專利名稱：一種鑒定鯉魚基因拷貝數的方法
技術領域：
本發明屬于魚類生物技術領域，涉及一種鑒定鯉魚基因拷貝數的方法。
背景技術：
鯉魚{Cyprinus carpio L.)是世界性重要的淡水養殖魚類，分布廣，養殖歷史悠久。鯉魚染色體數目(2n=100)是大部分鯉科魚類染色體數目(2n=42飛O)的兩倍左右，因此科學家認為鯉魚是四倍體，上世紀90年代始，鯉魚微衛星及功能基因分離中，均發現基因數為鯉科模式魚、斑馬魚等兩倍體魚的2倍，如鯉魚存在兩個基因位點，此外肌肉抑制素(MSTNs)、生長激素受體(GHRs)、生長激素促泌素受體(GHS-Rs)等時也發現類似情況，這些說明鯉魚進化過程中存在染色體四倍化過程，而且兩套染色體存在一定的差異，可以推測鯉魚物種的形成是由兩種遺傳距離相近的魚雜交后染色體加倍形成的，也有可能魚類性細胞中存在的比例很少的兩倍體性細胞雜交的結果。以鯉魚DNA為模板，應用熒光定量PCR的分析，可以快速、準確地鑒定鯉魚體內基因拷貝數，確定目的基因為單拷貝基因或雙拷貝基因，為鯉魚染色體間遺傳物質交流或分子育種等研究提供直接、有效的分子證據。

發明內容
本發明的目的是提供一種鑒定鯉魚基因拷貝數的方法，有助于快速、準確鑒定目的基因為單拷貝基因或雙拷貝基因，在鯉魚分子育種過程中如分子標記的篩選具有重要的指導意義。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種鑒定鯉魚基因拷 貝數的方法，包括以下步驟:
(1)提取鯉魚總DNA；
(2)選取已知的鯉魚單、雙拷貝基因作為對照基因，設計其定量PCR引物，并設計目的基因的定量PCR引物；
(3)以鯉魚總DNA為模板，以單、雙拷貝對照基因引物和目的基因的定量PCR引物為引物進行實時定量PCR ；
(4)比較目的基因和對照基因的擴增曲線，確定目的基因的拷貝數。步驟(2)中，所述對照基因可為任何已知的鯉魚基因，可以是不同的基因，也可以是同一種基因的不同拷貝數。若為同一種基因的不同拷貝數，設計的每對引物必須只能擴增出一種唯一拷貝數的基因，如本實驗室已分離的肌肉抑制素基因(MSTN)的單拷貝基因 MSTN2a,定量 PCR 引物 M2aF: CCACAGAACGTAAGTACCAAGATGC,M2aR: GCTGAAT GAATGAACCACTATTGTGG ;雙拷貝基因 MSTN2s，定量 PCR 引物 M2sF:GCATCTGTGACGACTGGAGACGAC, M2sR:GATGGTCTCACTGCTGCCTTGTTC。步驟(3)中，實時定量PCR反應總體積20 μ ,內含2 μ cDNA模板，引物各0.8μ (引物濃度 10 Mmol/L)，反應條件:95°C 30sec，95°C 5sec，61°C 30 sec，40個循環，Tm曲線。
步驟(4)中，確定目的基因的拷貝數的方法為:若目的基因的擴增曲線與單拷貝對照基因的擴增曲線基本重合，則為單拷貝基因；若目的基因的擴增曲線與雙拷貝對照基因的擴增曲線基本重合，則為雙拷貝基因。運用本發明所述的方法，可以在分子水平快速準確地鑒定目的基因的單雙拷貝數，為鯉魚染色體間遺傳物質交流或分子育種等研究提供直接、有效的分子證據。


圖1為I號個體原液DNA為模板的實時定量PCR擴增曲線 圖2為2號個體5倍稀釋液為模板的實時定量PCR擴增曲線 圖3為3號個體125倍稀釋液為模板的實時定量PCR擴增曲線 其中:a為雙拷貝對照MSTN2s基因
b為PRKAG3II基因 c為GHia基因 d為單拷貝對照MSTN2a基因 具體實施方式
:
下列以生長激素基因 6 與/!/淑似 //(protein kinase, AMP-activated, gamma 3subunit gene, 一磷酸腺苷蛋白激酶Y 3基因)為例,對發明的方案做進一步地說明,但不構成對本發明的限制。實施例中基因組DNA的提取均使用鯉魚尾靜脈采血，AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒(Axygen)進行， 以保證模板DNA的質量。實施例1
