專利名稱：一種玉米油份含量相關(guān)的lacs基因位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種玉米油份含量相關(guān)的基因的分子標(biāo)記的應(yīng)用，屬于玉米育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
玉米油是玉米加工的主要產(chǎn)品之一。它是一種具有多種抗氧化劑的植物油，亞油酸含量高，維生素A、維生素E的含量也相對(duì)較高。亞油酸含量及亞油酸與油酸的比例決定植物油的品質(zhì)，同時(shí)維生素A、維生素E具有保健作用和藥用價(jià)值。食用玉米油有利于人類的身體健康，因此玉米油具有“健康食物油”之稱。我國(guó)高油玉米的研究開始于20世紀(jì)80年代，宋同明教授從國(guó)外引進(jìn)ASKC23、IH0C80、Syn. D. O、ARYD等高油玉米半成品群體，從中繼續(xù)選擇形成亞伊高油(AIHO)、抗病高油(Syn.D. O.)、利得高油(RYDHO)等高油群體。另外，宋同明還培育了 2個(gè)具有中國(guó)特色的高油群體北農(nóng)大高油群體(BHO)和抗倒堅(jiān)桿高油群體(KYHHO)。BHO以綜2號(hào)C3群體為基礎(chǔ)群體，進(jìn)行類似IHO的選擇。首先對(duì)17，000粒種子的含油量進(jìn)行單粒分析，從中選擇含油量較高的150粒種子，單粒點(diǎn)播，并且人為地分為A、B兩區(qū)，相互授粉。經(jīng)過18代的選擇，含油量由最初的4. 71 %提高到15. 55%，形成北農(nóng)大高油玉米(BHO)。KYHHO以14個(gè)優(yōu)良自交系鏈狀雜交法構(gòu)成的群體為基礎(chǔ)群體，同時(shí)對(duì)含油量和粒重進(jìn)行選擇，經(jīng)過7代選擇，含油量由原來的3. 73%增加到11.57%。雖然國(guó)內(nèi)高油玉米的選育比較晚，但所發(fā)展的高油群體含油量的提高并不亞于國(guó)際水平。脂肪酸的生物合成途徑是乙酰輔酶A—月桂酸一十四酸一軟脂酸一硬脂酸一油酸一亞油酸(Ohlrogge, 1995,1997 ;Buchanan, 2002)。由此可見，在油酸和亞油酸之間、飽和和不飽和脂肪酸之間存在著相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。Poneleit和Alexander (1965)的研究表明，軟脂酸、油酸和亞油酸的轉(zhuǎn)化是由高亞油酸單基因控制的。Widstrom等(1975)證明，油酸和軟脂酸含量的不同是由單基因控制的，而決定亞油酸含量的基因?yàn)閮蓚€(gè)或多個(gè)，一個(gè)呈部分顯性，另一個(gè)為隱性。Wright等(1995)把EMS誘變B73得到的高油單隱性突變體Olcl定位在第一染色體的長(zhǎng)臂上。近年來，隨著模式植物全基因組測(cè)序的完成，植物基因組學(xué)的研究已經(jīng)呈現(xiàn)出由簡(jiǎn)單質(zhì)量性狀向復(fù)雜的數(shù)量性狀轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)，特別是大量SNP標(biāo)記的開發(fā)以及生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析方法發(fā)掘植物數(shù)量性狀基因已成為目前國(guó)際植物基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的AM508群體由473個(gè)普通玉米自交系和35個(gè)高油玉米自交系組成(所述的群體材料，均為常見的玉米市售材料，可通過常規(guī)商業(yè)渠道購買得到)。候選基因重測(cè)序材料155份我國(guó)骨干自交系材料。從授粉15天后的AM508份自交系中隨機(jī)選擇368份自交系，構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。每個(gè)個(gè)體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始數(shù)據(jù)。全基因關(guān)聯(lián)分析以AM508群體為材料，利用IlluminaMaizeSNP50 BeadChip對(duì)56，110個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測(cè)。從授粉15天后的508份材料中隨機(jī)選擇的368份材料則構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)個(gè)體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始序列。使用高質(zhì)量的SNP，分別對(duì)這兩個(gè)群體采用線性混合模型校正群體層化效應(yīng)和親緣關(guān)系后與油脂相關(guān)性狀進(jìn)行了高密度標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析。為了綜合這兩個(gè)群體的結(jié)果，本研究研究使用了統(tǒng)一的閾值篩選顯著性的位點(diǎn)(建議水平顯著性閾值為1/N =
I.78X IO-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94X10^)。為了在較多的顯著關(guān)聯(lián)信號(hào)中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計(jì)算同一染色體上的顯著性信號(hào)位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡，過濾掉r2小于O. 02的標(biāo)記。在定位到的單一的顯著性信號(hào)中。玉米長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶(LACS)，位于玉米基因組第二條染色體上，該基因富含Ser/Thr/Gly結(jié)構(gòu)域，具有長(zhǎng)鏈乙酰輔酶A連接酶活性，該基因把游離脂肪酸活化成為長(zhǎng)鏈酰基輔酶A，從而在脂肪酸的合成與分解代謝中起著重要作用，同時(shí)它還參與角質(zhì)、聚酯及蠟質(zhì)的生物合成。