專利名稱：從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于從造血器官、血液標(biāo)本中獲得干細(xì)胞的細(xì)胞處理試劑盒及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
成體干細(xì)胞是另外一類具有修復(fù)、再生、替代能力的未分化細(xì)胞類型，通常位于特定的小生境內(nèi)，在受到外界損傷后，其會(huì)動(dòng)員或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，通過增殖、分化的方式形成新的功能細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)組織和器官細(xì)胞數(shù)量保持動(dòng)態(tài)平衡。成體干細(xì)胞的多能性特點(diǎn)首先在骨髓中得到的成體干細(xì)胞得以發(fā)現(xiàn)。造血干細(xì)胞是目前研究的最為詳盡的成體干細(xì)胞之一，在過去近40年里一直是干細(xì)胞領(lǐng)域研究的主題，它們?cè)隗w內(nèi)進(jìn)行自我更新的細(xì)胞分裂，在單細(xì)胞水平分化為所有的造血成份，并在機(jī)能上使得重度骨髓抑制的動(dòng)物和人的骨髓得以恢復(fù)。目前，人們的研究發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞主要來自于骨髓、臍帶血、外周血、經(jīng)血，造血干細(xì)胞已被用于移植治療多種血液病、糖尿病及并發(fā)癥、某些惡性實(shí)體腫瘤、免疫缺陷等疾病的有效措施之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用方面已證明造血干細(xì)胞移植對(duì)重建或改善骨髓造血功能有較好療效。干細(xì)胞在臍帶血的比例相對(duì)比較高，約1.5%左右，骨髓中的比例非常低，約0.1 0.5%，而造血干細(xì)胞在外周血中的比例更低，研究者采用多個(gè)分子表面標(biāo)志，如使用Thy-Ι1 或FLK2_Lineage_Sca-l+c_Kit+可用于分選出造血干細(xì)胞群(ChristemsenJL 等，PNAS,2001.98:14541-14546 ;Uchida N 等，Experimental hematology,1996.24:649-659)，用⑶14+免疫磁性分離的方法從外周血篩選新的干細(xì)胞群(PCT/055950干細(xì)胞的提純、識(shí)別及用途)；采用⑶34、⑶133作為造血干細(xì)胞的標(biāo)志物用于識(shí)別及分選造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞(Civin 等，J Tmmunol 1984 ; 133:157-165 ;Kobari L 等，J HematotherStem Cell Res.2001 ; 10:273-281)。又有研究者發(fā)現(xiàn)分化程度較低的干/祖細(xì)胞通常表達(dá)一些ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette，ABC)，細(xì)胞常利用ATP能量把外來的有毒物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)排出，以達(dá)到保護(hù)自身的目的，被稱為側(cè)群篩選法(side population,SP) ο 早期 Goodell 等(Goodell 等，J Exp Med, 1996.183 (4): 1796-1806)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用H0echst33342對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色后，造血干細(xì)胞具有很強(qiáng)的排出染液的能力。然而，最近的證據(jù)表明，⑶34在細(xì)胞膜上的表達(dá)不總是與干細(xì)胞活性相關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)在人中獲得的干細(xì)胞缺乏CD34表達(dá)，但具有完全的重建能力的高度靜止的干細(xì)胞群體(Dao等，Leukemia 2000 ；14:773-776)，進(jìn)一步顯示，與缺乏這些表型標(biāo)志物的成體骨髓和臍帶血來源的干細(xì)胞相比，造血祖細(xì)胞的多能分化潛能有限(Jiang YY等，Nat CellBiol.2004 ；6:532-539),而側(cè)群篩選法雖然有其價(jià)值，但不足之處是，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性比較差，當(dāng)從實(shí)體組織中篩選出SP細(xì)胞后，由于獲得活細(xì)胞的能力有限，當(dāng)此類細(xì)胞進(jìn)行移植后可能影響他們的重塑能力。

