專利名稱：野蘿卜脂肪酸延長酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，更具體地，涉及野蘿卜 (Raphanusraphanistrum L.)脂肪酸延長酶(FAEl)及其編碼基因。
背景技術(shù)：
芥酸(erucic acid，C22:1)是一種超長鏈不飽和脂肪酸，主要存在于十字花科 (Brassicaceae)和金蓮花科(Tropaeolaceae)植物種子中。作為植物的代謝產(chǎn)物，芥酸還在一定程度上影響植物的生長發(fā)育，在植物與環(huán)境的相互作用中，參與了生物膜角質(zhì)或蠟質(zhì)的合成。從營養(yǎng)價值來說，芥酸是食用油的抗?fàn)I養(yǎng)成分，不易被人體消化吸收，容易導(dǎo)致冠心病和脂肪肝等病害發(fā)生。然而，在工業(yè)上，芥酸及其衍生物芥酸酰胺等具有較好的增塑性和疏水性，因此，具有廣泛的用途，是生產(chǎn)潤滑劑、防腐劑、化纖原料和化妝品等化工產(chǎn)品的重要原料。
FAEl (Fatty Acid Elongase I)基因是調(diào)控芥酸合成的關(guān)鍵基因，雖然自James等最先從擬南芥中克隆到FAEl基因以來，陸續(xù)有完整的FAEl基因從各種十字花科植物中被分離出來，但目前對于FAEl基因的克隆僅局限于擬南芥及蕓苔屬少數(shù)幾種植物中，而十字花科是芥酸分布的主要種質(zhì)資源，植物種類多，芥酸含量復(fù)雜，是FAEl基因克隆的合適材料。
本發(fā)明通過RrFAEl基因的真核表達，獲得活性蛋白，同時脂肪酸含量檢測分析發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白對芥酸合成有催化活性。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來自于芥酸含量較高的野蘿卜中的脂肪酸延長酶 (Fatty Acid Elongase I, FAE1)及其編碼基因。
本發(fā)明的野蘿卜的FAEl基因由1251個堿基組成，含有一個完整的開放閱讀框，為序列表中的I號序列，將此基因命名為RrFAEl。
本發(fā)明的野蘿卜FAEl蛋白由506個氨基酸組成，開放閱讀框的起始密碼子為ATG， 終止密碼子為TAA。RrFAEl蛋白的理論分子量為56. 24kDa，等電點為9. 42。
含有上述序列I及其開放閱讀框架的多核苷酸的載體，以及用上述序列I及其開放閱讀框架的多核苷酸轉(zhuǎn)化的生物細胞，均是本發(fā)明需要保護的內(nèi)容。
本發(fā)明基因的發(fā)現(xiàn)，使通過轉(zhuǎn)基因來調(diào)控芥酸合成成為可能，對于培育高芥酸的轉(zhuǎn)基因十字花科作物具有重要意義。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖I為野蘿卜基因組DNA
圖2為RrFAEl基因全長PCR擴增產(chǎn)物
圖3為真核表達載體PYES-RrFAEl的構(gòu)建流程圖
圖4為載體pYES-RrFAEl的酶切圖譜
圖5為酵母中RrFAEl表達產(chǎn)物的Western Blot分析具體實施方式
實施例I、基因RrFAE I的克隆
克隆RrFAEl，具體步驟如下
一、RrFAEl基因的獲得
野蘿卜在正常條件下栽培，待真葉長出，采集葉片，從葉片中提取DNA，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終獲得RrFAEl基因。
I、野蘿卜基因組DNA的提取
取新鮮幼嫩的活體植物葉片約O. 2g，在液氮冷凍條件下充分研磨，轉(zhuǎn)入I. 5mL的離心管中，加入500 μ L CTAB提取液，65°C水浴45min，期間顛倒混勻3次；加入500 μ L體積比為24 I的氯仿-異戊醇，混合均勻，12000r · HiirT1離心15min ;取上清，加2倍體積無水乙醇，_20°C冰箱中過夜；4000r · mirT1離心15min使DNA沉淀；700 μ L 70%乙醇清洗 2 次，4000r · mirT1 離心 IOmin,再用 700 μ L 無水乙醇清洗 I 次，4000r · mirT1 離心 IOmin, 得DNA沉淀晾干；最后加100 μ L去離子水使沉淀溶解。電泳檢測結(jié)果如圖I所示。
2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR
以上述得到的野蘿卜基因組DNA為模版，以分別帶有KpnI與BamHI酶切位點的T FK (5 ' CGGGGTACCGCAATGACGTCCGTTAAC 3 ')與 TRB(5' CGCGGATCCGGACCGACCGTTTTGGAC)為引物，按以下反應(yīng)擴增出RrFAEl基因。反應(yīng)體系如下
