一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其制備和應用，氨基化鋰皂石為(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷APMES修飾的鋰皂石；聚乙二醇與葉酸的摩爾比為1∶0.4-1∶0.8；聚乙二醇-葉酸的質量分數在45-55％。制備：將葉酸溶解在溶劑中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC，攪拌得到混合溶液，逐滴加入聚乙二醇溶液中，攪拌2-3d，透析，冷凍干燥，得到聚乙二醇-葉酸PEG-FA；向PEG-FA溶液中加入EDC，攪拌2-4h，再逐滴加入氨基化鋰皂石納米顆粒的水溶液中，磁力攪拌2-3d，透析，即得。應用于藥物負載。本發明制備方法簡單，條件溫和，應用范圍廣泛，具有良好的市場前景。
【專利說明】一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其制 備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于納米載藥材料及其制備和應用領域，特別涉及一種聚乙二醇-葉酸修 飾的氨基化鋰皂石納米顆粒及其制備和應用。
【背景技術】
[0002] 癌癥被認為是21世紀人類面臨的重大挑戰之一。在使用化學藥物治療腫瘤的過 程中，抗癌藥物存在水溶性差、在病灶部位保留時間短以及不能特異性識別腫瘤細胞等問 題，這將對人體產生強烈的毒副作用，而無法有效實現藥物對腫瘤的殺傷效果。因此，發展 一種具有腫瘤靶向作用的載體材料實現藥物的負載、可控釋放與靶向治療是目前納米醫學 的研究熱點。粘土類納米顆粒，如鋰阜石（Laponite, LAP),不僅具有良好的生物相容性，還 能夠高效負載藥物并實現藥物的控制釋放，在藥物輸送領域展現了獨特的優勢。但是負載 藥物之后，鋰皂石納米顆粒在水中的膠體穩定性下降，而且無法主動識別并富集到腫瘤細 胞，因此，將靶向分子連接到其表面得到具有主動靶向效果的多功能鋰皂石納米顆粒，是改 善抗腫瘤藥物載體性能的有效途徑。
[0003] 聚乙二醇（PEG)是一種具有良好生物相容性的鏈狀聚合物，修飾到納米材料表面 能夠顯著提高其在水中的穩定性。葉酸（Folic Acid，FA)是一種小分子水溶性維生素，對 維持腫瘤細胞過度活躍的新陳代謝作用有重要。葉酸受體在大部分腫瘤細胞表面均存在 過量表達，而在正常細胞表面表達量很少。因此，如果將靶向分子FA鏈接到PEG末端得到 PEG-FA，然后再修飾到鋰皂石表面，不僅可以利用PEG分子鏈的修飾提高材料的穩定性，降 低毒性，延長納米顆粒在體內的循環時間，減少藥物在到達腫瘤部位之前的代謝消耗，還能 夠通過FA分子與腫瘤細胞表面FA受體的特異性結合實現載體對腫瘤細胞的特異性識別與 主動富集，實現腫瘤的靶向治療。
[0004] 查閱相關文獻可以發現，合成聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒作為 藥物載體用于抗腫瘤藥物輸送與腫瘤靶向治療的研究尚未見報道。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納 米顆粒及其制備和應用。所涉及的制備過程簡單，條件溫和。本發明的LM-PEG-FA/D0X能 夠有效控制D0X的釋放，對高葉酸受體表達的腫瘤細胞具有明顯的靶向性和抑制效果，在 腫瘤治療領域具有廣泛的應用前景。
[0006] 本發明的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒，氨基化鋰皂石 為（3-氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷APMES修飾的鋰皂石；聚乙二醇與葉酸的摩爾比為 1 : 0.4-1 : 0.8;聚乙二醇-葉酸的質量分數在45-55%。本發明的一種聚乙二醇-葉酸 修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒用于抗腫瘤藥物D0X的負載，聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化 鋰皂石納米顆粒LM-PEG-FA和阿霉素鹽酸鹽D0X的質量比為2 : 1-4 : 1，在此條件下D0X 的負載效率為85-91% ·
[0007] -種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的制備方法，包括下述步驟：
[0008] (1)將葉酸溶解在溶劑中，加入1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，攪 拌4-6h，得到混合溶液，然后逐滴加入聚乙二醇的溶液中，攪拌反應2-4d，透析，冷凍干燥， 得到聚乙二醇-葉酸；其中碳二亞胺鹽酸鹽與葉酸的摩爾比為13 : 1-16 : 1，投入的葉酸 與聚乙二醇的摩爾比為1 : 1-1 : 2;
