專利名稱：末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚乙二醇水溶性聚合物及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及聚乙二醇活性酯及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
使用化學(xué)方法將水溶性聚合物聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG)結(jié)合到分子和表面在生物技術(shù)中具有重大的應(yīng)用意義。PEG在生物技術(shù)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用一些 PEG的活性衍生物結(jié)合到蛋白質(zhì)、酶的分子上，即對酶進(jìn)行修飾，由于PEG可以溶于有機溶齊[J，PEG結(jié)合到酶分子可以使PEG與酶的結(jié)合物溶于有機溶劑；與未修飾的蛋白質(zhì)相比，將PEG連接到蛋白質(zhì)上可減小蛋白的免疫原性、降低腎臟排除速率，并可從中促使結(jié)合物在血液循環(huán)中的半衰期的增加；PEG結(jié)合到表面可減小蛋白質(zhì)和細(xì)胞的吸附并改變表面的帶電性質(zhì)，PEG結(jié)合到脂質(zhì)體上可以使其半衰期有極大增加，并能夠增加其作為藥物緩釋的介質(zhì)的能力。PEG只有經(jīng)過活化才能夠結(jié)合到分子或表面上。因此，一系列的活化衍生物被制備出來。目前應(yīng)用較廣的修飾劑活化類型為羧酸的活化酯類。該類修飾劑是通過活化酯對蛋白的自由氨基進(jìn)行酰化，從而將PEG鏈結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上實現(xiàn)修飾的。目前，許多用于修飾的活化的羧基PEG具有較差的反應(yīng)活性。例如，羧甲基化PEG(CM-PEG)的NHS酯的反應(yīng)活性太強，以至溶解在水中立刻水解(在pH8、25° C下的水解半衰期為O. 75 min)，這種高反應(yīng)活性是羧甲基化PEG活性酯的嚴(yán)重缺陷。而第一代修飾劑中活化的SC-PEG雖然有較好的反應(yīng)活性(在pH8、25° C下的半衰期為20. 4 min)，但由于在分子內(nèi)含有不穩(wěn)定的酯鍵，現(xiàn)已較少使用。又如丁二酸酐丁二酰亞胺酯活化的PEG(succinimidyl succinate, SS-PEG)。SS-PEG 的制備是通過 mPEG 與丁二酸酐發(fā)生酯化反應(yīng)，使丁二酸酐開環(huán)，從而在PEG的鏈端造成一個羧基，然后又將羧基活化成丁二酰亞胺酯。該試劑在與蛋白質(zhì)結(jié)合后還存在一個酯鍵，而酯鍵由于其固有的不穩(wěn)定性在PEG高分子結(jié)合到蛋白質(zhì)上時非常容易被水解。這種水解不僅會使PEG鏈從蛋白上脫落，喪失PEG修飾帶來的益處，而且留在蛋白質(zhì)上的丁二酸尾部還可作為半抗原導(dǎo)致蛋白質(zhì)的免疫原性。Harris等人在mPEG的末端引入丙酸單位，使得這種丙酸PEG活性酯的水解半衰期增加到16. 5分鐘，但該方法涉及了在PEG —端引入氰基，需要再進(jìn)行強酸和強堿的水解才能得到產(chǎn)物，極有可能破壞PEG主鏈。目前，許多用于修飾的活化的羧基PEG具有很差的反應(yīng)活性不是反應(yīng)太快就是反應(yīng)太慢。例如，羧甲基化PEG (CM-PEG)的NHS酯的反應(yīng)活性太強，以至溶解在水中立刻水解，這種高反應(yīng)活性是羧甲基化PEG活性酯的嚴(yán)重缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，滿足醫(yī)藥領(lǐng)域和生物工程領(lǐng)域發(fā)展的需要。本發(fā)明的末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的活性酸或酯的結(jié)構(gòu)式如下
R1 — (CH2CH2O)n — CH2 — CO — NH — R2 — CO — OR3
其中η = 43 680 ；
R1 可以是 CH3O ―，也可以是一O — CH2 — CO — NH — R2 — CO — OR3 ；
R2是氨基苯丙酸除氨基與羧基以外的殘基，其中的氨基苯丙酸可以是2 —氨基一 3 —苯基丙酸(即α-苯丙氨酸)，也可以是3 —氨基一 3—苯基丙酸(S卩苯丙氨酸)； R3可以是H —，也可以是一 N —丁二酸亞胺基。本發(fā)明提供的連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的活性酯具有合適的反應(yīng)活性，活性酯在水中的水解半衰期約10分鐘，且不含有其它的酯鍵連接。本發(fā)明的連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的活性酯的制備方法包括如下步驟
