專利名稱：釀酒酵母新菌株，及含有其的飼料添加劑，配合料的制作方法
釀酒酵母新菌株，及含有其的飼料添加劑，配合料技術領域
本發明屬于飼料領域，特別涉及一種釀酒酵母新菌株，及含有其的飼料添加劑，預混料。
背景技術：
益生菌(Probiotics)是指投入后通過改善宿主腸道菌群生態平衡而發揮有益作用，達到提高宿主(人和動物)健康水平和健康佳態的活菌制劑及其代謝產物。
酵母菌作為一類已被人熟知的益生菌廣泛用于食品、制藥、飼料領域。本發明所涉及的釀酒酵母菌(Saccharmyces cerevisiae)屬于酵母屬(Saccharomyces)，釀酒酵母廣泛用于制作面包、饅頭和釀酒。有些釀酒酵母如布拉氏酵母用于治療成人或兒童感染性或非特異性腹瀉。無論在體外或體內，該菌具有抗菌(包括白色念珠菌)作用。當在動物中誘發實驗性感染時，它可促進動物體內的免疫作用。它能合成維生素B，如維生素BI，維生素B2， 維生素B6，泛酸，煙酸。此外，還能顯著增加人與動物上皮細胞刷狀緣內的二糖酶。釀酒酵母屬于農業部公布允許使用的飼用微生物菌種之一。
腹瀉是幼齡動物生長發育期間常發的一種疾病，分為營養性腹瀉、細菌性腹瀉和病毒性腹瀉。使用抗生素治療后，易產生抗藥性和藥物殘留，且腹瀉后腸道粘膜受損，從而影響營養物質的消化吸收，因此造成畜禽生長速度放緩，進而加大養殖成本。
目前市場上的微生物飼料添加劑種類繁多，但存在菌種活力不夠，在飼料加工過程中活菌數降低，飼喂動物后無法起到益生作用等問題，功能性微生物飼料產品亟待開發。發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種釀酒酵母新菌株，及含有其的飼料添加劑，預混料。
首先，本發明提供一種釀酒酵母新菌株。本發明提供的新菌株分離自新鮮荔枝皮中，經鑒定為釀酒酵母(Saccharmyces cerevisiae),命名為Kl,并于2012年09年11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 6560。
其次，本發明還提供含有所述菌株的凍干菌粉。優選的，該菌粉活菌數不低于I.OxIO10CFU/ 克。
進一步地，本發明還提供含有所述凍干菌粉的飼料添加劑。
在本發明另一個實施方案中，所述的飼料添加劑還含有稀釋載體，所述稀釋載體為玉米面、紅糖、麥芽糊精中的一種或幾種。
進一步地，本發明還提供所述飼料添加劑的制備方法，其包括制備所述釀酒酵母 Kl菌泥，菌泥與凍干保護劑混合后冷凍干燥制備成凍干菌粉。
在一個優選的實施方案中，所述飼料添加劑的制備方法還可包括將制備的菌粉用稀釋載體進行稀釋，稀釋后，釀酒酵母Kl的活菌數不低于I. OX IO8CFU/克。
其中，所用的稀釋載體為70-100%的玉米粉或麥芽糊精和0-30%的紅糖。
其中，所述的凍干保護劑為4-6% (質量體積比)的蔗糖、O. 8-1. 2% (質量體積比)Vc 和O. 8-1. 2% (質量體積比)海藻糖水溶液以及10-20%菌泥重量的脫脂奶粉。
進一步地，本發明還提供含有所述飼料添加劑的配合料，所述配合料中所述飼料添加劑的比例為1飛％。。
本發明提供的釀酒酵母Kl與現有的釀酒酵母相比，對豬腸道常見的革蘭氏陰性和陽性細菌均有抑制作用，因此具有意料不到的技術效果。且這種酵母易培養，發酵、處理后活菌數較高，是一株值得開發的新型益生菌株。
用添加本發明的畜禽飼料添加劑的日糧飼喂畜禽，特別是幼齡畜禽，腹瀉發生率較低，進而其死淘率降低，提高料肉比，生產性能有較大的提高，為畜禽以后的生長打下良好的生長基礎。
本發明的釀酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)Kl,于2012年09年11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6560。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例I釀酒酵母菌的分離鑒定
分離培養基I :1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，IOOml蒸餾水。12rC，15min滅菌。
分離培養基2 :1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2. 5%瓊脂，IOOml蒸餾水。121。。， 15min滅菌，制備平皿備用。
無菌操作下，用接種環挑取新鮮荔枝皮放入分離培養基I中，30°C，ISOrpm，培養 36h。
無菌操作下，用接種環挑取培養36小時的培養液，在分離培養基2的平皿上劃線， 共制備3個平皿。30°C，培養36h。選擇單菌落呈米白色、隆起、表面光滑、近圓形，再進行平皿劃線，30°C，培養36h。按以上步驟，平皿劃線3次，分得的單菌落進行編號。
