專利名稱：一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水產魚類深加工利用的方法，特別是一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一種源自于生物體內的氧自由基清除劑，它能夠維持生物體內超氧陰離子的動態(tài)平衡，防止因體內O2 ■ ·濃度過高而引起的不良反應，被譽為“人體垃圾清道夫”，在抗衰老、抗炎癥、抗氧化、抗輻射和防治腫瘤等方面顯示出了獨特的功能，已廣泛應用于食品、醫(yī)藥和日用化工等行業(yè)。目前，國內外利用陸生動植物(特別是豬、牛、羊血液和大蒜)和微生物開發(fā)SOD的研究較多，而有關從水生生物如魚、蝦等中開發(fā)SOD的研究甚少，特別是利用羅非魚血液提純SOD的研究未見報道。
中國是世界上最大的羅非魚養(yǎng)殖生產國家，羅非魚加工廠將羅非魚血作為廢物排放，每年向環(huán)境中排放的羅非魚血達I. 2X IO4噸。而羅非魚血中富含如超氧化物歧化酶、血紅蛋白等多種有效成分，實現羅非魚血的綜合利用不僅可以避免環(huán)境污染，而且能夠顯著地增加企業(yè)的附加值，優(yōu)化企業(yè)的產業(yè)結構。常見的SOD提純技術有熱變性法、鹽析法、有機溶劑法和層析法等，但是迄今報道的眾多關于不同原材料的SOD提純工藝和參數不盡相同，因此，開發(fā)一條適合羅非魚血綜合利用的SOD提純工藝路線顯得尤為重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，從而使這些廢棄羅非魚血液資源得到高值化利用。為實現上述目的，本發(fā)明是通過以下實施方案來實現的一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其步驟包括a.紅細胞破碎將收集到的潔凈羅非魚血紅細胞用廣2倍體積的雙蒸水稀釋后，在超聲功率30(T400W條件下作用15 20min進行紅細胞破碎處理，然后5000 Xg離心15min，收集上層紅細胞液；b.乙醇、氯仿沉淀先后加入無水乙醇和氯仿到紅細胞液中，邊加邊攪拌，攪拌20min后，靜置30min，然后10000 Xg離心15min，收集上清液；再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿；c.熱變性處理將步驟b所得上清液在60°C條件下恒溫水浴15 20min，冷卻后10000 X g離心15min,收集上清液；d.陰離子交換將步驟c所得上清液在多功能蛋白快速純化液相色譜系統輔助下，采用陰離子交換法，制得SOD液。本發(fā)明還將得到的SOD液用可截留分子量為IOKDa的膜系統離心超濾，進行脫鹽和濃縮，收集濃縮液，并在-20°C條件下封存。本發(fā)明與現有技術相比，具有以下的效果
(I)本發(fā)明首次從羅非魚血液中提純S0D，為羅非魚血液的綜合利用提供了一條有效的途徑，使這些原本廢棄的資源得到高效利用，從而可以大大提高企業(yè)的經濟效益，還能帶來莫大的社會效益。(2)本發(fā)明首先是利用超聲技術 進行有效的細胞破碎，然后采用乙醇、氯仿沉淀實現SOD與血紅蛋白的同步分離，再利用SOD耐熱性好的特點，通過熱變性處理去除雜蛋白；并使用多功能蛋白快速純化液相色譜系統對陰離子交換過程進行控制，最后用離心超濾進行脫鹽和濃縮后得到SOD ;這樣SOD純化過程變得非常簡捷、高效。結果表明，本發(fā)明制備的SOD比活力為7541U/mg，回收率為50. 8%，純化倍數為1832，經PAGE鑒定為一條帶，達到了電泳純，SOD分子量為32KDa。(3)本發(fā)明工藝過程簡單，生產周期短，條件穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產，可向食品、醫(yī)藥和日用化工等行業(yè)提供價格低廉、安全可靠的SOD產品。
具體實施例方式實例一取潔凈羅非魚血紅細胞100ml，加入IOOml雙蒸水輕輕混勻，放入超聲儀中，將功率調至300W，作用15min，5000Xg離心15min，收集上層紅細胞液。先后緩慢加入15ml的無水乙醇和IOml的氯仿到紅細胞液中，邊加邊攪拌，攪拌15min后，靜置30min，10000Xg離心15min，收集上清液，再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿。將上步所得上清液在60°C條件下恒溫水浴15min，迅速冷卻后IOOOOXg離心15min,再次收集上清液。配制500ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液作為離子交換起始緩沖液(A液)，配制1000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(內含lmol/L NaCl)作為離子交換洗脫緩沖液(B液)，在多功能蛋白快速純化液相色譜系統控制下(系統可選用AKTA purifier 10品牌產品)，用A液將再次收集的上清液加載到離子交換柱上(離子交換柱可選用和上述品牌配套的HiTrap DEAE FF產品)，用B液進行線性梯度洗脫，收集活性峰，即得高純度SOD 液。實例二取潔凈羅非魚血紅細胞100ml，加入200ml雙蒸水輕輕混勻，放入超聲儀中，將功率調至400W，作用20min，5000Xg離心15min，收集上層紅細胞液。先后緩慢加入IOml的無水乙醇和15ml的氯仿到紅細胞液中，邊加邊攪拌，攪拌20min后，靜置30min，10000Xg離心15min，收集上清液，再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿。