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所