專利名稱：凝集素用于識別、純化干細胞的方法、試劑盒及應用方法
技術領域：
本發明屬于生物技術、干細胞、腫瘤學領域，涉及采用凝集素用于識別、純化干細胞的方法、試劑盒及其應用，具體而言，涉及采用特異識別糖蛋白和/或糖脂糖鏈末端的凝集素結合物用于從嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的細胞群中識別、純化干細胞的方法、試劑盒，本發明所公開的方法、試劑盒可有效且精準的用于從所述細胞群中識別、純化成體干細胞、腫瘤干細胞、癌干細胞，所述含干細胞的樣品不帶任何外來標記。本發明還涉及獲得的干細胞及它們在諸如研究或治療中的廣泛用途。
背景技術：
“凝集素”這一術語最早在1888年出現，人們發現其具有凝集紅細胞的特性。簡單來說，凝集素也是一種蛋白質，廣泛從植物、動物、真菌、細菌等中分離，具有結合糖脂或糖肽末端特異性碳水化合物的特性(SharonN等,Science, 1972.177(53):949-59 ；PusztaiA，植物凝集素，1991.劍橋:劍橋大學出版社)，且其唯一的特異性在于，它們是一組結構上有區別的蛋白質，且可特異性結合細胞膜上的碳水化合物，并進一步通過細胞膜表面寡糖基之間的交聯實現對細胞的凝集(Pusztai A，植物凝集素，1991.劍橋:劍橋大學出版社；Sharon N, Trends Biochemistry Sci,1993.18(6):221-226)。眾所周知，糖基化是在酶的作用下，實現對蛋白質或脂質附加上糖類的過程。此過程為共轉移(co-translational)與后轉移修飾的步驟之一,發生于內質網，細胞表面蛋白發生糖基化的幾率幾乎超過50%。早在二十世紀的八十年代，有研究者發現，凝集素具有結合或殺死胚胎性的細胞癌和生殖系腫瘤細胞的能力，后來又發現，多潛能干細胞表面上的抗原常常顯示為糖蛋白或糖脂(Andrews PW等,Hybridoma, 1984.3 (4):347-61 ；Pere MF等，Differentiation, 1988.39 (2): 139-49),這提示蛋白質特異性糖基化可能是細胞具有多潛能性的標志。

上述研究結果表明 凝集素可能具有與多能性的細胞相互作用的特征(Draber P等，Somat Cell MolGenet, 1984.10:435-443 ；KosmehI H 等，Neoplasma 1989.36:29-39)。而且，膜結合蛋白和對應配體的低聚糖化修飾常常介導細胞外分子或信號啟動的胞內信號傳導(Haltiwanger RS.Curr Opin Struct Biol2002.12 (5):593-8 ;Xia L 等，Blood,2004.104(10):3091-6)。人們發現，在許多細胞相關的事件，例如細胞分化(Moody AM等，Cell, 2001.107(4):501-12)以及腫瘤(Reis CA等，J Clin Pathol, 2010.63(4):322-9)發生中，均可觀察到蛋白糖基化的動態變化。在胚胎水平，例如，小鼠胚胎多個組織器官的上皮細胞膜上，研究者發現其上有結合特異性凝集素的位點(Carter WG 等，J.Biol.Chem, 1975.250(7) =2756-62 ；NoguchiM等，J.Embryol.Exp.Morphol, 1982.72:39-52),進一步觀察發現，不同類型的凝集素在識別胚胎不同組織上皮方面具有差異性，有趣的是，當用低劑量放射件射線照射小鼠胚胎后(0.25,0.50和0.75Gy)，細胞膜上結合SBA、PNA和DBA三種凝集素的表達量增加(Nievergelt-Egido MC等，Radiat Environ Biophys, 1993.32 (2):119-28),而且在胚胎不同區域，三種凝集素的結合強度不同。隨后在胚胎期發育的胰腺上皮和管狀細胞膜上，其他研究者進一步發現，上述細胞膜上有可特異性結合凝集素的位點，這表明識別細胞膜上特異性糖表位的凝集素可能作為一個指示細胞具有多能性的標志，可用于表征胰腺前體細胞(Kobayashi 等,BBRC, 2002.293 (2):691-7)。近期研究發現,路易斯寡糖(Lewis X antigen)在小鼠的胚胎干細胞、多潛能細胞和胚胎癌性細胞的細胞膜上均有表達，而不在人類相應的胚胎干細胞、內細胞團或胚胎癌性細胞上表達(Muramatstu TA等，GlycoconjugateJournal, 2004.21:41-45),未來還需要進一步研究這一不一致性。采用細胞生物學和生物化學方法，來自多個研究者的實驗研究發現，人類胚胎干細胞與其蛋白的糖基化密切相關(Xia L等，Blood, 2004.104:3091-6 ；Satomaa T等，BMCCell Biol, 2009.10:42 ；Venable A 等，BMCDev Biol 2005 ;5:15)。細胞膜上的特異性糖原表位可作為一個新的、特異性標志，用于反映小鼠胚胎的早期分化狀態，其表達早于目前所發現的胚胎特異性抗原，如SSEA1，CD9和FA，而且，隨著胚胎分化進程的發展，其膜上特異性糖原表位的表達逐漸降低并消失(Nash Rodney等,2006, stem cell.25(4):974-82)。Wang等采用培養的胚胎干細胞或誘導多能干細胞為研究對象，當用凝集素芯片分析細胞抽提物后發現，特異性的凝集素可用來識別和分離胚胎干細胞(Wang YC等，Cell Research,2011.1-13)。。在成體水平，例如，識別D-半乳糖的刀豆凝集素(PNA)可用來對嚙齒動物的造血干細胞進行進一步分群(Salner AL 等，1982, J Natl Cancer Inst.68 (4):639-41),甚至可用來從神經組織中識別和分離出PNA陽性的細胞群(Rietze RL等，Nature,2001.412(6848):736-9)，分選的細胞可能是干細胞。最近的研究發現，CD133+的人造血干細胞和祖細胞的N-糖基化模式與N-glycan結構和基因表達密切相關(Hemmoranta H等，Exp Hematol,2007.35(8):1279-92)。腫瘤/癌與凝集素腫瘤是機體細胞失去對其生長的正常調控而形成的新生物，是細胞自身調控和其所處的微環境相互作用的結 果，其治療仍是一個世界難題。目前腫瘤研究領域的一個研究熱點是癌干細胞(Cancer Stem Cells, CSCs)。早期由多倫多大學的分子生物學家JohnDick研究者提出“癌干細胞”理論(John Dick等，Nature, 1994.17:645-648)，這一新理論表明，癌癥的發生及難于根治的在于其內癌干細胞(CSCs)的存在，隨后的多個癌癥研究中的研究結果支持此理論(ReyaT等，Nature, 2001.414:105-111),源自其他組織的進一步研究證實了癌干細胞是存在的，它們在例如血液、乳腺、腦組織、肺組織和腸組織中存在(A1-Hajj M 等，PNAS，2003.100:3938-3988) ；He 等，Nat Genet, 2007.39:189-198 ；Kim CF等，Cell, 2005.121:823-835 ；Lapidot T 等，Nature, 1994.367:645-648 ；Ricc1-VitianiL 等，Nature, 2006 ；Singh SK 等，Nature, 2004.432:396-401 ；YiImaz OH 等，Nature,2006.441:475-482)。