[0009] (2)向聚乙二醇-葉酸PEG-FA的溶液加入1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺 鹽酸鹽EDC，攪拌2-4h，得到混合溶液，然后逐滴加入氨基化鋰皂石納米顆粒LM-NH 2的水溶 液中，攪拌反應2-4d，透析，得到聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒LM-PEG-FA ; 其中投入的碳二亞胺鹽酸鹽與葉酸的摩爾比為10 : 1-12 : 1，投入的聚乙二醇-葉酸與氨 基化鋰皂石納米顆粒的質量比為0.5 : 1-0. 6 : 1。
[0010] 所述步驟（1)中的溶劑為二甲基亞砜DMS0,步驟（1)中所述的聚乙二醇PEG的溶 液溶劑和步驟（2)中聚乙二醇-葉酸的溶液溶劑為二甲基亞砜DMS0。
[0011] 所述步驟（1)中的聚乙二醇PEG為NH2-PEG-C00H，分子量大小為2000。
[0012] 所述步驟⑴中的FA溶液濃度為5-8mg/mL。
[0013] 所述步驟⑴中得到的PEG-FA中PEG和FA的摩爾比為1 : 0.4-1 : 0.8。
[0014] 所述步驟（2)中的氨基化鋰皂石納米顆粒LM_NH2為（3-氨基丙基）二甲基乙氧 基硅烷APMES修飾的鋰皂石LAP。
[0015] 所述步驟（2)中的氨基化鋰皂石納米顆粒LM-NH2的水溶液濃度為6-8mg/mL。
[0016] 所述步驟（2)中所得到的LM-PEG-FA中，PEG-FA的質量分數在45-55 %。
[0017] 所述步驟（1)和步驟（2)中的攪拌為磁力攪拌，攪拌速度為100-150r/min。
[0018] 所述步驟⑴和步驟（2)中的透析為純水透析，透析袋截留分子量大小為 8000-14000,透析時間為 2-4d。
[0019] 所述步驟⑴和步驟⑵中的反應條件為避光反應。
[0020] 本發明的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的應用，將聚乙二 醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒LM-PEG-FA水溶液加入阿霉素鹽酸鹽水溶液，攪拌 12-24h，離心，洗滌并分散，得到負載阿霉素鹽酸鹽的聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂 石納米顆粒LM-PEG-FA/D0X，其中LM-PEG-FA和D0X的質量比為2 : 1-4 : 1。
[0021] 所述聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒LM-PEG-FA水溶液的濃度為 2-6mg/mL，阿霉素鹽酸鹽的水溶液濃度為l-2mg/mL。
[0022] 所述攪拌為磁力攪拌，攪拌速度為100_150r/min ;離心的速率為8000-10000r/ min,離心的時間為5min。
[0023] 所得到的LM-PEG-FA/D0X中，LM-PEG-FA納米顆粒對D0X的負載效率為85-91 %。
[0024] 鋰阜石（Laponite，LAP)屬于粘土類納米顆粒，具有良好的生物相容性，并且被證 實可以高效負載藥物，是一種具有廣泛應用前景的藥物載體。LAP經過修飾可以得到表面 氨基化的鋰皂石納米顆粒LM-NH 2，它繼承了 LAP作為藥物載體的全部優良性質，并且便于進 一步修飾。然而，LM-NH2本身沒有對腫瘤的主動靶向效果，因此，將靶向分子連接到lm-nh 2 表面，得到具有主動靶向效果的多功能鋰皂石納米顆粒用于藥物負載，是改善抗腫瘤藥物 載體LM-NH2的有效途徑。本發明將PEG-FA連接到LM-NH 2表面，得到的LM-PEG-FA不僅可 以通過葉酸的靶向作用被腫瘤細胞主動攝取，同時引入的長鏈聚合物PEG可以延長載體在 體內循環時間，降低材料毒性，提高材料穩定性，改善藥物釋放特性，并且還可以有效減少 FA與FA受體結合時的空間位阻，提高LM-PEG-FA/DOX與高葉酸受體表達的腫瘤細胞的親和 力。本發明的LM-PEG-FA載體用于抗腫瘤藥物負載，對高葉酸受體表達的腫瘤細胞具有良 好的靶向效果，可作為理想的靶向納米載體，實現藥物、基因或診斷分子探針的負載與靶向 輸送。
[0025] 本發明使用紫外-可見光分光光度計、1Η核磁分析、熱重分析、Zeta電勢測量、紫 外-可見光譜測試等方法表征本發明制備的靶向修飾的鋰皂石納米顆粒，同時用刃天青還 原法、流式細胞術分析和激光共聚焦顯微鏡來檢驗載藥的鋰皂石納米顆粒對表面葉酸受體 高表達的人卵巢癌細胞（SK-0V-3細胞）的毒性與靶向性。具體測試結果如下：
[0026] (1)表面電勢和水合粒徑測量
[0027] 修飾前后粒子的粒徑以及表面電勢均通過動態光散射進行測定，結果如表1所 示。經硅烷偶聯劑修飾后，鋰皂石的表面電勢從-37. 9mV變到-2. 4mV，這是由于APMES帶 正電荷，修飾到LAP表面后可以屏蔽LAP表面的部分負電荷，導致了材料表面電勢的變化。 在表面進一步修飾了 mPEG之后，所得到的LM-mPEG表面電勢降低到-5. 34±2. 20mV。在 修飾了 PEG-FA之后，表面電勢進一步降低到-7. 74±0. 73mV。因此，通過修飾前后的電勢 變化也可以證明氨基化鋰皂石表面已成功修飾了 mPEG和PEG-FA。另一方面，由于所修飾 的mPEG和PEG-FA具有較大的空間位阻，得到的LM-mPEG和LM-PEG-FA的顆粒粒徑分別為 153. 8±4. 6nm 和 242. 8±10. 2nm，較 LM-NH2(76. 6±4. 5nm)有了較大幅度的增長。顆粒粒 徑的變化也證明了 mPEG和PEG-FA可以成功的修飾到氨基化鋰皂石表面。另外，表面修飾 后鋰皂石的較小且具有較好的分散性，因此，仍是一種良好的載體材料。