26sDNA提取用無菌牙簽挑取帶編號的單菌落，放入微量離心管管底，加 100μ IddH2O,開水煮8 10min，取出迅速放入_80°C冰箱冷凍lmin，重復上述步驟，再用開水煮 8 lOmin，12000rpm 離心 lmin,加入 PCR 反應體系50μ lPCRmix、2. 5μ INLl 引物、2.5 μ 1NL4引物、10 μ I菌液、35 μ lddH20。使用伯樂PCR儀，條件設計94°C預變性，5min，I 個循環;951變性455，601退火455，721延伸lmin，30個循環;72°C延伸lOmin，I個循環； 4°C無限。使用上海生工DNADL2000 Marker, PCR擴增產物電泳，選擇在650bp出現清晰條帶的樣品，送上海英駿生物技術有限公司測序。
將序列與NCBI的核酸序列進行比對，其中有一株菌株的序列(SEQ ID No. 3)與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)有99%的同源性,確定其為一株釀酒酵母菌，命名為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Kl。
NLl :5，-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’
NL4 :5’ -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’
實施例2釀酒酵母Kl抑菌功能試驗
過夜培養的致病性大腸桿菌K88，K99和金黃色葡萄球菌，沙門氏菌菌液用平板計數法計數。分別在4管5ml的大腸桿菌K88、K99、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌中加入5ml釀酒酵母Kl菌液。另取未接入釀酒酵母菌液的大腸桿菌K88、K99、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌作對照。30°C培養8h，平板菌落計數法計算加釀酒酵母Kl菌液的大腸桿菌K88、K99、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的活菌數以及未加釀酒酵母Kl這四種致病菌的活菌數。經計算， 殘存的致病性大腸桿菌K88、K99、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的活菌數為24. 7%,30. 2%,25.6% 和 31. 8%ο
實施例3釀酒酵母菌Kl凍干菌粉的制備
配制種子培養基1. 0%酵母浸粉，2. 0%蛋白胨，2. 0%葡萄糖，IOOml蒸餾水。121°C, 15min滅菌。從培養好的釀酒酵母Kl斜面上挑取一環接入到種子培養基中。培養條件 28°C, 180rpm,36ho
釀酒酵母發酵培養基1. 5%酪蛋白胨，2. 5%酵母浸粉，3. 0%葡萄糖，O. 24%磷酸二氫鉀，I. 6%磷酸氫二鉀，加入蒸餾水。12rC，15min滅菌。按5%接種量接入種子培養基。培養條件28°C,150rpm,72ho
所得發酵液用高速冷凍離心機離心，離心條件6000rpm，4°C，lOmin。離心后棄上清液，得菌泥。配制5%蔗糖、l%Vc和1%海藻糖保護劑，按菌泥重量的2倍稀釋攪拌菌泥，再加入10%進口脫脂奶粉混勻。先置于-80°C超低溫冰箱冷凍，再置于真空冷凍干燥機干燥 24h，取出粉碎，過60目篩，得凍干菌粉。
取凍干后的菌粉O. 5g，在無菌條件下放入裝有4. 5ml無菌水的試管，震蕩，混勻， 取O. 5ml菌液再放入裝有4. 5ml無菌水的試管，震蕩，混勻，以此類推，將菌液稀釋至10_8 后，取10_8、10_7、10_6濃度菌液各200 μ I涂平皿，每個濃度涂兩個平皿，使用商業麥芽汁瓊脂平皿，培養、計數。活菌計數活菌數約I. OX 101(lCFU/g。
實施例4斷奶仔豬活性釀酒酵母飼料添加劑的制備
實施例3中所得釀酒酵母凍干菌粉用玉米粉(過40目篩)，紅糖(食品級)按70% 30%稀釋，使最終活菌數達到I. O X 109CFU/g。
配制I噸斷奶仔豬配合飼料玉米521公斤，餅干粉150公斤，大豆柏250公斤，豆油5公斤，魚粉40公斤，磷酸氫鈣15公斤，石粉6公斤，食鹽3. 5公斤，賴氨酸3. 5公斤，大北農預混料5公斤，活性釀酒酵母飼料添加劑I公斤。共計1000公斤。
實施例5斷奶仔豬活性釀酒酵母飼料添加劑的制備
實施例3中所得釀酒酵母凍干菌粉用玉米粉(過40目篩)，紅糖(食品級)按70% 30%稀釋，使最終活菌數達到I. O X 109CFU/g。