“癌干細胞”的提出給腫瘤的治療帶來曙光，因而，如果能夠識別癌干細胞將具有及其重要的臨床意義，例如通過靶向癌干細胞從而治愈腫瘤等，將產生重大的應用價值和經濟效益。然而，遺憾的是，現在尚沒有很有效的方法從腫瘤組織中識別、分離出癌干細胞，這也意味著在治療中，不可能準確而徹底地清除掉癌干細胞。這大大阻礙了針對腫瘤的有效治療。研究發現，腫瘤細胞表面和其所處的微環境中大量糖鏈修飾改變以及凝集素受體功能異常在腫瘤發生發展和轉移過程中發揮極其重要的作用。其中，糖鏈合成的調控以及糖鏈與凝集素的相互作用參與了腫瘤生物學行為的各個方面。凝集素已廣泛應用于腫瘤細胞表面糖連接物的研究，其在腫瘤的生物學行為研究、診斷、治療及其預后方面起著十分重要的作用。成體干細朐:成體干細胞是另外一種特殊干細胞群，越來越多的證據表明成體干細胞可見于多種成熟組織(MooreKA, Science, 2006.311(5769): 1880-1885)，而成體干細胞研究的基礎和其在臨床上的應用先決條件和最關鍵條件之一是對干細胞的有效且精準篩選分離。當前，研究者已鑒定到多個成體干細胞相關的分子表面標志，例如Thy-llow、FLK2-Lineage-Sca-l+c_Kit+ 用于識別造血干細胞(Hematopoietic stem cells,HSCs) (Christemsen JL 等，PNAS,2001.98: 14541-14546 ；Uchida N 等，Experimentalhematology,1996.24:649-659), ISL1 +、Sca-1+ 或 c_kit+(Laugwitz KL,等，Nature.2004.433(7026):647-653 ；0kada S 等，Blood，1991.78 (7):1706-12 ；Matsuura K等，J Biol Chem，2004.279(12):11384-91), a 6brilOG7dim 用于識別表皮干細胞(LiA 等，PNAS, 1998.95(7):3902-7 ；Tani H 等，PNAS, 2000.97(20):10960-10965 ；Lavker RM 等，PNAS, 2000.97(25):13473-75)，雖然在成體干細胞特異分子標志方面取得了一定進展，但從成體中分離干細胞仍是極具挑戰性的任務，一方面在于其數量較少且更難于定位、篩選分離各種組織特異性干細胞，另外一方面在于缺少可靠的特異性分子標記物對其進行識另O，目前特異的細胞表面標記很難達到共識，其有效性需要進一步分析。

發明內容
本發明的目的在于公開一種識別、純化干細胞的方法、試劑盒及其應用方法，并進
一步拓展其應用。本發明人為實現上述目的，進行了深入研究，結果本發明人驚喜的發現，特異性的凝集素不僅可用于識別嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的正常組織或器官中的特異性成體干細胞、腫瘤干細胞、癌干細胞，而且也可用于從來源于所述物種的細胞群中純化出所述干細胞。本發明公開了一種采用凝集素用于識別、純化干細胞的方法，其包括:(I)在使所述細胞群與細胞預處理試劑預先接觸條件下，使樣品接觸一種凝集素，后者含有:(a)至少一種凝集素，其可識別糖蛋白和/或糖脂糖鏈末端特異位點，該凝集素與(b)至少一種結合物進行直接或間接連接；和(2)將與所述凝集素結合物結合的細胞群從所述樣品中分離，獲得富含干細胞的樣品，其中，所述細胞上存在與所述凝集素特異親和性的受體表明它們是干細胞。其中，可通過加入洗脫糖的方法把所述凝集素結合物從所述細胞群上洗脫，從而獲得不含任何外來標記的富含干細胞的樣品。其中，細胞預處理過程選擇采用沉淀或裂解法沉淀或裂解細胞群中的紅細胞的試齊U，所述試劑可選擇為質量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細胞裂解液、質量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HIT0PAQUE, Ficoll的任一一種進行細胞預處理， 其中，所述試劑至少重復接觸所述細胞群一次。
其中，所述凝集素結合物中的凝集素包括天然的或化學合成的植物凝集素、動物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C。其中，所述凝集素結合物中的結合物可選擇預先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進行結合，或選擇具有對凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種。其中，所述與凝集素結合的聞分子量的生物大分子的分子量在一萬道爾頓(Mw)至八十萬道爾頓(Mw)之間，其中所述高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。其中，所述含干細胞的細胞群來源于嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的成體組織、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌性組織、轉移瘤/癌組織或其他潛在包含干細胞的一種或兩種以上組織的組合，或選擇來自所述組織的原代、傳代細胞群的一種或兩種以上的組合。本發明還公開采用凝集素用于識別、純化干細胞的試劑盒及其應用方法，其中，所述凝集素還可用于確定組織、細胞群中干細胞存在與含量，其在用于從所述細胞群中富集、提純干細胞的用途。所述用于識別、純化干細胞的試劑盒，其包括:I)細胞預處理試劑A ；2)識別、純化試劑B ；3)以及任選的容器；`其中，所述細胞預處理試劑A可選擇為質量濃度為01 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細胞裂解液、質量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；所述細胞預處理試劑或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，其中，所述試劑至少重復接觸所述細胞群一次。其中，識別、純化試劑B為凝集素結合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、動物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，其中所述凝集素結合物中的結合物可選擇預先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進行結合，或選擇具有對凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種，所述凝集素的濃度為