(1)CM-PEG (羧甲基化聚乙二醇)的制備
將聚乙二醇溶于甲苯中，加入叔丁醇鉀回流反應(yīng)廣2小時，加入溴乙酸乙酯回流反應(yīng)2^4小時，然后室溫反應(yīng)If 24小時，濃縮后用乙醚沉淀，沉淀物堿水解然后酸化，采用常規(guī)的方法收集產(chǎn)物；
(2)氨基苯丙酸乙酯鹽酸鹽的制備
將氯化氫氣體通入含有氨基苯丙氨酸的乙醇直到飽和，然后收集氨基苯丙酸乙酯鹽酸
鹽；
(3)末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇酸衍生物的制備
取步驟(I)中制備的CM-PEG溶于二氯甲烷，然后依次加入二環(huán)己基碳二亞胺、氨基苯丙酸乙酯鹽酸鹽，然后用三乙胺將溶液的pH值調(diào)節(jié)到8 9，反應(yīng)8 12小時，過濾，濾液加入乙醚，收集沉淀產(chǎn)物，將產(chǎn)物干燥后溶于水，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至1(Γ12，反應(yīng)廣3小時，然后用草酸將溶液PH調(diào)節(jié)到2 4，收集產(chǎn)物，獲得末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇酸衍生物。(4)取步驟(3)的產(chǎn)物溶于二氯甲烷，加入I. 5 3倍摩爾量的二環(huán)己基碳二亞胺和I. 5^3倍摩爾量的N-羥基丁二酰亞胺，1(T30°C攪拌反應(yīng)2(Γ28小時，收集產(chǎn)物，獲得末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇活性酯。所說的氨基苯丙酸為D型、L型或外消旋體；
聚乙二醇優(yōu)選的分子量為200(T30000 Da。本發(fā)明的末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的活性酯，在水中擁有約10分鐘的水解半衰期，具有理想的與生物活性物質(zhì)氨基的反應(yīng)活性，可用于與生物活性物質(zhì)相連接，制備PEG修飾的生物活性物質(zhì)，用于制備緩釋藥物的介質(zhì)等。本發(fā)明還涉及一種所說的末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇活性酸或酯與生物活性物質(zhì)的結(jié)合物，結(jié)構(gòu)通式如下
R1 — (CH2CH2O)n — CH2 — CO — NH — R2 — CO — NH-Pro
其中=R1 可以是 CH3O ―，也可以是一CH2 — CO — NH — R2 — CO — NH-Pro ；
NH-Pro部分代表生物活性物質(zhì)的氨基位點； η = 43^680 ；R2是氨基苯丙酸除氨基與羧基以外的殘基，其中的氨基苯丙酸可以是2 —氨基一 3 —苯基丙酸(即α-苯丙氨酸)，也可以是3 —氨基一 3—苯基丙酸(S卩β-苯丙氨酸)。生物活性物質(zhì)可以是蛋白質(zhì)、酶、多肽、藥物、染料、核苷、酯類或脂質(zhì)體。采用上述方法制備的末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇活性酯，具有良好的反應(yīng)活性，可用于與蛋白質(zhì)或酶的分子相連接，以及用于制備緩釋藥物的介質(zhì)。
具體實施例方式實施例I
分子量為 5000 Da 的 CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CO-NH-CH(C6H5)CH2-COONHS 的合成 步驟I =CM-PEG (羧甲基化聚乙二醇)的制備
將分子量為5000 Da的單甲氧基聚乙二醇15 g (3 mmol)溶于甲苯中，蒸餾出一部分甲苯以共沸除水，然后加入4 mmol的叔丁醇鉀回流反應(yīng)I. 5小時,而后緩慢加入4 mmol的溴乙酸乙酯回流反應(yīng)3小時，然后室溫反應(yīng)21小時，過濾除去沉淀后減壓蒸去溶劑，殘留物加少量二氯甲烷溶解，用干燥乙醚沉淀出產(chǎn)物，將該產(chǎn)物溶于去離子水中，加入O. I mol/L的氫氧化鈉溶液直到溶液的PH值穩(wěn)定在pHIO，然后用0. I mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH到3，用等量的氯仿萃取溶液三次，合并有機相并用無水硫酸鈉干燥，濃縮后用乙醚沉淀干燥得到分子量為 5000 Da 的 CM-PEG，化學(xué)式為 CH3O-(CH2CH2O) n_CH2C00H。步驟2 : β -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的制備
將20 g β-苯丙氨酸加入到300 mL無水乙醇中，在攪拌下通入干燥的氯化氫氣體直到飽和，然后加入無水乙醇進(jìn)行減壓蒸餾，將多余的氯化氫除去，接著將溶液濃縮至合適的體積，用干燥無水的乙醚沉淀得到β -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽。步驟3 :合成 CH3O- (CH2CH2O) n-CH2C0_NH-CH (C6H5) CH2-COOH