因此，人們一直關(guān)注發(fā)現(xiàn)其他方法，以替代或補(bǔ)充現(xiàn)有的分離富集干細(xì)胞和原始祖細(xì)胞的群體。
如申請(qǐng)?zhí)枮镃N200610114475.9的中國(guó)專利，提供了一種用于分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞的試劑盒，雖然該試劑盒使用方便，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)在于:分離的干細(xì)胞其數(shù)量極少不足以臨床有效治療使用。申請(qǐng)?zhí)枮镃N200610106875.5的中國(guó)專利，提供了一種有核細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法及申請(qǐng)?zhí)枮?00810089682.2的中國(guó)專利，提供了一種分離單個(gè)核細(xì)胞的方法和裝置，但經(jīng)此分離后的細(xì)胞絕大多數(shù)為淋巴細(xì)胞，這樣導(dǎo)致細(xì)胞中實(shí)際能用于治療的干細(xì)胞占少數(shù)，極大的影響臨床療效，增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。再如申請(qǐng)?zhí)枮镃N200710137781.9的中國(guó)專利，提供了一種骨髓臍帶血干細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法，其缺點(diǎn)在于使用雞尾酒Iin抗體，導(dǎo)致成本大幅度增加，一方面增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，使其難于接受細(xì)胞治療，且Iin抗體給隨后的細(xì)胞洗滌帶來了困難，很難確定其治療后在人體內(nèi)發(fā)生的變化。上述分離方法得到包括所有譜系和階段的造血干和祖細(xì)胞和一些晚期前體細(xì)胞的干和祖細(xì)胞的混合細(xì)胞群體，我們定義為“一鍋粥”分選法，且干細(xì)胞的有效數(shù)量很低，這是不利的，因?yàn)橐扬@示僅分離CD34+細(xì)胞群體中最原始的細(xì)胞是有價(jià)值的(AskenasyN.等，Current Stem Cell Research and Therapy2006 ；1:85-94)。另外一個(gè)不足方面在于缺少可靠的特異性分子標(biāo)記物對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。這些分離的細(xì)胞群并不是同質(zhì)類型的，而是由許多不同分化狀態(tài)或增殖能力的混合細(xì)胞群組成，非常不純。有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的缺點(diǎn)，為了克服上述方法上的不足及提供進(jìn)一步相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明所提 供的一種用于從嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物來源的造血器官、血液標(biāo)本中獲得干細(xì)胞的細(xì)胞處理試劑盒及其應(yīng)用方法，具有使用方便、易操作、可工業(yè)化生產(chǎn)、實(shí)用有效的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣泛。本發(fā)明提供一種用于從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，包括盒體、試劑及使用說明書，其中，所述試劑盒(I)包括細(xì)胞前處理試劑A、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B、細(xì)胞正向選擇試劑C，分別盛放于細(xì)胞前處理試劑瓶(2)、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)、細(xì)胞正向選擇試劑瓶(4)內(nèi)，所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中包含的試劑為化療藥物，細(xì)胞正向選擇試劑瓶(4)中包含的試劑為凝集素結(jié)合物。其中，所述細(xì)胞前處理試劑瓶(2)包含的試劑為紅細(xì)胞沉淀劑或紅細(xì)胞裂解液；紅細(xì)胞沉淀劑為質(zhì)量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；紅細(xì)胞裂解液可選擇為氯化銨紅細(xì)胞裂解液、質(zhì)量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；細(xì)胞前處理試劑A或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，所述細(xì)胞前處理試劑A作用細(xì)胞的次數(shù)至少為一次。其中，細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中的化療藥物可選擇為包括抗生素化療藥物、抗代謝化療藥物、烷化劑化療藥物、激素及內(nèi)分泌化療藥物、植物化療藥物、亞硝脲類化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、甲基芐肼、草酸鉬、鉬類、丙亞胺、羥基脲和氨烯咪胺的一種或兩種以上的組合。其中，所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中試劑接觸細(xì)胞的時(shí)間為小于或等于120小時(shí)。
