專利名稱：一種可催化不對稱還原反應的球孢白僵菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種真菌，尤其涉及一種可催化不對稱還原反應的球孢白僵菌及其應用。
背景技術：
4-氯-3-羥基丁酸乙酯中含有性質活潑的氯原子，使之在一些不對稱合成中得到廣泛應用，成為許多手性藥物的重要手性中間體。S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S-CHBE)是合成Slagenins B和C，HMG-CoA還原酶抑制劑的關鍵手性中間體，它還可以還原為1，4_ 二氫吡啶型β阻斷劑。R-4-氯-3-羥基丁酸乙酯可以作為合成L-肉堿、R-Y-氨基-β-羥基丁酸、(-)_大內酰亞胺A的關鍵手性中間體，并能轉化為(+)-負霉素。
度洛西汀，化學名為(+) -S-N-甲-Y -基_ (I-萘氧基)-2-噻吩基鹽酸鹽，是欣百達中的活性成分，它是一種5-羥色胺(5-ΗΤ)和去甲腎上腺素(NE)再攝取的雙重抑制藥， 該藥不僅可以治療抑郁癥，還可用于治療壓力性尿失禁和糖尿病性周圍神經病疼痛。S-氮， 氮-二甲基-3-羥基-(2-噻吩)-I-丙胺鹽酸鹽(S-DAN)是合成度洛西汀重要手性中間體， 具有重要的應用價值。
不對稱還原反應主要有二種方法
化學不對稱還原法需用銠、釕等價格昂貴的金屬作為催化劑，另外需用高壓的氫，對反應器要求較高。
生物催化不對稱還原法利用提純后的商品酶和微生物細胞中的酶進行不對稱還原，其中酶催化的不對稱還原反應需要添加昂貴的輔酶而且轉化率較低；微生物催化的不對稱還原反應是通過微生物全細胞中酶的立體選擇性來實現，同時輔酶的循環由細胞自動完成，進行不對稱還原反應時只需加入少量廉價的碳源(如蔗糖或葡萄糖)作為輔助底物即可，所以生物催化因其反應條件溫和立體選擇性強在合成手性化合物中有很大的優勢。 但是篩選到具有高立體選擇性的優良微生物菌株比較困難。
目前可用于催化不對稱還原反應的菌種已經較多報道，Yasohara等人采用預熱的木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)還原4_氯乙酰乙酸乙酯(C0BE),獲得產物 S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，對映體過量值可達86% e. e.，但是轉化率比不進行熱處理時的有所下降(日本，公告號JP2000175693A，公告日2000年6月27日)。PankaJ Soni等人篩選出產脫氫酶酵母(CandidatropicaliS)PBR-2，其可以對度洛西汀中間體進行催化反應，產物對映體過量值> 99% e. e.,轉化率為84-88% (Enantioselective reduction of acetophenoneand its derivatives with a new yeast isolate Candida tropicalis PBR-2MTCC5158)。
由于野生型酵母細胞含有多種醛/羰基還原酶，轉化產物很難獲得單一光學純化合物，光學純度較低，因此限制了其在生產上的應用。目前已經有很多人通過構建工程菌來獲得較高對映體過量值的產物，Shimizu S等人從Sporobolomyces salmonicolor中分離提取得到了可以催化生成對映體純R-CHBE的酶及其基因，并在大腸桿菌中表達了該基因，在水/有機溶劑兩相體系中將COBE還原為R-CHBE，對映體過量值可達到92% e. e.以上(Stereoselective Reduction of Ethyl 4-Chloro-3_0xobutanoate by aMicrobial Aldehyde Reductase in an Organic Solvent-ffater DiphasicSystem)。Wada M等構建了重組菌株，其催化產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩)丙酸乙酯的對映體過量值>98% e. e.，產率 80% (Clonging and overexpressionof the Exiguobacterium sp. F42Gene encoding a new short chaindehydrogenase, which catalyzs the strereoselective reduction of ethyl3-oxo_3-(2-thienyl)propanoate to ethyl (S)-3-hydroxy-3-(2-thienyl) prppanoate)。但是使用表達外源蛋白的工程菌或對細胞進行其它基因改造，菌體的穩定性很差，有時反應的轉化率不是很理想，同時存在食品安全方面的隱患。發明內容