取7. 5 g(l. 5 mmol)步驟(I)中制備的CM-PEG溶于40 mL干燥的二氯甲烷中，然后依次加入2 mmol的二環(huán)己基碳二亞胺、2 mmol的β -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽,然后用三乙胺將溶液的PH值調(diào)節(jié)到8，攪拌反應(yīng)12小時，過濾除去沉淀后，加入無水乙醚沉淀產(chǎn)物，將產(chǎn)物干燥后溶于去離子水，加入0. I mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11，反應(yīng)2小時，然后用草酸將溶液PH調(diào)節(jié)到3，用氯仿萃取溶液三次，合并萃取液用無水硫酸鈉干燥，溶液濃縮后再用無水乙醚沉淀得到以酰胺鍵與PEG連接的PEG- β -苯丙氨酸衍生物，化學(xué)式為CH3O- (CH2CH2O)n-CH2C0-NH-CH (C6H5) CH2-COOH。步驟4:
取步驟3制備的分子量為5000 Da的PEG- β -苯丙氨酸，溶于干燥精制的無水二氯甲烷中，加入I. 2倍摩爾量的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和I. 2倍摩爾量的N-羥基丁二酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)24小時，停止反應(yīng)濾除沉淀二環(huán)己基脲(D⑶)，溶液用無水乙醚沉淀得到產(chǎn)物分子量為5000 Da的PEG-β-苯丙氨酸的N-羥基丁二酰亞胺酯。化學(xué)式為CH3O-(CH2CH2O)n-CH2C0-NH-CH (C6H5) CH2-C00NHS。實施例2
分子量為 12000 Da 的 CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CO-NH-CH(CH2C6H5)-COONHS 的合成步驟I :CM-PEG的制備
將分子量為12000 Da的單甲氧基聚乙二醇18 g (1.5 mmol)溶于適量的甲苯中，蒸餾出一部分甲苯以共沸除水，然后加入2 mmol的叔丁醇鉀回流反應(yīng)2小時，而后緩慢加入2 mmol的溴乙酸乙酯回流反應(yīng)4小時，然后室溫反應(yīng)18小時，過濾除去沉淀后減壓蒸去溶齊U，殘留物加入二氯甲烷溶解，用干燥乙醚沉淀出產(chǎn)物，將該產(chǎn)物溶于去離子水中，逐漸加Λ O. I mol/L的氫氧化鈉溶液直到溶液的pH值穩(wěn)定在pHIO，然后用O. I mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的PH到3，用等量的氯仿萃取溶液三次，合并有機相并用無水硫酸鈉干燥，濃縮后用乙醚沉淀干燥得到分子量為12000 Da的CM-PEG，分子式如下CH30_ (CH2CH2O) n_CH2C00H。步驟2 : α -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的制備
將20 g α-苯丙氨酸加入到300 mL無水乙醇中，在攪拌下通入干燥的氯化氫氣體直到飽和，然后加入無水乙醇進(jìn)行減壓蒸餾，將多余的氯化氫除去，接著將溶液濃縮至合適的體積，用干燥無水的乙醚沉淀得到α -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽。步驟3 :合成 CH3O- (CH2CH2O) n-CH2C0_NH-CH (CH2C6H5) -C00H
取12 g (I mmol)步驟(I)中制備的CM-PEG溶于40 mL干燥的二氯甲烷中，然后依 次加入2 mmol的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、2 mmol的α -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽，然后用三乙胺將溶液的PH值調(diào)節(jié)到8，攪拌反應(yīng)過夜，過濾除去沉淀后，加入無水乙醚沉淀產(chǎn)物，將產(chǎn)物干燥后溶于去離子水，加入0. I mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11,然后用草酸將溶液PH調(diào)節(jié)到3，用氯仿萃取溶液三次，合并萃取液用無水硫酸鈉干燥，溶液濃縮后再用無水乙醚沉淀得到以酰胺鍵與PEG連接的PEG- α -苯丙氨酸衍生物，化學(xué)式為CH3O- (CH2CH2O)n-CH2C0-NH-CH (CH2C6H5) -C00H。步驟4