其中，細(xì)胞正向選擇試劑瓶(4)中所述凝集素可選擇為天然的或人工合成的植物凝集素、動(dòng)物凝集素及其衍生物的一種或兩種以上的組合，進(jìn)一步，所述凝集素的濃度為
0.001 30mg/ml。其中，所述細(xì)胞正向選擇試劑瓶中所述凝集素的結(jié)合物可選擇預(yù)先與熒光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進(jìn)行結(jié)合，形成凝集素結(jié)合物。其中，所述熒光染料可選擇為異硫氰酸熒光素(FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、藻紅蛋白(PE)、Cy系列花菁染料、ef 1ur系列、FL系列、Alexa Flour系列、Alexa、多甲藻黃素葉綠素蛋白(PerCP)及別藻青蛋白(APC)系列的任一一種。其中，所述與凝集素結(jié)合的聞分子量的生物大分子的分子量在10000道爾頓(Mw)以上。其中，所述高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。其中，所述細(xì)胞正向選擇試劑瓶中試劑接觸細(xì)胞的時(shí)間小于或等于120分鐘，與細(xì)胞孵育的溫度選擇為小于或等于38°C。本發(fā)明還提供一種試劑盒的應(yīng)用方法，其包括以下步驟:(a)所述細(xì)胞樣本與細(xì)胞前處理試劑A接觸:如加入紅細(xì)胞沉淀劑，選擇取上清；如加入紅細(xì)胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細(xì)胞沉淀；
`
(b)使經(jīng)過步驟(a)的所述細(xì)胞群與所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B接觸，接觸時(shí)間小于或等于120小時(shí)；(C)將步驟(b)所得的液體離心，丟棄上清取下層細(xì)胞沉淀，之后，用常規(guī)緩沖液洗滌細(xì)胞；(d)重復(fù)步驟(C)兩到三次；(e)使經(jīng)過步驟(d)的所述細(xì)胞群與所述細(xì)胞正向選擇試劑C接觸，所述凝集素的濃度為0.001 30mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于38°C ；(f)分離獲得凝集素陽(yáng)性的細(xì)胞群:可選擇采用熒光活化細(xì)胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法；其中，根據(jù)本發(fā)明的方法或試劑盒獲得的所述細(xì)胞群隨后加入盛放于細(xì)胞洗滌試劑瓶(5)內(nèi)的洗脫糖細(xì)胞洗滌劑D用于把所述凝集素結(jié)合物從所述獲得的細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來標(biāo)記物。其中，所述細(xì)胞來源于嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物的造血器官、血液標(biāo)本，進(jìn)一步，所述造血器官、血液選自嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物的骨髓、脾臟、胸腺、胎肝、夕卜周血、臍帶血、卵黃囊、胸腺、淋巴結(jié)、胸膜及其滲出液樣品。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的試劑收集獲得的干細(xì)胞作為基礎(chǔ)、臨床與應(yīng)用研究、組織工程、治療、藥物篩選、修復(fù)失去功能的病變組織或器官中的應(yīng)用。