[0028] 表 1 LAP、LM-NH2、LM-mPEG、LM-PEG-FA 的水合直徑和表面電勢
[0029]
【權利要求】
1. 一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒，其特征在于：所述的氨基化鋰 皂石納米顆粒為（3-氨基丙基）二甲基乙氧基硅烷修飾的鋰皂石；聚乙二醇-葉酸的質量 分數在45-55%，聚乙二醇與葉酸的摩爾比為1 : 0.4-1 : 0.8。
2. -種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的制備方法，包括下述步驟： (1) 將葉酸溶解在溶劑中，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，攪拌 4_6h，得到混合溶液，然后逐滴加入聚乙二醇的溶液中，攪拌反應2-4d，透析，冷凍干燥，得 到聚乙二醇-葉酸；其中碳二亞胺鹽酸鹽與葉酸的摩爾比為13 : 1-16 : 1，投入的葉酸與 聚乙二醇的摩爾比為1 : 1-1 : 2; (2) 向聚乙二醇-葉酸PEG-FA的溶液加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽 酸鹽EDC，攪拌2-4h，得到混合溶液，然后逐滴加入氨基化鋰皂石納米顆粒LM-NH2的水溶液 中，攪拌反應2-4d，透析，得到聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒LM-PEG-FA ;其 中投入的碳二亞胺鹽酸鹽與葉酸的摩爾比為10 : 1-12 : 1，投入的聚乙二醇-葉酸與氨基 化鋰皂石納米顆粒的質量比為0.5 : 1-0.6 : 1。
3. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的制備方 法，其特征在于：步驟（1)中所述的溶劑為二甲基亞砜DMSO,步驟（1)中所述的聚乙二醇的 溶液和步驟（2)中聚乙二醇-葉酸的溶液溶劑為二甲基亞砜DMSO。
4. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的制備方 法，其特征在于：步驟（1)中葉酸溶液濃度為5-8mg/mL。
5. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的制備方 法，其特征在于：步驟（2)中氨基化鋰阜石納米顆粒的水溶液濃度為6-8mg/mL。
6. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的制備 方法，其特征在于：步驟（1)和步驟（2)中所述的攪拌為磁力攪拌，攪拌速度為100-1501·/ min〇
7. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的制備 方法，其特征在于：步驟（1)和步驟（2)中所述的透析為純水透析，透析袋截留分子量為 8000-14000,透析時間為 2-4d。
8. 根據權利要求2所述的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的制備方 法，其特征在于：步驟（1)和步驟（2)中所述的反應條件為避光反應。
9. 根據權利要求1所述的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的應用， 其特征在于：將聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒水溶液加入阿霉素鹽酸鹽水 溶液，攪拌12-24h，離心，洗滌并分散，得到負載阿霉素鹽酸鹽的聚乙二醇-葉酸修飾的氨 基化鋰皂石納米顆粒，其中聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒和阿霉素鹽酸鹽 的質量比為2 : 1-4 : 1。
10. 根據權利要求9所示的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒的應用， 其特征在于：所述聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒水溶液的濃度為2-6mg/ mL，阿霉素鹽酸鹽的水溶液濃度為l-2mg/mL。
11. 根據權利要求9所示的一種聚乙二醇-葉酸修飾的氨基化鋰皂石納米顆粒 的應用，其特征在于：所述攪拌為磁力攪拌，攪拌速度為100_150r/min ;離心的速率為 8000-10000r/min，離心的時間為 5min。
【文檔編號】A61K9/14GK104147608SQ201410337210
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月16日 優先權日:2014年7月16日
【發明者】史向陽, 吳一倫, 郭睿 申請人:東華大學