DNA 模版1.0μ1(2·0μ§)IO X PCR Buffer (含 Mg2+) 2.0 μ dNTP0.3 μ (10 mM each)
引物 TFGpmoH1)引物 TR^pmoH1) ExTaq DNA polymerase2.0 μ 2.0 μ 0.2 μ (5 U/μΙ)ddH2012.5 μ
按以下程序進行擴增反應(yīng) 先94°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性30sec，53°C退火 30sec，72°C延伸lmin，35個循環(huán)；最后72°C延伸5min。電泳檢測PCR產(chǎn)物，如圖2所示，有一大小約1500bp大小的條帶,與理論值相符。
回收1500bp的條帶，將該DNA片段連接到pMD18_T載體上，生成pMD-RrFAEl重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，經(jīng)測序后在GenBank中進行Blastn比較，結(jié)果表明，該DNA與多種植物FAEl基因有較高的同源性，因此推測所擴增的DNA為一個FAEl基因。測序后進行 BLAST檢索，結(jié)果表明已分離得野蘿卜FAEl基因序列。
二、RrFAEl基因的同源性分析及二級結(jié)構(gòu)分析
為將野蘿卜的FAEl基因的蛋白序列與其他高等植物的FAEl基因編碼的蛋白進行同源性分析，從NCBI網(wǎng)站上檢索到擬南芥(Arabidopsis thaliana),芥菜(Brassica juncea),歐洲油菜(Brassica napus),花椰菜(Brassica oleracea),完青(Brassica rapa), Camelina hispida, Cardamine graeca,海甘藍(Crambeabyssinica),蔣藍(Isatis tinctoria),綠獨行菜(Lepidium campestre),銀扇草(Lunaria annua),白芥(Sinapis alba),中歐芥(Teesdalia nudicaulis)等植物同源基因的蛋白序列。通過Megalign軟件分析結(jié)果表明野蘿卜FAEl蛋白的氨基酸序列與歐洲油菜及白芥中FAEl蛋白的同源性達 96. 4%,與其它幾種植物的同源性在80% -90%左右，與Cardamine graeca的FAEl蛋白同源性最低，僅為80.9%。
Pfam結(jié)果顯示RrFAEl基因所編碼蛋白具有典型的FAEl蛋白特有的FAE1_CUT1_ RppA 與 ACP_syn_III_C 結(jié)構(gòu)域。
實施例2、RrFAEl基因的功能驗證
一、RrFAE I基因在酵母中的高效表達
為了表明RrFAEl基因的編碼功能，本發(fā)明將RrFAEl基因克隆到Invitrogen公司的pYES2/NT C的BamHI和KpnI位點之間，并轉(zhuǎn)化酵母菌株InvScl，獲得了高效表達。
本發(fā)明是利用Invitrogen公司的pYES2/NT C高效表達載體的多克隆位點來實現(xiàn) RrFAEl的高效表達的。本實驗采用的酶切位點使pYES2/NT C表達載體表達出的產(chǎn)物5’端附加6個連續(xù)His的融合蛋白，這6個連續(xù)的His構(gòu)成了 i-NTA凝膠特異結(jié)合的位點，因此可利用親和層析來純化表達產(chǎn)物。
將攜帶RrFAEl基因的pMD-RrFAEl重組載體與pYES2/NT C表達載體用相同的酶 (BamHI和KpnI)酶切后，再連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化酵母InvScl菌株，并用添加了 2% (w/v) 葡萄糖但不含脲嘧啶的培養(yǎng)基上(SC-ura)培養(yǎng)并選擇。載體的構(gòu)建流程見圖3。經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定(如圖4所示)，1，2為質(zhì)粒pYES-RrFAEl用BamHI和KpnI酶切后，再經(jīng)過PCR鑒定后，將篩出的連接正確的重組子進行測序，證明插入載體的DNA序列的閱讀框架是正確的。 把構(gòu)建成帶有RrFAEl基因的表達載體，命名為pYES-RrFAEl，用于誘導(dǎo)表達分析。