0.001 40mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于 38。。。其中，所述含干細胞的細胞群是嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的正常成體和或病變、腫瘤、癌前、癌性、癌轉移組織，或來自所述組織的原代、傳代細胞群的一種或兩種以上的組合。其中，隨后可選擇采用熒光活化細胞分選法用于鑒定和分選結合凝集素結合化合物的細胞群或選擇沉淀法分離結合凝集素的所述細胞群，進一步，分離的所述干細胞，其包含細胞膜上的可與凝集素結合的受體。其中，根據本發明方法、試劑盒獲得的純化的干細胞，可進一步通過加入洗脫糖的方法把所述凝集素結合物從所述細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物。
其中，所述識別、純化的干細胞包括全能干細胞、多能干細胞、專能干細胞、成體干細胞、腫瘤干細胞、癌干細胞，進一步，其與已知干細胞標志物接觸。其中，本發明所述試劑盒還包括洗脫糖，用于把所述凝集素結合物從所述細胞上洗脫，從而使得所述獲得含干細胞的樣品不帶任何外來標記。其中，所述獲得的干細胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調整干細胞的濃度和體積。其中，根據本發明所述的試劑盒應用方法，其應用方法包括以下步驟:(I)所述細胞樣本與細胞預處理試劑A接觸:如加入紅細胞沉淀劑,選擇取上清；如加入紅細胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細胞沉淀；(2)使經過步驟(I)的所述細胞群與所述識別、純化試劑B接觸，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C ；(3)分離獲得凝集素陽性的細胞群:可選擇采用熒光活化細胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法；(4)加入洗脫糖把所述凝集素結合物從經步驟(3)獲得的所述細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物，進一步，獲得的干細胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調整干細胞的濃度和體積。 所述分離的干細胞用于，例如生物化學、分子生物學或標志物水平的進一步分析，進一步，所述細胞可以是同一表型或不同表型的集合，其中所述識別的干細胞包含至少I個，所述純化的干細胞包含至少為I %，優選包含至少50%，更優選包含至少70%，更優選包含至少80 %，最優選包含至少90 %。進一步，所述分離的干細胞其細胞表面有可與凝集素結合物中的凝集素結合的受體，進一步所述細胞與已知干細胞標志物接觸，例如Sca-l、Alb、c-Kit、⑶90、Nkx2.5分子。進一步，根據本發明所述的方法，可用于制備用于診斷樣品中干細胞存在和/或含量的診斷劑應用。其中，本發明所述試劑盒識別、純化的干細胞為成體干細胞、腫瘤干細胞、癌干細胞，所述識別的干細胞包含至少I個，純化的干細胞的純度至少為1%。本發明所述成體干細胞，優選出生后的組織獲得的干細胞。在諸如人類的哺乳動物中，優選的，從至少I歲大的個體中獲得的成體干細胞，優選發育期后的個體，例如成年。在本發明的優選實施方案中，所述干細胞是成體干細胞、腫瘤干細胞和/或癌干細胞。其中，檢測或分離干細胞的方法包括采用熒光活化細胞分選法(FACS)用于鑒定和純化結合凝集素結合物的細胞。其中，根據本發明所述方法、試劑盒獲得的分離的干細胞，進一步，分離的干細胞，其包含細胞膜上的可與凝集素結合的受體。據此，本發明通過上述方法、試劑盒實現從所述嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的樣品中識別、純化干細胞，并進一步獲得不帶任何外來標記的含所述干細胞的樣品，本發明所述分離的干細胞群在基礎與應用研究、組織工程、治療、修復受損或病變組織、藥物篩選等中的應用。 本發明所述試劑盒具有普遍適用性，可用于準確且快速識別、純化嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的干細胞。進一步，所述試劑盒具有使用簡捷、可工業化生產、特異性強、實用有效，應用前景廣泛的優點。


圖1識別、純化肺干細胞的結果圖，具體如實施例1。A圖表示同型對照組的流式圖(n = 2) ;Β圖表示分離、純化肺干細胞的流式圖，從細胞群中所純化的凝集素陽性活細胞數量約為4.5% (n = 2) ；C圖表示所述肺干細胞的純度。圖2骨髓、臍帶血中識別、純化干細胞結果圖，具體如實施例2。A圖表示采用PE標記的蝸牛凝集素(PE-HA)從骨髓細胞群中識別、純化干細胞的結果，陽性細胞數量為2.6% (η = 2),B圖表示細胞純度為95.7%；C圖表示采用PE標記的荊豆凝集素(PE-UEA)從臍帶血細胞群中識別、純化干細胞的結果，陽性細胞數量為3.5%(n = 2)，D圖表示細胞純度為96.8 %。
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圖3識別、純化肝癌干細胞的結果圖，具體如實施例3。A圖表示同型對照組，對照組細胞數量為0.13% (n = 2) ；Β圖表示采用TRITC標記的凝集素SJ(T-SJ)作為分子標記從肝癌組織中提純干細胞的結果，凝集素陽性細胞數量為5.6% (n = 2) ；C圖表示新分離的T-SJ陽性肝癌干細胞群，星號指CD90+(綠色)細胞，其中細胞核用DAPI染色，圖片的放大倍數為100倍。圖4采用本發明試劑盒從細胞群中識別、純化肝干細胞和肺干細胞的結果圖，具體如實施例4。A-C圖表示肝干細胞的純化及顯微鏡觀察結果，其中，A圖表示同型對照組，對照組細胞數量為0.05% (n = 2) ；Β圖表示采用明膠結合的凝集素PT從肝臟細胞群中純化干細胞并用FITC-PT進行流式鑒定分析的結果，凝集素陽性細胞數量為2.6% (η = 2)；C圖表示新分離的細胞群，短箭頭指F-PT+/Alb+肝干細胞，星號指F-PT+/Alb-肝干細胞。A’ -C’圖表示肺干細胞的純化及顯微鏡觀察結果，其中，A’圖表示同型對照組，對照組細胞數量為0.19% (n = 2) ;Β’圖表示采用明膠結合的凝集素RC從肺臟細胞群中純化干細胞并用TRITC-RC進行流式鑒定分析的結果，凝集素陽性細胞數量為4.3% (n = 2) ;C’圖表示新分離的細胞群，箭頭指T-RC+(紅色)/c-Kit+(綠色)肺干細胞。細胞核用DAPI染色，圖片的放大倍數為100倍。圖5采用本發明試劑盒從細胞群中識別、純化心干細胞的結果圖，具體如實施例
5。A圖表示同型對照組,對照組細胞數量為0.1% (n = 2) ；Β圖表示采用FITC標記的凝集素SJ(F-SJ)作為分子標記從心臟細胞群中純化干細胞的結果，凝集素陽性細胞數量為