本發明提供了一種可催化不對稱還原反應的球孢白僵菌，該菌株可以表達高立體選擇性的羰基還原酶，解決傳統野生菌株無法還原得到單一光學純化合物，光學純度較低的問題。
一種可催化不對稱還原反應的菌株，分類命名為球孢白僵菌(Beauveria bassiana),完整命名為球抱白僵菌(Beauveria bassiana)Bea-a-2,此菌株已于2012年7 月12日保存在位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 6345。
本發明菌株屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、白僵菌屬，在沙氏培養基上，菌落呈絨毛狀、叢卷毛狀至粉狀，白色至淺黃色，偶成淡粉色。
利用該微生物菌株可以不對稱還原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)生成高光學純度的 S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S-CHBE)，還可以不對稱還原N，N- 二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-I-丙胺鹽酸鹽(DKTP)生成高光學純度的S-N，N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-I-丙胺鹽酸鹽(S-DAN)。
本發明還提供了以分別以COBE和DKTP為底物，所述球孢白僵菌Bea-a_2在催化合成S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S-CHBE)和S-N，N- 二甲基-3-羥基-3- (2-噻吩)-I-丙胺鹽酸鹽(S-DAN)中的應用。
具體包括將球孢白僵菌Bea-a-2接種于培養基中進行擴大培養，收集菌體懸浮于緩沖液中，加入底物進行反應，反應后分離得到產物。
底物濃度和菌體的濃度影響底物轉化的速率，優選地，所述底物的濃度為3g/L 35g/L，更優選為5g/L 30g/L。優選地，所述菌體的濃度為15g/L 250g/L，更優選為 150 250g/L，最優選為 200g/L。
反應的溫度和時間同樣影響產物的得率和反應速率，溫度主要是影響菌體中酶的催化效率，優選為25°C 45°C，更優選為25 30°C。所述反應的時間優選為Ih 48h，更優選為10 30小時。
優選地，所述的擴大培養采用的培養基為SDY液體培養基。
以COBE為底物時，分離方法為
采用乙酸乙酯萃取，并對萃取液進行旋蒸處理，收集得到無色油狀液體。
以DKTP為底物時，分離方法為4
將反應體系的pH值調至11以上，再用乙酸乙酯萃取，對萃取液進行旋蒸處理，收集得到透明結晶體。
與現有技術相比較，本發明的有益效果為
本發明球孢白僵菌在催化不對稱還原反應中，可以獲得高光學純度的產物，且底物的轉化率高。
本發明球孢白僵菌可以不對稱還原COBE生成高光學純度的S-CHBE，COBE的轉化率能達到98%，催化產物中S-CHBE的e. e值能達到100% ；
本發明的球孢白僵菌，還可以不對稱還原DKTP生成高光學純度的S-DAN，DKTP的轉化率能達到86%，全細胞催化產物中S-DAN的e. e.值能到達100%。
具體實施方式
一、培養基
SDY斜面培養基葡萄糖4%，酵母粉1%，蛋白胨1%，瓊脂2%。
SDY選擇性培養基葡萄糖4 %，酵母粉I %，蛋白胨I %，瓊脂2 %，
4-氯乙酰乙酸乙酯O. I % 1.0%。
SDY液體種子培養基葡萄糖4%，酵母粉I %，蛋白胨I %。
SDY液體發酵培養基葡萄糖4%，酵母粉1%，蛋白胨1%。
二、菌株的分離純化
菌株的篩選、固體培養及保藏球孢白僵菌(Beauveria bassiana)野生株采用常規方法分離于采集的玉米螟僵死幼蟲，并經SDY培養基純化培養獲得。從SDY斜面培養基上挑取一環菌株劃線接種新鮮的SDY斜面培養基，在28°C培養箱培養2 7d，4°C冰箱保存。