配制I噸斷奶仔豬配合飼料玉米517公斤，餅干粉150公斤，大豆柏250公斤，豆油5公斤，魚粉40公斤，磷酸氫鈣15公斤，石粉6公斤，食鹽3. 5公斤，賴氨酸3. 5公斤，大北農預混料5公斤，活性釀酒酵母飼料添加劑5公斤。共計1000公斤。
實施例6肉仔雞活性釀酒酵母飼料添加劑的制備
實施例3中所得釀酒酵母凍干菌粉用玉米粉(過40目篩)，紅糖(食品級)按70% 30%稀釋，使最終活菌數達到I. O X 109CFU/g。
配制I噸(Γ3周齡肉仔雞配合飼料玉米600公斤，大豆柏318公斤，魚粉20公5斤，玉米蛋白粉20公斤，大豆油10公斤，磷酸氫鈣5公斤，食鹽3. 6公斤，石粉14公斤，氯化膽堿I公斤，蛋氨酸2. 4公斤，5%。肉仔雞預混料5公斤，活性釀酒酵母飼料添加劑I公斤。共計1000公斤。
實施例7肉仔雞活性釀酒酵母飼料添加劑的制備
實施例3中所得釀酒酵母凍干菌粉用玉米粉(過40目篩)，紅糖(食品級)按70% 30%稀釋，使最終活菌數達到I. O X 109CFU/g。
配制I噸0 3周齡肉仔雞配合飼料玉米596公斤，大豆柏318公斤，魚粉20公斤，玉米蛋白粉20公斤，大豆油10公斤，磷酸氫鈣5公斤，食鹽3. 6公斤，石粉14公斤，氯化膽堿I公斤，蛋氨酸2. 4公斤，5%。肉仔雞預混料5公斤，活性釀酒酵母飼料添加劑5公斤。共計1000公斤。
試驗例I
試驗動物
28日齡斷奶仔豬，根據窩源、體重、性別隨機分為3個處理，每個處理5個重復，每個重復8頭豬，公母比例均衡。一共需要120頭仔豬。
試驗規程
試驗從仔豬斷奶時即28日齡時開始，一共進行35天，63日齡時結束。處理一、二分別使用實施例4、5日糧，處理三使用普通日糧。
仔豬的飼喂、管理、藥物治療按豬場規定程序進行。
試驗開始、結束時稱量仔豬體重，早晨空腹進行，試驗結束前12小時將仔豬飼槽清理干凈，仔豬饑餓12小時后進行稱重。
整個試驗過程中觀察仔豬的健康狀況，記錄死、淘仔豬以及腹瀉、用藥情況。
腹瀉率(％)=試驗期腹瀉仔豬頭次/ (試驗仔豬頭數X試驗天數)X 100%
平均日增重(ADG)=(試驗結束窩重_試驗開始窩重)/試驗豬頭數/試驗天數
平均日耗料(ADFI)=消耗飼料/試驗豬頭數/試驗天數
料肉比(F/G)=ADFI/ADG
死淘率(％)=淘汰豬頭數/試驗豬頭數X 100%
試驗結果
表I仔豬35天生產性能統計表
權利要求
1.一種釀酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)新菌株Kl,其保藏號為 CGMCC No. 6560。
2.含有權利要求I所述菌株的凍干菌粉。
3.如權利要求2所述的凍干菌粉，其特征在于，活菌數不低于I.OX IOltlCFU/克。
4.含有權利要求2或3所述的凍干菌粉的飼料添加劑。
5.如權利要求4所述的飼料添加劑，其特征在于，還含有稀釋載體，所述稀釋載體為玉米面、紅糖、麥芽糊精中的一種或幾種。
6.權利要求4或5所述的飼料添加劑的制備方法，其包括制備所述釀酒酵母Kl菌泥，菌泥與凍干保護劑混合后冷凍干燥制備成凍干菌粉。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，還包括將制備的菌粉用稀釋載體進行稀釋，稀釋后，釀酒酵母Kl的活菌數不低于I. OXlO8CFU/克。
8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所用的稀釋載體為70-100%的玉米粉或麥芽糊精和0-30%的紅糖。
9.如權利要求61任一項所述的制備方法，其特征在于，所述的凍干保護劑為4-6%的蔗糖、O. 8-1. 2%Vc和O. 8-1. 2%海藻糖水溶液以及10-20%菌泥重量的脫脂奶粉。
10.含有權利要求4或5所述的飼料添加劑的配合料，其特征在于，所述配合料中所述飼料添加劑的比例為1飛％。。
全文摘要
本發明公開了一種釀酒酵母新菌株，及含有其的飼料添加劑，預混料。本發明提供的釀酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)新菌株K1，其保藏號為CGMCC No.6560。本發明還提供還有所述菌株的畜禽飼料添加劑。用添加本發明的畜禽飼料添加劑的日糧飼喂畜禽，特別是幼齡畜禽，腹瀉發生率較低，進而其死淘率降低，生產性能有較大的提高，為畜禽以后的生長打下良好的生長基礎。
文檔編號C12R1/865GK102925374SQ20121043009
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月1日 優先權日2012年11月1日
發明者閆軼潔, 宋維平, 胡婷, 贠桂玲, 李曼, 韓科廳 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 漳州大北農農牧科技有限公司, 吉林大北農農牧科技有限責任公司