4.9% (n = 2) ；C圖表示新分離的F-SJ陽性的細胞群，其中細胞核用DAPI染色，短箭頭指F-SJ陽性心臟干細胞，長箭頭指F-SJ+/Nkx2.5+心臟干細胞，圖片的放大倍數為100倍。
具體實施例方式以下結合具體實施例以詳細說明本發明的優點，本領域的技術人員應當理解，本發明的實施例目的是為了清楚的說明本發明的優點，并不是用于限制本發明，任何基于本發明的修飾、替換、改變均落在本發明的精神范疇和保護范圍之內。如本發明所述，除非上下文另有明確指示，否則沒有限定對象的含義。如本領域技術人員所理解的，本發明文中“一種”指“至少一種”。術語“包含”、“包括”、“含有”、“選擇”是同義詞，是具有包容性的或者開放性的，并且不排除額外的未詳述的成員、要素或方法步驟。如本發明所述，術語“細胞群”是指一個或一個以上的細胞的組合，通常是指一組細胞，除非另有說明，否則該術語是指由本發明所述分離的細胞組成或包含此處分離的細胞的細胞群體。如本發明所述，術語“組織”包括從嚙齒動物、人類或其他哺乳動物獲得的正常組織或器官標本、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌組織、轉移瘤/癌組織。所述細胞群源自嚙齒動物、人類或其他哺乳動物正常組織或器官標本、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌組織、轉移瘤/癌組織，源自上述物種中所制備的原代細胞群、所述細胞群的傳代細胞或所建立的細胞系中獲得，其可由具有共同表型的細胞組成或包含至少部分具有共同表型的細胞組成，當細胞在一個或多個顯著特征上基本相似或一致時，可以認為細胞具有共同表型，其特征包括但不限于形態外觀，某細胞成分或產物(RNA、蛋白質或其它物質)的表達的有無或水平、某生化途徑的活力、增殖能力和或動力學行為、分化潛能和或對分化信號的響應或體外培養行為。因此這種顯著特征可以定為一個細胞群或其部分。如本發明所述，術語“干細胞”是指能夠長期自我更新(即不分化而能夠增殖)的祖細胞，處于靜息或增殖，其中干細胞的后代或至少其一部分基本保持了親代干細胞未特化的或者相對較少特化的表型、分化潛能、以及增殖能力。該術語包括能夠基本上無限自我更新的干細胞，即:和親代相比，后代或其部分進一步增殖的能力沒有顯著降低，以及表現出有限的自我更新的干細胞，即:和母細胞相比，后代或其部分進一步增殖的能力顯著降低。基于其產生細胞的類型，所述干細胞或祖細胞可以是多能的、全能的、專能的、或單能的一種或以上的組合。術語“含干細胞的細胞群”在本發明中指含有至少一種干細胞或祖細胞，或者包含部分祖細胞或干細胞的細胞群。通常，所述部分的干細胞或祖細胞可以具有共同表型，也可具有不同表型。如本文所用的，本發明文中術語“嚙齒動物”指大鼠、小鼠等；“哺乳動物”指人類、牛、馬、狗、兔、猴等。如本文所用的，術語“離體”包括離開動物或人類的組織或細胞且在體外保存或增殖，例如保存在培養容器中。術語“活檢”包括采用本領域普遍了解的方法從動物或人類組織或器官中獲得組織。本文中的“正常組織或器官標本”指健康的、未轉化的、非惡性、非癌性或非致瘤的 組織或器官標本。任何病理學家、本領域的技術人員能夠確定組織是否是健康的、未轉化的、非惡性、非癌性或非致瘤的。本發明源于本發明人的深入研究，本發明人驚喜的發現特異凝集素可用于從嚙齒動物、人類或其他哺乳動物正常組織或器官標本、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌組織、轉移瘤/癌組織中識別、純化出成體干細胞、腫瘤干細胞或癌干細胞，進一步可用于從來源于上述組織的原代細胞群、傳代細胞群、建立的細胞系中識別、純化出所述干細胞。本發明的目的在于公開一種采用特異凝集素結合物用于識別、純化干細胞的方法，其中包括，采用特定凝集素結合物用于從嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的樣品中識別、純化成體干細胞、腫瘤干細胞、癌干細胞的方法，其中，所述樣品源自嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的離體、活檢或通過常規手段獲得的任意一種或兩種以上組織中制備的原代細胞群、傳代細胞群、細胞系。本發明的另一目的在于公開一種從含干細胞的細胞群中識別和純化干細胞的試劑盒及其應用方法，其中，所述細胞群源自嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的任意一種或兩種以上組織中制備的原代細胞群、傳代細胞群或建立的細胞系。進一步，所述試劑盒具有使用簡捷、特異性強、實用有效、可工業化生產、應用前景廣泛的優點。本發明公開了一種采用凝集素用于識別、純化干細胞的方法，其包括:
(I)在使所述細胞群與細胞預處理試劑預先接觸條件下，使樣品接觸一種凝集素，后者含有:(a)至少一種凝集素，其可識別糖蛋白和/或糖脂糖鏈末端特異位點，該凝集素與(b)至少一種結合物進行直接或間接連接；和(2)將與所述凝集素結合物結合的細胞群從所述樣品中分離，獲得富含干細胞的樣品，其中，所述細胞上存在與所述凝集素特異親和性的受體表明它們是干細胞。其中，可通過加入洗脫糖的方法把所述凝集素結合物從所述細胞群上洗脫，從而獲得不含任何外來標記的富含干細胞的樣品。其中，細胞預處理過程選擇采用沉淀或裂解法沉淀或裂解細胞群中的紅細胞的試齊U，所述試劑可選擇為質量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細胞裂解液、質量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE, Ficoll的任一一種進行細胞預處理過程，其中，所述試劑至少重復接觸所述細胞群一次。其中，所述凝集素結合物中的凝集素包括天然的或化學合成的植物凝集素、動物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，進一步，所述凝集素的濃度至少為0.001mg/ml,至少為0.5mg/ml,至少為3mg/ml,至少為6mg/ml,至少為12mg/ml,至少為20mg/ml,至少為25mg/ml,至少為30mg/ml,不超過40mg/ml。其中，所述凝集素結合物與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，進一步，接觸時間至少為lmin、至少為lOmin、至少為20min、至少為30min、至少為40min、至少為lhrs、至少為 2hrs。其中，所述凝集素結合物與細胞群的孵育溫度為小于或等于38°C。進一步，至少為2°C、至少為8°C、至少為12°C、至少為16°C、至少為20°C、至少為24°C、至少為28°C、至少為32°C、不超過 38 °C。其中，所述凝集素結合物中的結合物可選擇預先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進行結合，或選擇具有對凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種。