將篩選并經(jīng)鑒定確認的重組子，接種到添加了 2% (w/v)葡萄糖的SC-ura液體培養(yǎng)基中，在28°C下振蕩培養(yǎng)過夜。用添加了 2% (w/v)半乳糖的SC-ura液體培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)物稀釋到0D600值為O. 02，并繼續(xù)振蕩培養(yǎng)到0D600值為I. 4。收集菌體，按凱基公司提供的方法提取細胞總蛋白，然后用HisBind resin純化并進行10% SDS-PAGE電泳檢測， 結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，RrFAEl基因在InvSc中得到了高效表達。
二、功能鑒定
為檢測RrFAEl基因的功能，本發(fā)明采用對轉(zhuǎn)化有pYES-RrFAEl質(zhì)粒的酵母細胞的芥酸含量進行測定，RrFAEl基因促進了芥酸合成，芥酸在酵母細胞中得到累積。
本發(fā)明所采用的酵母菌株InvSc的脂肪酸延長酶活性很低，只合成微量的超長鏈脂肪酸，因此是研究FAEl編碼蛋白活性的常用體系。將步驟一中篩選并經(jīng)鑒定確認的重組子，接種到添加了 2% (w/v)葡萄糖的SC-ura液體培養(yǎng)基中，在28°C下振蕩培養(yǎng)過夜。用添加了 2% (w/v)半乳糖的SC-ura液體培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)物稀釋到0D600值為O. 02，并繼續(xù)振蕩培養(yǎng)到(》600值為1.4。收集菌體，用超純水洗滌。酵母細胞在80°C氫氧化鉀-甲醇溶液(10% (w/v)Κ0Η, 5% (v/v)H20 in methanol)中皂化2h。皂化后，樣品置于冰上冷凍，然后用正己烷洗滌，以去除未皂化物。剩余的水相用6mol/L HCl酸化。自由脂肪酸被萃取在正己烷中，抽真空去除溶劑。自由脂肪酸在2ml含1% H2S04的甲醇溶液中60°C甲基化Ih。 酵母脂肪酸甲酯(FAMEs)被萃取在正己烷中，抽真空去除溶劑，剩余物溶解在正己烷中用于氣相色譜分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化有PYES-RrFAEl質(zhì)粒的酵母中芥酸含量為O. 75±0. 17%, 作為對照的空質(zhì)粒PYES2/NT C無芥酸累積。結(jié)果證實了 RrFAEl基因編碼蛋白的體外活性。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酸延長酶多肽，該多肽選自 (a)具有序列2氨基酸序列的多肽； (b)將序列2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加形成的具有脂肪酸延長酶功能的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述脂肪酸延長酶的編碼基因，其特征在于所述脂肪酸延長酶的基因cDNA為下述核苷酸序列之一 (a)序列表中序列I的核苷酸序列； (b)與多核苷酸(a)互補的核苷酸序列； (c)編碼序列表中序列2蛋白氨基酸序列的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2任一所述的基因的重組表達載體。
4.含有權(quán)利要求2任一所述的基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
5.含有權(quán)利要求2任一所述的基因的工程菌。
6.權(quán)利要求I任一所述的蛋白在培育脂肪酸改良植物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2任一所述的基因在培育脂肪酸改良植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來源于野蘿卜的脂肪酸延長酶及其編碼基因RrFAE1。將該基因?qū)虢湍福亟M酵母芥酸含量達0.75±0.17％。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锝嫠徇z傳調(diào)控機制的研究以及提高植物的芥酸含量和相關(guān)性狀的改良具有重要的理論和實際意義，將在植物的芥酸基因基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N9/00GK102978175SQ201210413028
公開日2013年3月20日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者杭悅宇, 孫小芹, 龐慧, 李瑩, 李密密, 郭建林, 嚴琴琴 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所