圖1用于從造血器官、血液標(biāo)本中獲得干細(xì)胞的細(xì)胞處理試劑盒組成該圖表明了從造血器官、血液標(biāo)本中獲得干細(xì)胞的細(xì)胞處理試劑盒的組成，它由試劑瓶、試劑、盒體組成。所述試劑盒(I)包括細(xì)胞前處理試劑A、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B、細(xì)胞正向選擇試劑C，分別盛放于細(xì)胞前處理試劑瓶(2)、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)、細(xì)胞正向選擇試劑瓶(4)內(nèi)，所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中包含的試劑為化療藥物，細(xì)胞正向選擇試劑瓶(4)中包含的試劑為凝集素結(jié)合物。進(jìn)一步，試劑盒還可包括洗脫糖細(xì)胞洗滌試劑D，盛放于細(xì)胞洗滌試劑瓶(5)內(nèi)。試劑瓶的封閉蓋分別為(6)、(7)、(8)、(9)，可選擇為壓力、螺絲或其他。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明的用于從骨髓標(biāo)本中獲得干細(xì)胞的細(xì)胞處理試劑盒，它由試劑瓶、試劑、盒體組成。所述試劑盒(I)包括細(xì)胞前處理試劑A、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B、細(xì)胞正向選擇試劑C，所述細(xì)胞前處理試劑A為質(zhì)量濃度為I 6%的明膠，細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B為氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡鉬，細(xì)胞正向選擇試劑C為植物凝集素及其結(jié)合物，分別盛放于細(xì)胞前處理試劑瓶(2)、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)、細(xì)胞正向選擇試劑(4)內(nèi)，進(jìn)一步，所述凝集素為雙花扁豆凝集素(DBA)和花生凝集素(PNA)，所述結(jié)合物為牛血清白蛋白(BSA)。其中，所述試劑盒(I)還可包括洗脫糖細(xì)胞洗滌試劑D，盛放于細(xì)胞洗滌試劑瓶(5)內(nèi)，所述洗脫糖為N-乙酰半乳糖胺、半乳糖。進(jìn)一步，所述試劑瓶的封閉蓋(6)、(7)選擇為壓力，試劑瓶的封閉蓋⑶和(9)選擇為螺絲。其中，細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中化療藥物接觸骨髓細(xì)胞的時(shí)間為96小時(shí)。其中，所述細(xì)胞 正向選擇試劑瓶(4)中所述凝集素的濃度為5mg/ml。進(jìn)一步，與所述細(xì)胞接觸的時(shí)間為20分鐘，孵育的溫度為37°C。進(jìn)一步，吸取下層沉淀的細(xì)胞群，所述細(xì)胞再用生理鹽水進(jìn)行洗滌。之后，加入細(xì)胞洗滌試劑瓶(5)中的試劑D，孵育30分鐘后，4°C條件下離心丟棄上清，再用生理鹽水進(jìn)行重懸。所述獲得的細(xì)胞群不含任何外來標(biāo)記。進(jìn)一步，所述細(xì)胞群隨后加入半乳糖、N-乙酰半乳糖胺兩種洗脫糖細(xì)胞洗滌劑D用于把所述凝集素結(jié)合物從所述獲得的細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的造血干細(xì)胞不帶任何外來標(biāo)記物。 進(jìn)一步，所述試劑盒可作用的對(duì)象為嚙齒動(dòng)物、人或其他哺乳動(dòng)物的骨髓細(xì)胞群。其中，所述使用說明書用于說明從骨髓中收集獲得干細(xì)胞的使用方法。其中，整個(gè)操作過程保持在無菌工作環(huán)境中進(jìn)行操作，其中，內(nèi)毒素檢測(cè)含量(0.5EU/mL表示試劑盒合格。實(shí)施例2本發(fā)明的用于從臍帶血標(biāo)本中獲得干細(xì)胞的細(xì)胞處理試劑盒，它由試劑瓶、試劑、盒體組成。所述試劑盒(I)包括細(xì)胞前處理試劑A、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B、細(xì)胞正向選擇試劑C，所述細(xì)胞前處理試劑A為質(zhì)量濃度為4 8%的羥乙基淀粉，細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B為氟尿嘧啶、紫杉醇、卡鉬，細(xì)胞正向選擇試劑C為植物凝集素及其結(jié)合物，分別盛放于細(xì)胞前處理試劑瓶(2)、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)、細(xì)胞正向選擇試劑(4)內(nèi)，進(jìn)一步，所述凝集素為大豆凝集素(SBA)和荊豆凝集素(UEA)，所述結(jié)合物為熒光染料TRITC。進(jìn)一步，所述試劑瓶的封閉蓋(6)和(7)選擇為壓力，試劑瓶的封閉蓋⑶、(9)選擇為螺絲。其中，細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中化療藥物接觸臍帶血細(xì)胞的時(shí)間為36小時(shí)。其中，所述細(xì)胞正向選擇試劑瓶⑷中所述凝集素的濃度為0.95mg/ml。進(jìn)一步，與所述細(xì)胞作用的時(shí)間為90分鐘,孵育的溫度為4°C。其中，所述細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌。進(jìn)一步，所述細(xì)胞洗滌后離心丟棄上清后用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，之后，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。進(jìn)一步，所述細(xì)胞群隨后加入半乳糖、海藻糖兩種洗脫糖細(xì)胞洗滌劑D用于把所述凝集素結(jié)合物從所述獲得的細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來標(biāo)記物。進(jìn)一步，所述試劑盒作用的對(duì)象為人源臍帶血細(xì)胞群。其中，所述使用說明書用于說明從臍帶血中收集獲得干細(xì)胞的使用方法。其中，整個(gè)操作過程保持在無菌工作環(huán)境中進(jìn)行操作，其中，內(nèi)毒素檢測(cè)含量(0.5EU/mL表示試劑盒合格。實(shí)施例3本發(fā)明的用于從脾臟標(biāo)本中獲得造血干細(xì)胞的細(xì)胞處理試劑盒，它由試劑瓶、試齊U、盒體組成。所述試劑盒(I)包括細(xì)胞前處理試劑A、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B、細(xì)胞正向選擇試劑C，所述細(xì)胞前處理試劑A為質(zhì)量濃度為3 12%的聚乙烯吡咯烷酮，細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B為氮芥、門冬酰胺酶、甲基芐肼，細(xì)胞正向選擇試劑C為植物凝集素及其結(jié)合物，分別盛放于細(xì)胞前處理試劑瓶(2)、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)、細(xì)胞正向選擇試劑(4)內(nèi)，進(jìn)一步，所述凝集素為荊豆凝集素(UEA)，所述結(jié)合物為熒光染料為磁珠。進(jìn)一步，所述試劑瓶的封閉蓋(7)、(9)選擇為壓力，試劑瓶的封閉蓋(6)和⑶選擇為螺絲。其中，細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中化療藥物接觸脾臟細(xì)胞的時(shí)間為12小時(shí)。其中，所述細(xì)胞正向選擇試劑瓶⑷中所述凝集素的濃度為12mg/ml。進(jìn)一步，與所述細(xì)胞接觸的時(shí)間為45分鐘，孵育的溫度為4°C。其中，所述細(xì)胞用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌。進(jìn)一步,所述細(xì)胞洗漆后離心丟棄上清后用PBS緩沖液重懸細(xì)胞,之后,通過專用磁柱進(jìn)行分選。進(jìn)一步，所述細(xì)胞群 隨后加入海藻糖這種洗脫糖細(xì)胞洗滌劑D用于把所述凝集素結(jié)合物從所述獲得的細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來標(biāo)記物。進(jìn)一步，所述試劑盒作用的對(duì)象為人類、嚙齒動(dòng)物或其他哺乳動(dòng)物的脾臟細(xì)胞群。其中，所述使用說明書用于說明從脾臟中收集獲得干細(xì)胞的使用方法。其中，整個(gè)操作過程保持在無菌工作環(huán)境中進(jìn)行操作，其中，內(nèi)毒素檢測(cè)含量(0.5EU/mL表示試劑盒合格。實(shí)施例4
本發(fā)明所述的試劑盒的應(yīng)用方法，具體步驟如下:(a)所述骨髓細(xì)胞樣本與細(xì)胞前處理試劑A接觸:細(xì)胞前處理試劑A為質(zhì)量濃度為I 6%的明膠,之后吸取上清；(b)使經(jīng)過步驟(a)的所述細(xì)胞群與所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B接觸:其中，所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B為氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡鉬，接觸所述細(xì)胞的時(shí)間為96小時(shí)；(c)將步驟(b)所得的液體離心，丟棄上清取下層細(xì)胞沉淀，之后，用生理鹽水洗滌細(xì)胞；(d)重復(fù)步驟(C)兩到三次；(e)使經(jīng)過步驟(d)的所述細(xì)胞群與所述細(xì)胞正向選擇試劑C接觸:所述試劑為雙花扁豆凝集素(DBA)和花生凝集素(PNA)，所述結(jié)合物為牛血清白蛋白(BSA)，所述凝集素的濃度為5mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為20分鐘，孵育溫度為37°C ；(f)分離獲得凝集素陽(yáng)性的細(xì)胞群:選擇采用靜置沉淀法；最后，加入半乳糖、N-乙酰半乳糖胺兩種洗脫糖細(xì)胞洗滌劑D把所述凝集素結(jié)合物從所述獲得的細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來標(biāo)記物。進(jìn)一步，所述試劑盒應(yīng)用的對(duì)象為人類、嚙齒動(dòng)物或其他哺乳動(dòng)物的骨髓標(biāo)本來源的細(xì)胞群。其中，所述使用說明書用于說明從所述骨髓標(biāo)本中收集獲得干細(xì)胞的使用方法。