其中，所述與凝集素結合的聞分子量的生物大分子的分子量在一萬道爾頓(Mw)至八十萬道爾頓(Mw)之間，其中所述高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。其中，所述含干細胞的細胞群來源于嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的成體組織、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌性組織、轉移瘤/癌組織或其他潛在包含干細胞的一種或兩種以上組織的組合，或選擇來自所述組織的原代、傳代細胞群的一種或兩種以上的組合。本發明還公開采用凝集素用于識別、純化干細胞的試劑盒及其應用方法，其中，所述凝集素還可用于確定組織、細胞群中干細胞存在與含量，其在用于從所述細胞群中富集、提純干細胞的用途。所述用于識別、純化干細胞的試劑盒，其包括:
I)細胞預處理試劑A ；2)識別、純化試劑B;3)以及任選的容器；其中，所述細胞預處理試劑A可選擇為質量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細胞裂解液、質量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；所述細胞預處理試劑或可選擇為泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，其中，所述試劑至少重復接觸所述細胞群一次。其中，識別、純化試劑B為凝集素結合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、動物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，其中所述凝集素結合物中的結合物可選擇預先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進行結合，或選擇具有對凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種，所述凝集素的濃度為
0.001 40mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于 38。。。其中，所述含干細胞的細胞群是嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的正常成體和或病變、腫瘤、癌前、癌性、癌轉移組織，或來自所述組織的原代、傳代細胞群的一種或兩種以上的組合。其中，隨后可選擇采用熒光活化細胞分選法用于鑒定和分選結合凝集素結合化合物的細胞群或選擇沉淀法分離結合凝集素的所述細胞群，進一步，分離的所述干細胞，其包含細胞膜上的可與凝集素結合的受體。`其中，根據本發明方法獲得的純化的干細胞，可進一步通過加入洗脫糖的方法把所述凝集素結合物從所述細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物。其中，本發明所述試劑盒還包括洗脫糖，用于把所述凝集素結合物從所述細胞上洗脫，從而使得所述獲得含干細胞的樣品不帶任何外來標記。其中，所述識別、純化的干細胞包括全能干細胞、多能干細胞、專能干細胞、成體干細胞、腫瘤干細胞、癌干細胞，進一步，其與已知干細胞標志物接觸。其中，所述獲得的干細胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調整干細胞的濃度和體積。其中，根據本發明所述的試劑盒應用方法，其應用方法包括以下步驟:(I)所述細胞樣本與細胞預處理試劑A接觸:如加入紅細胞沉淀劑,選擇取上清；如加入紅細胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細胞沉淀；(2)使經過步驟(I)的所述細胞群與所述識別、純化試劑B接觸，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C ；(3)分離獲得凝集素陽性的細胞群:可選擇采用熒光活化細胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法；(4)加入洗脫糖把所述凝集素結合物從經步驟(3)獲得的所述細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物，進一步，獲得的干細胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調整干細胞的濃度和體積。
其中，本發明所述識別、純化的干細胞為成體干細胞、腫瘤干細胞、癌干細胞，進一步，所述分離干細胞其細胞表面有可與凝集素結合物中的凝集素結合的受體，進一步與已知干細胞標志物接觸，例如Sca-1、Alb、c-Kit、CD90、Nkx2.5分子。其中，本發明還包括采用所述凝集素用于確定樣品中干細胞存在與含量。其中，本發明所述結合凝集素的結合物也可選擇與允許放射性成像、正電子發射斷層掃描、核磁共振成像或X射線或計算機斷層掃描的物質結合。其中，凝集素陽性細胞群的提純(純化)可采用流式細胞儀(與熒光素結合的凝集素)、磁珠篩選(包被了凝集素的磁珠)、吸附柱或其它已知的提純手段獲得，例如，免疫親和提純，結合化合物與固體支持物結合，再比如，淘選，結合化合物與組織培養皿結合。進一步，如果用熒光素標記凝集素，利用流式細胞儀的方法從細胞群中純化目標細胞是優選的，更優選熒光激活細胞分類儀(FACS)分離所述細胞，通過使用該裝置，可以自動分離、回收目標細胞。進一步，根據本發明的方法、試劑盒所識別的干細胞包含至少I個，進一步，根據本發明的方法、試劑盒所提純干細胞的純度至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、至少15%、至少10%、至少5%或至少1%。應當理解，許多凝集素都是本領域已知的信息。術語“凝集素”是指共有結合糖脂或糖蛋白特異性的碳水化合物基團特性的蛋白質組。所述凝集素可以從天然來源純化凝集素，例如從植物、動物、真菌、藻類和細菌，或者選擇修飾的凝集素或其衍生物(天然的或合成的)，或者通過化學合成它。凝集素衍生物包括多-亞單位凝集素中的一個或多個亞單位。在一個優選的實施方案中 ，凝集素可選擇植物凝集素，凝集素可以商業上從許多商業供應商那里獲得，例如Sigma公司。進一步，所述結合凝集素的結合物也可選擇與允許放射性成像、正電子發射斷層掃描、核磁共振成像或X射線或計算機斷層掃描的物質結合。本發明還涉及凝集素結合物在用于從所述細胞群中識別、純化干細胞的用途。本發明的試劑盒的瓶中的凝集素組合物可以是藥學上可接受的溶液的形式，例如與無菌鹽水、PBS緩沖液或其它藥學上可接受的無菌液體組合?；蛘撸梢詢龈苫蚋稍锏哪亟M合物，在此類情況下，試劑盒還任選的包含裝在容器中的藥學上可接受的溶液，例如生理鹽水、PBS緩沖液等，優選無菌的，以溶解所述凍干或干燥凝集素組合物。