將上步所得上清液在60°C條件下恒溫水浴20min，迅速冷卻后IOOOOXg離心15min,再次收集上清液。配制500ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液作為離子交換起始緩沖液(A液)，配制500ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(內含lmol/L NaCl)作為離子交換洗脫緩沖液(B液)，用A液將再次收集的上清液加載到離子交換柱上，用B液進行分步洗脫，收集活性峰，即得高純度SOD液。將得到的SOD液用可截留分子量為IOKDa的膜系統離心超濾，進行脫鹽和濃縮，收集濃縮液，即為純凈的SOD終產品，將其在_20°C條件下封存。
實例三取潔凈羅非魚血紅細胞1000ml，加入2000ml雙蒸水輕輕混勻，放入超聲儀中，將功率調至400W，作用20min，5000Xg離心15min，收集上層紅細胞液。先后緩慢加入IOOml的無水乙醇和IOOml的氯仿到紅細胞液中邊加邊攪拌，攪拌20min后,靜置30min, 10000 Xg離心15min,收集上清液,再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿。將上步所得上 清液在60°C條件下恒溫水浴15min，迅速冷卻后IOOOOXg離心15min,再次收集上清液。配制5000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液作為離子交換起始緩沖液(A液)，配制5000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(內含lmol/L NaCl)作為離子交換洗脫緩沖液(B液)，用A液將上述再次收集到的上清液加載到離子交換柱上，用B液進行分步洗脫，收集活性峰，即得高純度SOD液。將得到的SOD液用可截留分子量為IOKDa的膜系統離心超濾，進行脫鹽和濃縮，收集濃縮液，將濃縮液在_20°C條件下急凍后，進行真空冷凍干燥，即得SOD干粉終產品。本發(fā)明的實施方式不限于此，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，均落在本發(fā)明權利保護范圍之內。
權利要求
1.一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其特征在于包括以下步驟 a.紅細胞破碎將收集到的潔凈羅非魚血紅細胞用廣2倍體積的雙蒸水稀釋后，在超聲功率30(T400W條件下作用15 20min進行紅細胞破碎處理，然后5000 Xg離心15min，收集上層紅細胞液； b.乙醇、氯仿沉淀先后加入無水乙醇和氯仿到紅細胞液中，邊加邊攪拌,攪拌20min后，靜置30min，然后10000Xg離心15min，收集上清液；再用氮吹儀處理去除乙醇和氯仿； c.熱變性處理將步驟b所得上清液在60°C條件下恒溫水浴15 20min，冷卻后10000 X g離心15min,收集上清液； d.陰離子交換將步驟c所得上清液在多功能蛋白快速純化液相色譜系統輔助下，采用陰離子交換法，制得SOD液。
2.根據權利要求I中所述的一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其特征在于將得到的SOD液用可截留分子量為IOKDa的膜系統離心超濾，進行脫鹽和濃縮，收集濃縮液，并在-20°C條件下封存。
3.根據權利要求I中所述的一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述的步驟b中先后按羅非魚血紅細胞體積比加入1(Γ15%的無水乙醇和1(Γ15%的氯仿。
4.根據權利要求I中所述的一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步驟d中多功能蛋白快速純化液相色譜系統中，配制1000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液作為離子交換起始緩沖液；配制1000ml pH8. O 20mmol/L的Tris-HCl緩沖液并內含lmol/L NaCl作為離子交換洗脫緩沖液；用起始緩沖液將上清液加載到離子交換柱上，用洗脫緩沖液進行線性梯度洗脫，收集活性峰，即得高純度SOD液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從羅非魚血液中提純超氧化物歧化酶(SOD)的方法，包括以下步驟將收集到的潔凈羅非魚血紅細胞用雙蒸水稀釋后，經超聲波輔助細胞破膜處理；依次加入無水乙醇和氯仿沉淀雜蛋白，離心，收集上清液，并用氮吹儀去除有機溶劑；將收集到的上清液在60℃條件下加熱處理，離心，收集上清液；采用多功能蛋白快速純化液相色譜系統控制，將經上述步驟得到的SOD液用陰離子交換進行純化，得到的高純度SOD液。本發(fā)明提純方法耗時短，操作單元精簡，適合于工業(yè)化生產；能較好地解決羅非魚血排放造成的環(huán)境污染問題，并能夠顯著地增加企業(yè)的附加值。
文檔編號C12N9/02GK102888386SQ20121043409
公開日2013年1月23日 申請日期2012年11月2日 優(yōu)先權日2012年11月2日
發(fā)明者李來好, 岑劍偉, 楊賢慶, 郝淑賢, 劉在軍, 吳燕燕, 黃卉, 魏涯, 林婉玲, 鄧建朝, 周婉君, 石紅 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所