實(shí)施例5本發(fā)明所述的試劑盒的應(yīng)用方法，具體步驟如下:(a)所述臍帶血細(xì)胞樣本與細(xì)胞前處理試劑A接觸:細(xì)胞前處理試劑A為質(zhì)量濃度為4 8%的羥乙基淀粉，之后吸取上清；(b)使經(jīng)過步驟(a)的所述細(xì)胞群與所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B接觸:其中，所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B為氟尿嘧啶、紫杉醇、卡鉬，接觸所述細(xì)胞的時(shí)間為36小時(shí)；(c)將步驟(b)所得的液體離心，丟棄上清取下層細(xì)胞沉淀，之后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞；(d)重復(fù)步驟(C)兩到三次；(e)使經(jīng)過步驟(d)的所述細(xì)胞群與所述細(xì)胞正向選擇試劑C接觸:所述試劑為大豆凝集素(SBA)和荊豆凝集素(UEA)，所述結(jié)合物為熒光染料TRITC，所述凝集素的濃度為0.95mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為90分鐘，孵育溫度為4°C ；(f)分離獲得凝集素陽(yáng)性的細(xì)胞群:選擇采用流式細(xì)胞儀分選法；最后，加入半乳糖、海藻糖兩種洗脫糖細(xì)胞洗滌劑D用于把所述凝集素結(jié)合物從所述獲得的細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來標(biāo)記物。進(jìn)一步，所述試劑盒應(yīng)用的對(duì)象為人類臍帶血標(biāo)本來源的細(xì)胞群。其中，所述使用說明書用于說明從所述臍帶血標(biāo)本中收集獲得干細(xì)胞的使用方法。其中，整個(gè)操作過程保持在無菌工作環(huán)境中進(jìn)行操作。顯然在不違反本發(fā)明的領(lǐng)域及范疇下，可以對(duì)上述用于從造血器官、血液標(biāo)本中獲得干細(xì)胞的細(xì)胞處理試劑盒進(jìn)行成分的修飾及或增加，本發(fā)明是以上述實(shí)施例進(jìn)行試劑盒的說明，并不是用于限制試劑盒的使用，對(duì)此進(jìn)行的任何等同替換、修改、增加均落在本發(fā)明的試劑盒的保護(hù)范疇內(nèi)。`
權(quán)利要求
1.造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，包括盒體、試劑、試劑瓶及使用說明書，其特征在于，該試劑盒(I)包括細(xì)胞前處理試劑A、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B、細(xì)胞正向選擇試劑C，分別盛放于細(xì)胞前處理試劑瓶(2)、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)、細(xì)胞正向選擇試劑瓶(4)內(nèi)，所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中包含的試劑為化療藥物，細(xì)胞正向選擇試劑瓶(4)中包含的試劑為凝集素結(jié)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，細(xì)胞前處理試劑瓶(2)包含的試劑為紅細(xì)胞沉淀劑或紅細(xì)胞裂解液；紅細(xì)胞沉淀劑為質(zhì)量濃度為0.1 20%的羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基淀粉的任一一種；紅細(xì)胞裂解液可選擇為氯化銨紅細(xì)胞裂解液、質(zhì)量濃度小于0.9%的生理鹽水溶液的任一一種；細(xì)胞前處理試劑或可選擇泛影酸鈉-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一種，所述細(xì)胞前處理試劑A作用細(xì)胞的次數(shù)至少為一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中的化療藥物可選擇為包括抗生素化療藥物、抗代謝化療藥物、烷化劑化療藥物、激素及內(nèi)分泌化療藥物、植物化療藥物、亞硝脲類化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、甲基芐肼、草酸鉬、鉬類、丙亞胺、羥基脲和氨烯咪胺的一種或兩種以上的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)中試劑接觸細(xì)胞的時(shí)間為小于或等于120小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，細(xì)胞正向選擇試劑瓶(4)中所述凝集素可選擇為天然的或人工合成的植物凝集素、動(dòng)物凝集素及其衍生物的一 