本發明所述的樣品包括，例如能夠通過將組織或器官標本機械剪切、或破碎成更小的組織塊從而從實體器官中獲得單細胞懸液。任選的，能夠通過諸如化學制劑例如EDTA和或通過使用，膠原酶、分散酶、胰蛋白酶或胰酶制劑的消化特性將獲得的組織小塊進一步分散為單個的細胞。骨髓和或(臍帶)血液、尿液、腦脊液可被視為天然細胞懸液。其中，根據本發明所述的方法、試劑盒可獲得的分離的結合凝集素結合物的干細胞，當需要從凝集素結合物分離干細胞時，能夠通過本領域技術人員所知道的多種方法來進行分離，例如，通過加入洗脫糖，或通過改變PH值或鹽濃度來進行所述干細胞與凝集素結合物的分離。本領域的技術人員應當理解，所述分離的干細胞及其子代也屬于本發明的精神范疇和保護范圍。分離的干細胞，其包含細胞膜上的可與凝集素結合的受體。基于本發明所述的分離的干細胞，可對其進行基因修飾，例如，使所述干細胞與核酸接觸以修飾基因組序列，然后分離其中基因組序列已被修飾的干細胞，之后應用于治療等應用。進一步，任何對基于本發明所獲得的干細胞的修飾、應用，例如通過任何本發明所述的方法獲得的干細胞或干細胞的組合物在制備用于治療受損或患病組織的藥物中的用途，這均屬于本發明的精神范疇和保護范圍。進一步，采用本發明所述識別純化方法、試劑盒所獲得的干細胞群在基礎與應用研究、組織工程、治療、修復受損或病變組織、藥物篩選等中的應用。實施例實施例1、肺干細胞的識別及其純化材料:DAP1、雙花扁豆凝集素DBA購自Sigma，膠原酶(Sigma)、胎牛血清、DMEM/F-12K培養基、血球計數板、氯化銨(IX)。洗滌緩沖液:PBS(pH值為7.4±0.1);封閉緩沖液:在洗滌緩沖液(PBS)中加入3% BSA ;抗原修復液:檸檬酸緩沖液；透膜緩沖液:TBS (0.1% Triton+PBS)。其中，凝集素的結合物選擇為FITC標記。a)新鮮活檢肺組織放入無菌培養皿中，用PBS緩沖液清洗3次，每次3 5min，隨后，用無菌眼科剪剪切組織為小碎塊，轉入盛有膠原酶/胰蛋白酶消化液的50ml離心管中，在37°C, IOOrpm消化45min 60min,隨后加入4°C預冷的含10%胎牛血清(Fetal bovineserum, FBS)的DMEM/F12K培養基終止反應，再用一次性注射器將經消化的組織塊吹打成單細胞懸液，之后，在4°C，以200g離心3 5min，棄上清后加入4°C預冷的含2% FBS的PBS，輕輕混勻，經180目篩網過濾入另一個50ml離心管中，加入NH4C1裂解液后混勻，室溫放置3 5min，在4°C，以200g離心3 5min，棄上清后加入Iml 4°C預冷含2% FBS的PBS混勻，用血球計數儀計數細胞數量，細胞被等分為兩份，一份加入F-DBA，其中凝集素的濃度為5mg/ml，一份加入等體積過量的同型對照(圖1.A)，兩份細胞均在37°C避光孵育30 60min，之后，在4°C，以200g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預冷的含2% FBS的PBS重懸細胞，流式細胞儀分選F-DBA+細胞群(圖1.B)，純化的干細胞純度為94% (圖1.C)。在分析前，添加碘化丙碇(PD來排除分析中的死細胞。結果:采用本發明的方法能夠識別肺組織中的干細胞并進一步可對其進行純化(圖1)，可進一步加入N-乙酰胺半乳糖胺把所述凝集素結合物從所述細胞群中洗脫，從而獲得不帶任何外來標記的細胞樣品，并進一步，加入生理鹽水調節所述樣品中干細胞的濃度和體積。實施例2、骨髓、臍帶血干細胞的識別及其純化分別制備骨髓、臍帶血。材料:同實施例1,其中右旋糖酐(Sigma)、HP、UEA購自Vector,凝集素的結合物為牛血清白蛋白(BSA)。方法:a):加入6 15%質量濃度的右旋糖酐于骨髓細胞懸液中，接觸細胞的時間為30min從而沉淀紅細胞，隨后吸取上清在4°C，以230g離心3 5min，棄上清后加入4°C預冷的含2% FBS的PBS，輕輕混勻，經200目篩網過濾入另一個離心管中用血球計數儀計數細胞數量，胎盤藍染色細胞存活率98%，隨加入BSA結合的凝集素HP，其中，凝集素的濃度為1.2mg/ml，在35°C條件下接 觸60min后，吸取下層細胞沉淀，分選的細胞群可進一步用洗脫糖N-乙酰半乳糖胺把凝集素結合物從細胞膜上洗脫下來，在4°C，以230g離心2 3min，棄上清后加入4°C預冷含1% FBS的PBS混勻。隨后，在4°C，以230g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預冷的含I % FBS的PBS重懸細胞，從而獲得不含任何外來標記的細胞群，進一步可加入PBS緩沖液調節干細胞的濃度和體積。采用流式細胞儀鑒定分析所述細胞群的數量及純度，結果表明陽性細胞的百分比為2.6% (圖2.A)，識別、純化的干細胞純度為95.7% (圖2.B)。在分析前，添加碘化丙碇(PI)來排除分析中的死細胞。b)加入6 15%質量濃度的右旋糖酐于臍帶血細胞懸液中，接觸細胞的時間為40min從而沉淀紅細胞，隨后吸取上清在4°C，以220g離心3 5min，棄上清后加入4°C預冷的含2% FBS的PBS，輕輕混勻，經160目篩網過濾入另一個離心管中用血球計數儀計數細胞數量，胎盤藍染色細胞存活率98%，離心丟棄上清后加入BSA結合的凝集素UEA，其中，凝集素的濃度為2.lmg/ml，在37°C條件下接觸45min后，吸取下層細胞沉淀，識別、純化的細胞群可進一步用洗脫糖海藻糖把凝集素結合物從細胞膜上洗脫下來，在4°C，以220g離心2 3min，棄上清后加入4°C預冷含I % FBS的PBS混勻。隨后，在4°C，以220g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預冷的含1% FBS的PBS重懸細胞，從而獲得不含任何外來標記的細胞群，進一步可加·入生理鹽水調節干細胞的濃度和體積。采用流式細胞儀鑒定分析陽性細胞群的數量，結果表明陽性細胞數量為3.5% (圖2.C)，識別、純化的干細胞純度為96.8% (圖2.D)。在分析前，添加碘化丙碇(PI)來排除分析中的死細胞。結果:采用本發明所述方法能夠從骨髓、臍帶血中識別、純化出干細胞(圖2)。實施例3、肝癌組織中肝癌干細胞的識別及其純化組織制備:制備了來自成體動物的肝癌組織，組織經PBS緩沖液清洗，清洗3次，每次3 5min。材料:同實施例1，其中TRITC標記的SJ凝集素(T-SJ)購自Sigma。