隨機取鯉魚I尾(I號個體)，尾靜脈采血，使用AxyPr印血基因組DNA小量試劑盒(Axygen)嚴格按照說明書來抽提基因組DNA。單拷貝對照基因MSTN2a，定量PCR引物 M2aF:CCACAGAACGTAAGTACCAAGATGC，M2aR: GCTGAAT GAATGAACCACTATTGTGG ；雙拷貝對照基因 #57 ,定量 PCR 引物 M2 sF: GCATCTGTGACGACTGGAGACGAC，M2sR:GATGGTCTCACTGCTGCCTTGTTC。 目的基因 GHla 定量 PCR 引物 GF:GTGAAATGTGCTTAGGACTCACCTGT, GR:CTTCTGTGTTTCA TCTTTTCCAGCA ；目的基因 PRKAG3 定量PCR 引物 PF:AGGACACCATCCGTCATCTCATTAG, PR:GCAGACA GCCATTAACTTGAGCTC。摸索各對引物的最佳退火溫度，以溫度變化TC時Ct值基本一致為標準。實時定量PCR反應總體積20 μ ,內含2 μ 原液DNA模板，單、雙拷貝對照基因MSTN2a、MSTN2s引物及目的基因引物各 0.8 μ (引物濃度 10 Mmol/L)，反應條件:95°C 30sec，95°C 5sec,61 °C 30 sec，40 個循環，Tm 曲線。使用 TAKARA SYBR Premix Ex TaqTM II 試劑盒，在min1-BIO-RAD定量PCR儀進行實時定量PCR。擴增曲線如圖1所示，目的基因GHla的擴增曲線與單拷貝對照基因的擴增曲線基本重合，為單拷貝基因；目的基因的擴增曲線與雙拷貝對照基因MSTN2s的擴增曲線基本重合，為雙拷貝基因。實施例2
隨機取鯉魚I尾(2號個體)，尾靜脈采血，使用AxyPr印血基因組DNA小量試劑盒(Axygen)嚴格按照說明書來抽提基因組DNA，并在超凈臺上對所抽提DNA進行5倍梯度稀釋用于定量PCR的模板。使用如實施例1中相同的引物及方法，進行實時定量PCR。所得擴增曲線如圖2所示，5倍稀釋DNA為模板的定量結果與原液DNA為模板的擴增結果一致，目的基因的擴增曲線與單拷貝對照基因的擴增曲線基本重合，為單拷貝基因；目的基因的擴增曲線與雙拷貝對照基因的擴增曲線基本重合，為雙拷貝基因。 實施例3
隨機取鯉魚I尾(3號個體)，尾靜脈采血，使用AxyPr印血基因組DNA小量試劑盒(Axygen)嚴格按照說明書來抽提基因組DNA，并在超凈臺上對所抽提DNA進行125倍梯度稀釋用于定量PCR的模板。使用如實施例1中相同的引物及方法，進行實時定量PCR。所得擴增曲線如圖3所示，125倍稀釋DNA為模板的定量結果與原液及5倍稀釋的DNA為模板的擴增結果一致，目的基因的擴 增曲線與單拷貝對照基因的擴增曲線基本重合，為單拷貝基因；目的基因PRKAG3II的擴增曲線與雙拷貝對照基因的擴增曲線基本重合，為雙拷貝基因。
權利要求
1.一種鑒定鯉魚基因拷貝數的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)提取鯉魚總DNA； (2)選取已知的鯉魚單、雙拷貝基因作為對照基因，設計其定量PCR引物，并設計目的基因的定量PCR引物； (3)以鯉魚總DNA為模板，以單、雙拷貝對照基因引物和目的基因的定量PCR引物為引物進行實時定量PCR ； (4)比較目的基因和對照基因的擴增曲線，若目的基因的擴增曲線與單拷貝對照基因的擴增曲線基本重合，則為單拷貝基因；若目的基因的擴增曲線與雙拷貝對照基因的擴增曲線基本重合，則為雙拷貝基因。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，所述對照基因為MSTN，其單拷貝定量 PCR 引物為:M2aF:CCACAGAACGTAAGTACCAAGATGC, M2aR:GCTGAATGAATGAACCACTATTGTGG ;其雙拷貝定量 PCR 引物為 M2 sF: GCATCTGTGACGACTGGAGACGAC,M2sR:GATGGTCTCACT GCTGCCTTGTTC。
全文摘要
本發明公布了一種鑒定鯉魚基因拷貝數的方法，包括以下步驟(1)提取鯉魚總DNA；(2)選取已知的鯉魚單、雙拷貝基因作為對照基因，設計其定量PCR引物，并設計目的基因的定量PCR引物；(3)以鯉魚總DNA為模板，以單、雙拷貝對照基因引物和目的基因的定量PCR引物為引物進行實時定量PCR；(4)比較目的基因和對照基因的擴增曲線，確定目的基因的拷貝數。運用本發明所述的方法，可以在分子水平快速準確地鑒定目的基因的單雙拷貝數，為鯉魚染色體間遺傳物質交流或分子育種等研究提供直接、有效的分子證據。
文檔編號C12Q1/68GK103103254SQ20121044009
公開日2013年5月15日 申請日期2012年11月7日 優先權日2012年11月7日
發明者李紅霞, 俞菊華, 李建林, 唐永凱 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心