種或兩種以上的組合，所述凝集素的濃度為0.001 30mg/ml ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，細(xì)胞提純?cè)噭┢恐兴瞿氐慕Y(jié)合物可選擇預(yù)先與熒光素、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一種進(jìn)行結(jié)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，所述與凝集素結(jié)合的高分子量的生物大分子的分子量在10000道爾頓(Mw)以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，高分子量的生物大分子可選擇為牛血清白蛋白、羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，所述細(xì)胞提純?cè)噭┢恐性噭┙佑|細(xì)胞的時(shí)間小于或等于120分鐘，與細(xì)胞孵育的溫度選擇為小于或等于38°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于，其應(yīng)用方法包括以下步驟: (a)所述細(xì)胞樣本與細(xì)胞前處理試劑A接觸:如加入紅細(xì)胞沉淀劑,選擇取上清；如力口入紅細(xì)胞裂解液，選擇離心后丟棄上清取細(xì)胞沉淀； (b)使經(jīng)過步驟(a)的所述細(xì)胞群與所述細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B接觸，接觸時(shí)間小于或等于120小時(shí)； (c)將步驟(b)所得的液體離心，丟棄上清取下層細(xì)胞沉淀，之后，用常規(guī)緩沖液洗滌細(xì)胞； (d)重復(fù)步驟(c)兩到三次； (e)使經(jīng)過步驟(d)的所述細(xì)胞群與所述細(xì)胞正向選擇試劑C接觸，所述凝集素的濃度為0.001 30mg/ml，與所述細(xì)胞群接觸的時(shí)間為小于或等于120分鐘，孵育溫度為小于或等于380C ； (f)分離獲得凝集素陽(yáng)性的細(xì)胞群:可選擇采用熒光活化細(xì)胞分選、磁珠分選法或靜置沉淀法。
11.據(jù)權(quán)利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，加入盛放于細(xì)胞洗滌試劑瓶(5)內(nèi)的洗脫糖細(xì)胞洗滌劑D把所述凝集素結(jié)合物從所述獲得的細(xì)胞上洗脫，從而使得獲得的干細(xì)胞不帶任何外來標(biāo)記物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征在于，所述造血器官、血液選自嚙齒動(dòng)物、人類或其他哺乳動(dòng)物的骨髓、脾臟、胸腺、胎肝、外周血、臍帶血、卵黃、胸腺、淋巴結(jié)、胸膜及其滲出液樣品，進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的試劑收集獲得的干細(xì)胞作為基礎(chǔ)、臨床與應(yīng)用研究、組織工程、治療、藥物篩選、修復(fù)失去功能的病變組織或器官中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從造血器官、血液中獲得干細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，包括試劑瓶、試劑、盛放試劑瓶的盒體及使用說明書，本發(fā)明的試劑盒(1)包括細(xì)胞前處理試劑A、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑B、細(xì)胞正向選擇試劑C，分別盛放于細(xì)胞前處理試劑瓶(2)、細(xì)胞負(fù)向選擇試劑瓶(3)、細(xì)胞正向選擇試劑瓶(4)內(nèi)。本發(fā)明的試劑盒還可包括洗脫糖細(xì)胞洗滌劑D，盛放于細(xì)胞洗滌試劑瓶(5)內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明獲得的干細(xì)胞可不帶任何外來標(biāo)記，不僅可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究，也可以直接用于臨床使用。本發(fā)明的試劑盒使用簡(jiǎn)便、易操作、可工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)用有效，可直接用于人類及其他哺乳動(dòng)物的來源的造血器官、血液標(biāo)本中的干細(xì)胞獲得，應(yīng)用前景廣泛。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103087978SQ201210440078
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者盧磊磊, 李福生, 盧淼淼, 盧晶晶 申請(qǐng)人:盧磊磊, 李福生