方法:a)無菌條件下獲得新鮮肝癌組織轉入無菌培養皿中后，用無菌眼科剪剪切組織為小碎塊，再轉入盛有膠原酶/胰蛋白酶份散酶消化液的50ml離心管中，在37°C，IOOrpm消化45min 60min后，加入4°C預冷的含 10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12K培養基終止反應，再用一次性注射器將經消化的組織塊吹打成單細胞懸液，之后，在40C，以180g離心3 5_，棄上清后加入4°C預冷的含2% FBS的PBS，輕輕混勻，經200目篩網過濾入另一個50ml離心管中，加入0.2%氯化鈉裂解紅細胞，作用時間為30second Imm,再加入1.6%氯化鈉恢復溶液至等滲,之后在4°C,以180g離心3 5min,棄上清后加入4°C預冷含2% FBS的PBS混勻，用血球計數儀計數細胞數量，細胞被等分為兩份，一份加入T-SJ，凝集素濃度為0.03mg/ml，一份加入等體積過量的同型對照，兩份細胞均在4°C條件下避光孵育100mm，之后，在4°C，以180g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預冷的含2% FBS的PBS重懸細胞，流式細胞儀分選T-SJ+細胞群，純化的干細胞純度為85%。在分析前，添加碘化丙碇(PI)來排除分析中的死細胞。b) 4%多聚甲醛溶液固定細胞30 40mim，室溫放置40min 60min后，再依次經抗原修復(55°C 75°C,30min 80min)、室溫冷卻(30min 60min)后加入透膜緩沖液與固定細胞孵育，孵育時間為20 40min，之后加入BSA封閉(室溫，30min 60min)，PBS洗去剩余未結合BSA之后，用抗CD90抗體與固定細胞進行孵育，4°C過夜孵育，再用PBS洗去未結合抗體，之后加入FITC- 二抗及DAPI，室溫孵育30min 120min后，再用PBS洗去未結合抗體及DAPI，室溫干燥后封片。激光共聚焦顯微鏡檢測，檢測到陽性細胞的數量為一個以上。結果:采用本發明的方法能夠從肝癌組織中識別干細胞并進一步可對其進行純化(圖 3)。實施例4、識別、純化肝干細胞和肺干細胞的試劑盒及其應用方法所述試劑盒包括:I)細胞預處理試劑A:氯化銨(IX);2)識別、純化試劑B:明膠結合的PT和RC ；3)容器:用于盛放I)、2)兩種溶液的圓形試劑瓶；所述試劑盒還包括洗脫糖N-乙酰葡糖胺、半乳糖試劑。其他實驗材料:同實施例1。應用方法:a)加入等體積的NH4C1裂解液(溶液A)與細胞群混勻，室溫放置2 3min，在40C，以200g離心3 5min，棄上清后加入Iml 4°C預冷含2% FBS的PBS重懸細胞沉淀，之后用血球計數儀計數細胞數量，細胞被等分為兩份，一份加入明膠結合的凝集素，其中凝集素的濃度為4.8mg/ml，在37°C條件下靜置30 45`min，之后，取下層細胞沉淀，識別、純化的細胞群可進一步用N-乙酰葡糖胺、半乳糖兩種洗脫糖把凝集素結合物從細胞膜上洗脫下來，在4°C，以220g離心2 3min，棄上清后加入4°C預冷含1% FBS的PBS混勻。隨后，在4°C，以220g離心3 5min后，丟棄上清，加入4°C預冷的含I % FBS的PBS重懸細胞，從而獲得不含任何外來標記的細胞群，進一步可加入生理鹽水調節干細胞的濃度和體積。采用流式細胞儀鑒定分析陽性細胞群的數量，結果表明陽性細胞數量分別為2.6% (圖4.B)、4.3% (圖4.8’)，純化的肝干細胞和肺干細胞純度分別為80%、89%。在分析前，添加碘化丙碇(PD來排除分析中的死細胞。b) 4%多聚甲醛溶液固定細胞15 30mim，室溫放置30min 60min后，再依次經抗原修復(55°C 75°C,30min 80min)、室溫冷卻(30min 60min)后加入透膜緩沖液與固定細胞孵育，孵育時間為20 40min，之后加入BSA封閉(室溫，30min 60min)，PBS洗去剩余未結合BSA之后，用抗-Alb抗體、抗-c-Kit抗體分別與固定含肝干細胞、肺干細胞的載玻片進行孵育，4°C孵育過夜后，再用PBS洗去未結合抗體，含肝干細胞的載玻片加入對應的凝集素、TRITC- 二抗及DAPI，含肺干細胞的載玻片加入對應的凝集素、FITC- 二抗及DAPI，均在室溫孵育30min 120min后，再用PBS洗去未結合抗體及DAPI，室溫干燥后封片。激光共聚焦顯微鏡檢測，檢測到陽性細胞的數量為一個以上。結果:采用本發明試劑盒能夠從混合細胞群中識別肝干細胞和肺干細胞并進一步可對其進行純化(圖4)。實施例5、識別、純化心臟干細胞的試劑盒及其應用方法所述試劑盒包括:I)細胞預處理試劑A:0.2%氯化鈉；2)識別、純化試劑B =FITC-SJ凝集素；3)容器:用于盛放I)、2)兩種溶液的方形試劑瓶；
所述試劑盒還包括洗脫糖N-乙酰葡糖胺試劑。其他實驗材料:同實施例1。應用方法:a)加入0.2%氯化鈉(溶液A)與細胞群混勻，室溫放置30second Imin后加入
1.6%氯化鈉恢復溶液至等滲,在4°C,以200g離心3 5min,棄上清后加入Iml 4°C預冷含2% FBS的PBS重懸細胞沉淀，之后用血球計數儀計數細胞數量，細胞被等分為兩份，一份加入凝集素，其中，凝集素的濃度為7.6mg/ml，一份加入等體積的過量同型對照，兩份細胞在16°C條件下均避光孵育45 60min，之后，在4°C，以200g離心3 5mm后，丟棄上清，加入4°C預冷的PBS重懸細胞，流式細胞儀分選凝集素陽性細胞群，純化的干細胞純度為89%。在分析前，添加碘化丙碇(PD來排除分析中的死細胞。收集所述干細胞進一步加入洗脫糖N-Z酰葡糖胺把所述凝集素結合物從所述細胞群中洗脫，從而獲得不帶任何外來標記的細胞樣品，其中，可進一步加入生理鹽水以調節樣品的體積和濃度。b) 4%多聚甲醛溶液固定細胞15 30mim，室溫放置30min 60min后，再依次經抗原修復(55°C 75°C,30min 80min)、室溫冷卻(30min 60min)后加入透膜緩沖液與固定細胞孵育，孵育時間為30 60min，之后BSA封閉(室溫，30min 60min)，PBS洗去剩余未結合BSA之后，用抗Nkx2.5抗體與固定細胞進行孵育，4°C孵育過夜，再用PBS洗去未結合的抗體，再加入TRITC- 二抗及DAPI室溫孵育60min 120min后，再用PBS洗去未結合抗體及DAPI，室溫干燥后封片。激光共聚焦顯微鏡檢測，檢測到陽性細胞的數量為一個以上。結果:采用本發明所述試劑盒能夠從混合細胞群中識別心臟干細胞并進一步可對其進行純化(圖5)。工業實用性 如上所述，依照本發明的方法、試劑盒，可以用一種簡單、快速且經濟的方法，一方面準確且有效地識別出成體干細胞，另一方面可以高同收率地純化成體干細胞，而由此得到的含細胞液體無需隨后繁瑣的細胞懸液制備過程，可直接進行深低溫保藏，且所述含干細胞的樣品可不帶任何外來標記，以便其用于基礎研究和醫療應用相關的產業，如干細胞自我更新機理及相關技術研究、干細胞用于治療、修復受損或病變組織、干細胞移植技術領域、免疫治療領域以及藥物篩選等。
權利要求
1.集素用于識別、純化干細胞的方法，其特征在于，其包括: (1)在使所述細胞群與細胞預處理試劑預先接觸條件下，使樣品接觸一種凝集素，后者含有:(a)至少一種凝集素，其可識別糖蛋白和/或糖脂糖鏈末端特異位點，該凝集素與(b)至少一種結合物進行直接或間接連接；和 (2)將與所述凝集素結合物結合的細胞群從所述樣品中分離，獲得富含干細胞的樣品，其中，所述細胞上存在與所述凝集素特異親和性的受體表明它們是干細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，可通過加入洗脫糖的方法把凝集素結合物從所述細胞群上洗脫，從而獲得不含任何外來標記的富含干細胞的樣品。