取步驟(3)制備的分子量為12000 Da的PEG-α-苯丙氨酸，溶于干燥精制的無水二氯甲烷中，加入I. 2倍摩爾量的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和I. 2倍摩爾量的N-羥基丁二酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)24小時，停止反應(yīng)濾除沉淀二環(huán)己基脲(D⑶)，溶液用無水乙醚沉淀得到產(chǎn)物分子量為12000 Da的PEG-α-苯丙氨酸的N-羥基丁二酰亞胺酯。化學(xué)式為CH3O- (CH2CH2O) n-CH2C0-NH-CH (CH2C6H5) -C00NHS。實施例3
分子量為10000 Da的PEG-雙-β -苯丙氨酸-N-羥基丁二酰亞胺酯的合成 步驟I :CM-PEG 二酸(二羧甲基化聚乙二醇)的制備
將分子量為10000 Da的雙羥基聚乙二醇10 g (I mmol)溶于甲苯中，蒸餾出一部分甲苯以共沸除水，然后加入3 mmol的叔丁醇鉀回流反應(yīng)I. 5小時，而后緩慢加入3 mmol的溴乙酸乙酯回流反應(yīng)3小時，然后室溫反應(yīng)21小時，過濾除去沉淀后減壓蒸去溶劑，殘留物加少量二氯甲烷溶解，用干燥乙醚沉淀出產(chǎn)物，將該產(chǎn)物溶于去離子水中，加入0. I mol/L的氫氧化鈉溶液直到溶液的PH值穩(wěn)定在pHIO，然后用0. I mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH到3，用等量的氯仿萃取溶液三次，合并有機相并用無水硫酸鈉干燥，濃縮后用乙醚沉淀干燥得到分子量為 10000 Da 的 CM-PEG 二酸，化學(xué)式為 HOOCCH2O-(CH2CH2O) n_CH2C00H。步驟2 : β -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的制備
將20 g β-苯丙氨酸加入到300 mL無水乙醇中，在攪拌下通入干燥的氯化氫氣體直到飽和，然后加入無水乙醇進(jìn)行減壓蒸餾，將多余的氯化氫除去，接著將溶液濃縮至合適的體積，用干燥無水的乙醚沉淀得到β -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽。步驟3:合成 HOOC-CH2-CH(C6H5)-NH-CO-CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CO-NH-CH(C6H5)CH2-COOH
取5 g (O. 5 mmol)步驟(I)中制備的CM-PEG溶于20 mL干燥的二氯甲烷中，然后依次加入2 mmol的二環(huán)己基碳二亞胺、2 mmol的β -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽,然后用三乙胺將溶液的PH值調(diào)節(jié)到8，攪拌反應(yīng)12小時，過濾除去沉淀后，加入無水乙醚沉淀產(chǎn)物，將產(chǎn)物干燥后溶于去離子水，加入O. I mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11，反應(yīng)2小時，然后用草酸將溶液PH調(diào)節(jié)到3，用氯仿萃取溶液三次，合并萃取液用無水硫酸鈉干燥，溶液濃縮后再用無水乙醚沉淀得到以酰胺鍵與PEG連接的PEG-雙-β -苯丙氨酸衍生物，化學(xué)式為HOOC-CH2-CH (C6H5) -NH-CO-CH2O- (CH2CH2O) n-CH2C0_NH-CH (C6H5) CH2-COOH。步驟4
取步驟3制備的分子量為10000 Da的PEG-雙-β-苯丙氨酸，溶于干燥精制的無水 二氯甲烷中，加入3倍摩爾量的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和3倍摩爾量的N-羥基丁二酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)24小時，停止反應(yīng)濾除沉淀二環(huán)己基脲(D⑶)，溶液用無水乙醚沉淀得到產(chǎn)物分子量為10000 Da的PEG-雙-β -苯丙氨酸的N-羥基丁二酰亞胺酯，化學(xué)式為NHS-00C-CH2-CH (C6H5) -NH-CO-CH2O- (CH2CH2O) n-CH2C0-NH-CH (C6H5) CH2-C00NHS。實施例4
分子量為20000 Da的PEG-雙-α -苯丙氨酸-N-羥基丁二酰亞胺酯的合成 步驟I :CM-PEG 二酸的制備