利用368份材料關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于玉米參考基因組chr2.S_149517635的SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變?yōu)門/G，其中T為主要等位基因，G為最小等位基因，最小等位基因頻率為O. 05，該位點(diǎn)與玉米油份含量顯著關(guān)聯(lián)，該SNP位點(diǎn)與玉米長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶(LACS)基因緊密連鎖。玉米候選基因序列通過比對(duì)B73參考序列獲得，利用PrimerPremier 5和Primer3設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長(zhǎng)，利用MUSCLE軟件和BioEdit軟件進(jìn)行多序列處理和比對(duì)，利用TASSEL 2. O. I軟件提取SNP和InDel，同時(shí)通過1000次排列檢驗(yàn)計(jì)算多態(tài)性間的r2值，采用F測(cè)驗(yàn)計(jì)算兩個(gè)顯著性信號(hào)位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡。測(cè)序引物序列Rl5'-GATCTATTGGACGTGAGGCG-3'5'-ACAGTAGGGTGTTACCAATGAGC-3'R25'-TTTGCTCTGCCCTGTTTGTC-35'-CAGAAGATTCCACAAATTCCCTC-3'R35'-GATCGAGCTG CTGCCTGAG-3'5'-ATATCCAACGGACAATCTACGG-3'根據(jù)LACS基因的InDel_146/472功能位點(diǎn)開發(fā)的標(biāo)記序列如下PCR分子標(biāo)記序列5'-GATCGAGCTGCTGCCTGAG-3'5'-ATATCCAACGGACAATCTACGG-3'


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖IZmLACS基因內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)與不同地區(qū)的油脂表型的關(guān)聯(lián)分析；圖2ZmLACS基因的結(jié)構(gòu)及其功能結(jié)構(gòu)域圖示圖3顯著關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記間兩兩配對(duì)的連鎖不平衡展示4授粉15天后ZmLACS基因表達(dá)水平與油脂含量的相關(guān)性分析5InDel_146/472位點(diǎn)不同等位基因型對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化后的ZmLACS基因的表達(dá)水平
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述；應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例·僅為了說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。AM508群體由473個(gè)普通玉米自交系和35個(gè)高油玉米自交系組成，已在參考文獻(xiàn) Yang, X. H. et al. Characterization of a global germplasmcoIIection and itspotential utilization for analysis of complex quantitativetraits in maize. Mol.Breeding 121，417-431 公開過。候選基因重測(cè)序材料155份我國(guó)骨干自交系材料，已在參考文獻(xiàn)Yang,X. H. et al.Genetic analysis and characterization of a new maizeassociationmapping panel for quantitative trait loci dissection. Theor. Appl. Genet. 121，417-431 (2010a).公開過。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料從授粉15天后的AM508份自交系中隨機(jī)選擇368份自交系，構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。每個(gè)個(gè)體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始數(shù)據(jù)。表型變異AM508群體包含508個(gè)自交系(其中包括35個(gè)高油品系)油含量相關(guān)的變異豐富，軟脂肪酸含量差異2. 3倍，硬脂肪酸含量差異達(dá)8倍。軟脂肪酸(16: 0，15. 7% )、硬脂肪酸(18:0,2. 1%)、油酸(18:1，28.0%)、亞麻油酸(18:2,51. 2% )和亞麻酸(18:3,1.4%)這五種脂肪酸占98. 4%的油含量。4個(gè)環(huán)境聯(lián)合檢測(cè)發(fā)現(xiàn)十個(gè)油份相關(guān)性狀的遺傳力均在90%以上。全基因關(guān)聯(lián)分析以AM508 群體為材料，利用 Illumina MaizeSNP50 BeadChip 對(duì) 56，110 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測(cè)。從授粉15天后的508份材料中隨機(jī)選擇的368份材料則構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)個(gè)體的reads數(shù)為73. 8±0. 7百萬堿基，共產(chǎn)生了 2445. 9Gb的原始序列。研究使用了 106萬個(gè)高質(zhì)量的SNP，分別對(duì)這兩個(gè)群體采用線性混合模型校正群體層化效應(yīng)和親緣關(guān)系后與油脂相關(guān)性狀進(jìn)行了高密度標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析。