3.胞預處理過程選擇采用沉淀或裂解法沉淀或裂解細胞群中的紅細胞的試劑，所述試劑可選擇為質量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細胞裂解液、質量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種進行細胞預處理，其中，所述試劑至少重復接觸所述細胞群一次。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝集素結合物中的凝集素包括天然的或化學合成的植物凝集素、動物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，所述凝集素的濃度為0.001 40mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C。
5.根據權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述凝集素結合物中的結合物可選擇預先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進行結合，或選擇具有對凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述與凝集素結合的高分子量的生物大分子的分子量在一萬道爾頓(Mw)至八十萬道爾頓(Mw)之間，其中所述高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述含干細胞的細胞群來源于嚙齒動物、人類或其他哺乳動物的成體組織、腫瘤/癌前組織、腫瘤/癌性組織、轉移瘤/癌組織或其他潛在包含干細胞的一種或兩種以上組織的組合，或選擇來自所述組織的原代、傳代細胞群的一種或兩種以上的組合。
8.集素用于識別、純化干細胞的試劑盒及其應用方法，其中，所述凝集素還可用于確定組織、細胞群中干細胞存在與含量，其在用于從所述細胞群中富集、提純干細胞的用途。
9.根據權利要求8所述的用于識別、純化干細胞的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括: 1)細胞預處理試劑A； 2)識別、純化試劑B； 3)以及任選的容器； 其中，所述細胞預處理試劑A可選擇為質量濃度為01 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；或可選擇為氯化銨紅細胞裂解液、質量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；細胞預處理試劑或可選擇為泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，其中，所述試劑至少重復接觸所述細胞群一次。
其中，識別、純化試劑B為凝集素結合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、動物凝集素或其衍生物的一種或兩種以上的組合，其中所述凝集素結合物中的結合物可選擇預先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進行結合，或選擇具有對凝集素有親和力抗體或抗體衍生物或抗體片段的一種，所述凝集素的濃度為·0.0Ol 40mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于 38。。。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述含干細胞的細胞群是嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的正常成體和或病變、腫瘤、癌前、癌性、癌轉移組織，或來自所述組織的原代、傳代細胞群的一種或兩種以上的組合。
11.根據權利要求1或9中任一權利要求所述，其中，隨后可選擇采用熒光活化細胞分選法用于鑒定和分選結合凝集素結合化合物的細胞群或選擇沉淀法分離結合凝集素的所述細胞群，進一步，分離的所述干細胞，其包含細胞膜上的可與凝集素結合的受體。
12.根據權利要求1或9中任一權利要求的方法、試劑盒獲得的純化的干細胞，其特征在于，通過加入洗脫糖的方法把所述凝集素結合物從所述細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何外來標記物。
13.根據權利要求1、10、11或12中任一權利要求所述，其中所述識別、純化的干細胞包括全能干細胞、多能干細胞、專能干細胞、成體干細胞、腫瘤干細胞、癌干細胞，進一步，其與已知干細胞標志物接觸。
14.根據權利要求1或9任一權利要求所述，獲得的干細胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以 調整干細胞的濃度和體積。
15.根據權利要求8所述的試劑盒應用方法，其特征在于，其應用方法包括以下步驟: (1)所述細胞樣本與細胞預處理試劑A接觸:如加入紅細胞沉淀劑，選擇取上清；如力口入紅細胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細胞沉淀； (2)使經過步驟(I)的所述細胞群與所述識別、純化試劑B接觸，所述凝集素的濃度為·0.001 40mg/ml，與所述細胞群接觸的時間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于 38 0C ； (3)分離獲得凝集素陽性的細胞群:可選擇采用熒光活化細胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法； (4)加入洗脫糖把所述凝集素結合物從經步驟(3)獲得的所述細胞上洗脫，從而使得獲得的干細胞不帶任何 外來標記物，進一步，獲得的干細胞還可加入生理鹽水、PBS緩沖液、HBSS緩沖液以調整干細胞的濃度和體積。
全文摘要
本發明屬于生物技術、干細胞、腫瘤學領域，公開了一種識別、純化干細胞的方法、試劑盒及其應用方法，更具體而言，本發明涉及采用新的標志物用于從嚙齒動物、人類或其他哺乳動物來源的樣品中識別、純化干細胞的方法、及相應的識別、純化干細胞的試劑盒及其用途，本發明所公開的方法及試劑盒可有效且精準的用于從所述源自人類或其他哺乳動物的細胞群中識別、純化出干細胞，進一步，所述純化后含干細胞的樣品可不帶任何外來標記，以便于基礎研究和醫療應用，同時可通過加入常規緩沖液用于調節其濃度和體積。本發明所述的試劑盒具有使用簡捷、經濟、可工業化生產、實用有效的優點。本發明還涉及獲得的干細胞及它們在諸如研究或治療中的廣泛用途。
文檔編號C12N5/071GK103087980SQ20121044011
公開日2013年5月8日 申請日期2012年10月26日 優先權日2011年10月28日
發明者李福生, 盧磊磊, 盧淼淼, 盧晶晶 申請人:盧磊磊, 李福生