將分子量為20000 Da的雙羥基聚乙二醇20 g (I mmol)溶于適量的甲苯中，蒸餾出一部分甲苯以共沸除水，然后加入3 mmol的叔丁醇鉀回流反應(yīng)2小時，而后緩慢加入3 mmol的溴乙酸乙酯回流反應(yīng)4小時，然后室溫反應(yīng)18小時，過濾除去沉淀后減壓蒸去溶劑，殘留物加入二氯甲烷溶解，用干燥乙醚沉淀出產(chǎn)物，將該產(chǎn)物溶于去離子水中，逐漸加入0. Imol/L的氫氧化鈉溶液直到溶液的pH值穩(wěn)定在pHIO，然后用0. I mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的PH到3，用等量的氯仿萃取溶液三次，合并有機相并用無水硫酸鈉干燥，濃縮后用乙醚沉淀干燥得到分子量為20000 Da的雙羧基CM-PEG，分子式如下H00CCH20-(CH2CH2O) n_CH2C00H。步驟2 : α -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽的制備
將20 g α-苯丙氨酸加入到300 mL無水乙醇中，在攪拌下通入干燥的氯化氫氣體直到飽和，然后加入無水乙醇進(jìn)行減壓蒸餾，將多余的氯化氫除去，接著將溶液濃縮至合適的體積，用干燥無水的乙醚沉淀得到α -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽。步驟3:合成 H00C-CH (CH2C6H5) - NH-CO-CH2O -(CH2CH2O)n-CH2C0-NH-CH (CH2C6H5) -C00H
取10 g (0.5 mmol)步驟(I)中制備的CM-PEG溶于40 mL干燥的二氯甲烷中，然后依次加入2 mmol的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、2 mmol的α -苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽，然后用三乙胺將溶液的PH值調(diào)節(jié)到8，攪拌反應(yīng)過夜，過濾除去沉淀后，加入無水乙醚沉淀產(chǎn)物，將產(chǎn)物干燥后溶于去離子水，加入0. I mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11,然后用草酸將溶液PH調(diào)節(jié)到3，用氯仿萃取溶液三次，合并萃取液用無水硫酸鈉干燥，溶液濃縮后再用無水乙醚沉淀得到分子量為20000 Da的PEG-雙-α -苯丙氨酸衍生物，化學(xué)式為H00C-CH (CH2C6H5) -NH-CO-CH2O- (CH2CH2O) n-CH2C0_NH-CH (CH2C6H5) -C00H。步驟4:
取步驟(3)制備的分子量為20000 Da的PEG-雙-α -苯丙氨酸，溶于干燥精制的無水二氯甲烷中，加入3倍摩爾量的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和3倍摩爾量的N-羥基丁二酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)24小時，停止反應(yīng)濾除沉淀二環(huán)己基脲(D⑶)，溶液用無水乙醚沉淀得到 產(chǎn)物分子量為20000 Da的PEG-雙-α -苯丙氨酸的N-羥基丁二酰亞胺酯。化學(xué)式為NHS-OOC-CH (CH2C6H5) -NH-CO-CH2O- (CH2CH2O) n-CH2C0_NH-CH (CH2C6H5) -COONHS。
權(quán)利要求
1.一種末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的酸或活性酯，其特征在于，結(jié)構(gòu)如下R1 — (CH2CH2O)n — CH2 — CO — NH — R2 — CO — OR3 其中η = 43 680 ； R1 可以是 CH3O ―，也可以是一O — CH2 — CO — NH — R2 — CO — OR3 ； R2是氨基苯丙酸除氨基與羧基以外的殘基，其中的氨基苯丙酸可以是2 —氨基一 3 —苯基丙酸(即α-苯丙氨酸)，也可以是3 —氨基一 3—苯基丙酸(S卩苯丙氨酸)； R3可以是H —，也可以是一 N —丁二酸亞胺基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的活性酸或酯，其特征在于，所說的酸或酯為CH3O- (CH2CH2O) n-CH2C0-NH-CH (CH2C6H5) -COOHCH3O- (CH2CH2O) n-CH2C0-NH-CH (C6H5) CH2-COOHHOOC-CH (CH2C6H5) -NH-CO-CH2O- (CH2CH2O) n-CH2C0_NH-CH (CH2C6H5) -COOHHOOC-CH2-CH (C6H5) -NH-CO-CH2O- (CH2CH2O) n-CH2C0_NH-CH (C6H5) CH2-COOHCH3O- (CH2CH2O) n-CH2C0-NH-CH (CH2C6H5) -COONHSCH3O- (CH2CH2O) n-CH2C0-NH-CH (C6H5) CH2-C00NHSNHS-OOC-CH (CH2C6H5) -NH-CO-CH2O- (CH2CH2O) n-CH2C0_NH-CH (CH2C6H5) -COONHS 或NHS-00C-CH2-CH (C6H5) -NH-CO-CH2O- (CH2CH2O) n-CH2C0-NH-CH (C6H5) CH2-C00NHS此處NHS代表N-羥基丁二酰亞胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的活性酸或酯的制備方法包括如下步驟 (1)將聚乙二醇溶于甲苯中，加入叔丁醇鉀回流反應(yīng)f2小時，加入溴乙酸乙酯回流反應(yīng)2 4小時，然后室溫反應(yīng)18 24小時，濃縮后用乙醚沉淀，沉淀物堿水解然后酸化，獲得CM-PEG ； (2)將氯化氫氣體通入含有氨基苯丙酸的乙醇直到飽和，然后收集氨基苯丙酸乙酯鹽酸鹽； (3)取步驟(I)中制備的CM-PEG溶于二氯甲烷，然后依次加入二環(huán)己基碳二亞胺、氨基苯丙酸乙酯鹽酸鹽，然后用三乙胺將溶液的PH值調(diào)節(jié)到8 9，反應(yīng)8 12小時，過濾，濾液加入乙醚，收集沉淀產(chǎn)物，將產(chǎn)物干燥后溶于水，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至1(Γ12，反應(yīng)廣3小時，然后用草酸將溶液PH調(diào)節(jié)到2 4，收集產(chǎn)物，獲得末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇衍生物； (4)取步驟(3)的產(chǎn)物溶于二氯甲烷，加入I.5 3倍摩爾量的二環(huán)己基碳二亞胺和I.5 3倍摩爾量的N-羥基丁二酰亞胺，1(T30°C攪拌反應(yīng)2(Γ28小時，收集產(chǎn)物，獲得末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇活性酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，氨基苯丙酸可以是2-氨基-3-苯基丙酸(即β-苯丙氨酸)，也可以是3-氨基-3-苯基丙酸(B卩α-苯丙氨酸)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述，其特征在于，所說的β-苯丙氨酸可以是D型、L型或外消旋體；所說的α-苯丙氨酸可以是D型、L型或外消旋體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的聚乙二醇可以為單甲氧基聚乙二醇，也可以為雙羥基聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量為200(T30000 Da。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇活性酸或酯的應(yīng)用，其特征在于，用于與蛋白質(zhì)或酶相連接，制備具有PEG修飾的蛋白質(zhì)或酶。
8.—種權(quán)利要求I或2所述的末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇活性酸或酯與生物活性物質(zhì)的結(jié)合物，其特征在于，結(jié)構(gòu)通式如下R1 — (CH2CH2O)n — CH2 — CO — NH — R2 — CO — NH-Pro 其中=R1 可以是 CH3O ―，也可以是一O — CH2 — CO — NH — R2 — CO — NH-Pro ； NH-Pro部分代表生物活性物質(zhì)的氨基位點； η = 43 680 ； R2是氨基苯丙酸除氨基與羧基以外的殘基，其中的氨基苯丙酸可以是2 —氨基一 3 —苯基丙酸(即α-苯丙氨酸)，也可以是3 —氨基一 3—苯基丙酸(S卩β-苯丙氨酸)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的修飾物，其特征在于生物活性物質(zhì)可以是蛋白質(zhì)、酶、多肽、藥物、染料、核苷、酯類或脂質(zhì)體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種末端連接氨基苯丙酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和應(yīng)用，該發(fā)明應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。此聚合物活性酯在水中具有適當(dāng)?shù)呐c生物活性物質(zhì)的氨基反應(yīng)的活性。其結(jié)構(gòu)式如下R1－(CH2CH2O)n－CH2－CO－NH－R2－CO－OR3其中n＝43~680；R1可以是CH3O－，也可以是－O－CH2－CO－NH－R2－CO－OR3；R2是氨基苯丙酸除氨基與羧基以外的殘基，其中的氨基苯丙酸可以是2－氨基－3－苯基丙酸(即α-苯丙氨酸)，也可以是3－氨基－3－苯基丙酸(即β-苯丙氨酸)；R3可以是H－，也可以是－N－丁二酰亞胺基。
文檔編號C12N9/96GK102964588SQ20121044626
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者熊玉春, 羅宇, 李志成 申請人:河南工業(yè)大學(xué)