為了綜合這兩個(gè)群體的結(jié)果，本研究研究使用了統(tǒng)一的閾值篩選顯著性的位點(diǎn)(建議水平顯著性閾值為1/N = 1.78X10-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94Χ1(Γ8)。為了在較多的顯著關(guān)聯(lián)信號(hào)中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計(jì)算同一染色體上的顯著性信號(hào)位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡，過濾掉r2小于0.02的標(biāo)記。在定位到的單一的顯著性信號(hào)中，有若干個(gè)位點(diǎn)位于或者臨近于(50Kb)被前人證實(shí)報(bào)道過的已知基因內(nèi)，它們?cè)诒狙芯恐性俅蔚玫搅蓑?yàn)證。與已知的油脂代謝相關(guān)基因較遠(yuǎn)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)很可能是與油脂代謝相關(guān)基因緊密連鎖，則距離最近的油脂代謝基因很可能就是本研究的候選基因。玉米長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶(LACS)，位于玉米基因組第二條染色體上，該基因富含Ser/Thr/Gly結(jié)構(gòu)域，具有長(zhǎng)鏈乙酰輔酶A連接酶活性，該基因把游離脂肪酸活化成為長(zhǎng)鏈酰基輔酶A，從而在脂肪酸的合成與分解代謝中起著重要作用，同時(shí)它還參與角質(zhì)、聚酯及蠟質(zhì)的生物合成。利用368份材料關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于玉米參考基因組chr2.S_149517635的SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變?yōu)門/G，其中T為主要等位基因，G為最小等位基因，最小等位基因頻率為O. 05，該位點(diǎn)與玉米油份含量顯著關(guān)聯(lián)，該SNP位點(diǎn)與玉米長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶(LACS)基因緊密連鎖。
權(quán)利要求
1.一種玉米油份含量相關(guān)的LACS基因位點(diǎn)，其特征在于，所述的基因位點(diǎn)為長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶基因，位于玉米參考基因組(www. maizesequence. org, 5a. 60版)chr2.S_149517635的SNP，該位點(diǎn)突變?yōu)門/G。以及位于玉米LACS基因(GRMZM2G079236) 3’ UTR的InDel_146/472(146bp的插入/472bp的缺失和146bp的缺失/472bp的插入)位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求I所述的玉米油份含量相關(guān)的基因位點(diǎn)的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟 a)由473個(gè)普通玉米自交系和35個(gè)高油玉米自交系組成AM508群體； b)從授粉15天后的AM508份自交系中隨機(jī)選擇368份自交系,構(gòu)建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對(duì)的RNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
3.如權(quán)利要求I或2所述的玉米油份含量相關(guān)的基因位點(diǎn)的應(yīng)用，其特征在于玉米LACS基因的InDel_146/472功能位點(diǎn)開發(fā)的PCR分子標(biāo)記序列為5' -CGGGTGGAACTTGTTATGGC-3'5' -AGGGCACTGAATCGGAACAC-3。
4.如權(quán)利要求I或2所述的玉米油份含量相關(guān)的基因位點(diǎn)及其應(yīng)用，其特征在于玉米基因序列通過比對(duì)B73參考序列獲得,利用Primer Premier5和Primer3設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長(zhǎng)，利用MUSCLE軟件和BioEdit軟件進(jìn)行多序列處理和比對(duì)，利用TASSEL 2. O. I軟件提取SNP和InDel，同時(shí)通過1000次排列檢驗(yàn)計(jì)算多態(tài)性間的r2值，采用F測(cè)驗(yàn)計(jì)算兩個(gè)顯著性信號(hào)位點(diǎn)間兩兩的連鎖不平衡。
5.如權(quán)利要求I所述的玉米油份含量相關(guān)的基因位點(diǎn)在玉米育種的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米油份含量相關(guān)的LACS基因位點(diǎn)及其應(yīng)用，屬于植物分子育種領(lǐng)域。本發(fā)明的玉米油份相關(guān)的位點(diǎn)為位于玉米參考基因組(www.maizesequence.org，5a.60版)chr2.S_149517635的SNP，該位點(diǎn)突變?yōu)門/G；以及位于玉米LACS基因(GRMZM2G079236)3’UTR的InDel_146/472(146bp的插入/472bp的缺失和146bp的缺失/472bp的插入)位點(diǎn)。可將分子標(biāo)記用于不同遺傳背景下的高油玉米育種，可以用于玉米遺傳改良；該方法和標(biāo)記在玉米育種領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102911949SQ20121044468
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者嚴(yán)建兵, 楊小紅, 李建生, 李慧 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)