菌株的誘變選育從新鮮的SDY斜面培養基上挑取一環菌株接種SDY液體種子培養基，在28°C搖床培養2天后制備菌懸液，然后采用紫外照射菌絲體懸液，紫外燈功率為 15W，距離15cm，時間lmin。照射后的菌絲體涂布含O. I % I. 0%的4-氯乙酰乙酸乙酯的 SDY選擇性培養基平板，在20 40°C培養2 10天，挑取能在篩選平板上形成菌落的菌株進行培養和催化性能測定(即篩選可以還原4-氯乙酰乙酸乙酯為單一光學純化合物的 S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯)，挑取具有最優催化選擇性的菌株進行保藏。
取篩選到的Bea-a-2菌株培養液送于上海生工生物工程有限公司對菌株的保守序列18s RNA進行測序，測序結果顯示篩選的菌株為白僵菌屬的球孢白僵菌。菌株屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、白僵菌屬，在沙氏培養基上，球孢白僵菌菌落呈絨毛狀、叢卷毛狀至粉狀，白色至淺黃色，偶成淡粉色。
將球孢白僵菌Bea-a-2送于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心(CGMCC)進行保藏，保藏編號為=CGMCC NO. 6345，保藏日期為2012年7月12日。
三、全細胞催化COBE制備S-CHBE
挑取一環誘變后保藏的球孢白僵菌Bea-a-2菌絲體接種至30mLSDY液體培養基， 在溫度為28°C、轉速為200rpm的恒溫振蕩搖床上培養40h，然后按10%接種量接種至裝液量為50mL的250mL搖瓶，在溫度為28°C、轉速為200rpm的恒溫振蕩搖床上培養48h。
離心收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌2次。然后用適量體積的磷酸緩沖液(O. 2M，PH6. 5)重懸菌體，使菌體濃度為200g/L，然后取20ml菌液放入250ml三角瓶中，加入COBE 反應，COBE的濃度為5g/L。反應溫度為30°C，反應時間為24h。
反應結束后,用等體積的萃取劑反萃取反應液兩次,合并乙酸乙酯萃取液,再向其中加入5% (w/v)的無水硫酸鎂，攪勻后靜置過夜以除去殘余的水分。過濾收集有機相，在 40°C進行減壓旋蒸，回收乙酸乙酯，所得無色油狀液體即為催化產物。
四、催化產物中S-CHBE的含量和光學純度測定
COBE的全細胞催化產物分為兩部分，一部分用乙酸乙酯溶解后采用氣相色譜檢測產物中S-CHBE和R-CHBE的總含量，以計算底物轉化率；另一部分產物用乙醇溶解后采用正相HPLC分析S-CHBE的對映體過量值(e. e值)。
底物COBE和產物S-CHBE的濃度采用氣相色譜進行鑒定。所用氣象色譜儀為福立9790，色譜柱為毛細色譜柱。檢測條件為柱箱溫度200°C，檢測器溫度280°C，輔助溫度 2800C，載氣為氮氣，進樣量O. 2 μ L。
產物S-CHBE的對映體過量值(e. e)采用正相HPLC測定。所用的高效液相色譜儀為依利特1201，色譜柱為大連依利特Sino-Chiral OD正相色譜柱。檢測條件為柱溫35°C， 流動相(正己烷異丙醇=9 10)，流速I. OmL/min，紫外檢測波長217nm，進樣量5 μ L。
結果表明，采用所述的全細胞催化方法，COBE的轉化率為98%，催化產物中 S-CHBE 的 e. e 值為 100%。
五、全細胞催化DKTP制備S-DAN
挑取一環誘變后保藏的球孢白僵菌Bea-a-2菌絲體接種至30mLSDY液體培養基， 在溫度為28°C、轉速為200rpm的恒溫振蕩搖床上培養40h，然后按10%接種量接種至裝液量為50mL的250mL搖瓶，在溫度為28°C、轉速為200rpm的恒溫振蕩搖床上培養48h。
離心收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌2次。然后用適量體積的磷酸緩沖液(O. 2M， PH6. 5)重懸菌體，使菌體濃度為200g/L，然后取20mL菌液放入250mL三角瓶中，加入DKTP 進行反應，DKTP的濃度為30g/L。反應溫度為30°C，反應時間為24h。
反應結束后，離心去除菌體，取上清，用NaOH溶液或Na2CO3調節pH至11 12，然后用等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，減壓旋蒸回收乙酸乙酯，并用適量的異丙醇溶解固形物，過濾后即為催化產物。
六、DKTP催化產物中S-DAN的含量和光學純度測定
采用反相HPLC測定催化產物中DAN的濃度，以計算反應得率；采用正相HPLC分析 S-DAN的對映體過量值。
底物DKTP和產物S-DAN的濃度采用反相HPLC進行測定。高效液相色譜儀為日立 L2000，色譜柱為大連依利特C18反相色譜柱(200mmX4.6mm，5ym)。檢測條件為檢測波長 254nm，流動相(乙腈:KH2P04 (pH 2.5) =40 60)，流速 L OmL/min，柱溫 25°C，進樣 M 20 μ L0
產物S-DAN對映體過量值(e. e)采用正相HPLC測定。所用高效液相色譜儀為依利特1201，色譜柱為大連依利特Sino-Chiral OD正相色譜柱。測定條件為柱溫40°C，檢測波長230nm，流動相(正己烷乙醇=95 5)，流速I. OmL/min，進樣量10 μ L。
檢測結果表明，底物DKTP的轉化率為86%，全細胞催化產物中S-DAN的e. e.值為 100%。
權利要求
1.一種可催化不對稱還原反應的球孢白僵菌，其特征在于，命名為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bea-a-2,保藏編號為 CGMCC NO. 6345。
2.如權利要求I所述的球孢白僵菌在催化合成S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯或S-N，N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1_丙胺鹽酸鹽中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，包括將球孢白僵菌Bea-a-2接種于培養基中進行擴大培養，收集菌體懸浮于緩沖液中，加入底物進行反應，反應后分離得到產物；所述底物為4-氯乙酰乙酸乙酯或N，N- 二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-1_丙胺鹽酸鹽。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述底物的添加濃度為3g/L 35g/L。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述菌體的濃度為15g/L 250g/L。
6.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述反應的溫度為25°C 45°C。
7.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述反應的時間為Ih 48h。
8.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的擴大培養采用的培養基為SDY液體培養基。
9.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述分離的方法為以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物時，采用乙酸乙酯萃取，并對萃取液進行旋蒸處理，收集得到無色油狀液體；以N，N- 二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-1_丙胺鹽酸鹽為底物時，將反應體系的pH值調至11 12，再用乙酸乙酯萃取，對萃取液進行旋蒸處理，收集得到透明結晶體。
全文摘要
本發明公開了一種可催化不對稱還原反應的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保存號為CGMCC NO.6345，保藏時間2012年7月12日。本發明的菌株可以表達高立體選擇性的羰基還原酶，利用該菌株進行4-氯乙酰乙酸乙酯的全細胞催化時，產物中S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的對映體過量值達到100％e.e.；利用該菌株進行N，N-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-1-丙胺鹽酸鹽的全細胞催化時，產物中(S)-N，N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺鹽酸鹽的對映體過量值達到100％e.e.。
文檔編號C12N1/14GK102925368SQ20121044108
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月7日 優先權日2012年11月7日
發明者金志華, 胡升, 姚成志, 王愛珂, 金慶超, 楊郁, 張麗靖, 曹倩, 梅樂和 申請人:浙江大學寧波理工學院, 寧波美諾華藥業股份有限公司